Abstract
Innledning
Arvelighet er beregnet til å forårsake minst 20% av tykk- og endetarmskreft. Den arvelige nonpolyposis tykktarmskreft undergruppe er delt inn i Lynch syndrom og familiær kolorektal kreft typen X (FCCTX) basert på tilstedeværelse av mismatch reparasjon (MMR) gen defekter.
Formål
Vi adressert genuttrykket signaturer i kolorektal kreft knyttet til Lynch syndrom og FCCTX med sikte på å identifisere kandidat gener og å kartlegge signalveier relevante i arvelig tykktarmskreftutvikling.
Eksperimentell design
18 k hel-genom c- DNA-mediert gløding, utvalg, forlengelse, og ligering (WG-DASL) analysen ble brukt til 123 kolorektal kreft, inkludert 39 Lynch syndrom svulster og 37 FCCTX svulster. Målgener var teknisk validert ved hjelp av sanntids kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) og uttrykket signaturen ble validert i uavhengige datasett.
Resultater
kolorektal kreft knyttet til Lynch syndrom og FCCTX viste distinkte genuttrykk profiler, som av betydning analyse av mikromatriser (SAM) varierte på bakgrunn av 2188 gener. Funksjonelle trasé involvert var knyttet til G-proteinkoblet reseptor signalisering, oksidativ fosforylering, og cellesyklus funksjon og mitose. QRT-PCR bekreftet endret uttrykk av utvalgte gener
NDUFA9, AXIN2, MYC, DNA2 Hotell og
H2AFZ
. Bruk av 2188-genet signatur til uavhengige datasett viste sterk korrelasjon til MMR status.
Konklusjon
Klare genetiske profiler og deregulering av ulike kanoniske trasé gjelder Lynch syndrom og FCCTX og viktige mål her, kan være aktuelt å forfølge for raffinerte diagnostiske og terapeutiske strategier i arvelig tykktarmskreft
Citation. Dominguez-Valentin M, Therkildsen C, Veerla S, Jönsson M, Bernstein jeg, Borg å, et al. (2013) Tydelig genekspresjonssignaturer i Lynch syndrom og Familiær tykktarmskreft Type X. PLoS ONE åtte (8): e71755. doi: 10,1371 /journal.pone.0071755
Redaktør: Ramon Andrade de Mello, Det medisinske fakultet, Universitetet i Porto, Portugal
mottatt: 29 april 2013; Godkjent: 02.07.2013; Publisert: 12. august 2013
Copyright: © 2013 Dominguez-Valentin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Den danske og den svenske Cancer Funds, fra det svenske Vetenskapsrådet, Lundbeck foundation, den Nilsson Cancer Fund, Kamprad Cancer Fund og Hvidovre universitetssykehus, Danmark. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Arv er en viktig risikofaktor for tykktarmskreft. Identifisering av enkeltpersoner og familier med økt risiko gir mulighet for målrettet overvåking, noe som har vist seg å redusere sykelighet og dødelighet av tykk- og endetarmskreft [1], [2]. Arvelig nonpolyposis tykktarmskreft (HNPCC) står for 3-6% av tykk- og endetarmskreft. Syndromet er klinisk klassifisert i henhold til Amsterdam kriterier, som krever minst tre HNPCC-assosiert kreft, to berørte førstegradsslektninger og minst én person diagnostisert før fylte 50 [3], [4]. Mellom en tredel og halvparten av familiene som oppfyller Amsterdam kriteriene bære kimcellelinje mismatch reparasjon (MMR) genmutasjoner i
MLH1, MSH2, MSH6
eller
PMS2 Hotell og omtales som å ha Lynch syndrom [5] – [7]. De resterende familier med en ennå uidentifisert genetisk bakgrunn viser en overvekt av tykktarmskreft, hyppige synkrone og metachronous adenomatøse polypper og få extracolonic svulster og er referert til som familiær kolorektal kreft typen X (FCCTX) [8], [9]. Sammenlignet med Lynch syndrom, kolorektal kreft knyttet til FCCTX utvikles senere, hovedsakelig forekommer i den distale colon og mindre ofte viser den karakteristiske morfologiske egenskaper tumor-infiltrerende lymfocytter, dårlig differensiering og slimstoffproduksjon karakteristisk for Lynch syndrom tumorer [8], [10], [11].
data om de genetiske egenskaper og tumorigene veier av FCCTX er mangelvare om genomisk studier har vist gjennomsnitts 6-8 kopitall endringer med tilbakevendende gevinster på 7p, 7q, 8Q, 13q, 20 p og 20Q og tap av 17p, 18p og 18q [9], [12], [13]. To studier har adressert genuttrykk profiler og mutasjon mønstre i FCCTX svulster og har beskrevet likheter mellom FCCTX og sporadiske MMR stabile svulster [14], [15]. I sporadisk kolorektal kreft, MMR defekte svulster viser tydelige genekspresjonsprofiler med oppregulering av immunmodulerende gener, slik som anstand, cytokiner og cytotoksiske mediatorer, varmesjokkgener, hovedhistokompatibilitetskompleks gener og apoptose-relaterte gener [16] – [18] . Vi søkte global genekspresjon profilering for å avgrense kandidat gener og differensial involvering av trasé innenfor HNPCC undergruppe av arvelig tykktarmskreft med sammenligning mellom tykktarmskreft knyttet til Lynch syndrom og FCCTX.
Materialer og Metoder
Etikk erklæringen
prosjektet ble etisk vurdering i København, der en waiver for innsamling av vev og kliniske data ble gitt. Alle pasienter gitt et informert samtykke for inkludering i den danske HNPCC registeret i løpet av genetisk veiledning økter. Etisk godkjenning for studien ble gitt fra vitenskapelig og etisk komité i Region Hovedstaden København, Danmark (HD-2007-0032).
Prøvevalg og RNA Utvinning
Den nasjonale danske HNPCC registeret ble brukt til å identifisere kolorektal kreft fra personer med Lynch syndrom og FCCTX. Lynch syndrom ble definert som familier /personer med sykdoms predisponerende kimcellelinje MMR genmutasjoner (n = 16 i
MLH1
, n = 13 i
MSH2 Hotell og n = 10 i
MSH6
). Immunhistokjemisk farging MMR protein og mikro ustabilitet (MSI) analyser ble utført som tidligere beskrevet [11], [13]. FCCTX svulster ble definert som svulster som utvikles i familier som oppfyller Amsterdam kriterier, men viste ingen sykdoms predisponerende MMR genmutasjoner og hadde beholdt MMR-funksjonen. Sporadiske kolorektal kreft ble valgt til å representere MMR mangelfulle og MMR dyktige svulster fra personer uten familiehistorie med kreft. Kliniske data er oppsummert i tabell 1. Sammenlignet med Lynch syndrom svulster, FCCTX svulster var oftere ligger i venstre side av tykktarmen (p 0,00001, Fishers eksakte test) og viste høy eller moderat differensiering (p 0,00001, Fishers eksakte test ). Lynch syndrom og FCCTX skilte seg ikke når det gjelder debutalder (gjennomsnittlig 53 år versus 58 år) eller tumorstadium.
Ikke-nekrotiske svulst områder ble makro dissekert og RNA ekstraksjon ble gjennomført fra tre 5 –
μ
m deler av parafin-embedded svulstvev [11], [13] med høy Pure RNA parafin Kit (Roche, Castle Hill, Australia) i henhold til produsentens instruksjoner. RNA-konsentrasjonen ble bestemt ved hjelp av en Nanodrop spektrofotometer (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE) og prøver som gir tilstrekkelig RNA (200 ng) med 260/280 forholdstall . 1.8 ble valgt
Gene Expression Profilering
genuttrykk analysene ble utført ved SCIBLU Genomics Centre, Universitetet i Lund, Sverige. Den Illumina Bead-array (HumanWG-6 v4 Expression Beadchip, Illumina) systemet ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner. Kort fortalt ble total RNA konvertert til cDNA ved hjelp av biotinylert oligo-dT
18 og tilfeldig nonamer primere. To assay-spesifikke oligonukleotider ble utformet for å avhøre en enkelt, sammenhengende 50 nt sekvens på hver cDNA. Hver av disse oligonukleotider besto av to deler: en oppstrøms-spesifikk oligonukleotid (USO) inneholdende en 3′-gen-spesifikke sekvens og en 5 «universell PCR-primer sekvens (P1), mens den nedstrøms-spesifikke oligonukleotid (DSO) inneholdt en 5»- gen-spesifikk sekvens og en annen 3 «universal PCR-primer sekvens (P2). Ved bruk av denne tilnærmingen, totalt 24,526 oligonukleotid parene (prober) ble utformet og slått sammen, som sammen utgjorde hele genomet (WG) DASL assay basseng (DAP), tilsvarende 18,626 unike gener, basert på brønn-kommenterte innhold som er avledet fra National Senter for Bioteknologi Information (NCBI) Annonse Sequence Database (Build 36.2, versjon 22). DAP ble deretter hybridisert til den målrettede cDNA, etterfulgt av enzymatisk forlengelse og ligeringstrinn som tidligere beskrevet [19]. Ligerte produkter ble PCR-amplifisert og merket med en universell Cy3-coupled primer etter som enkelt-strandet merkede produkter ble utfelt og hybridisert til WG genuttrykk BeadChips som tidligere beskrevet [20]. BeadChips ble deretter skannet på en BeadArray ™ Reader ved hjelp BeadScan programvare (v4.2), der fluorescensstyrkene ble lest og bilder hentet.
Data Analysis
Expression data ble lastet opp og behandlet i GenomeStudio programvare (Illumina, San Diego, California). Data ble normalisert ved hjelp av bakgrunnskorreksjon, kubisk spline metoden [21] og plate skalering. RefSeq funksjoner med en deteksjons
P
verdien av ≤0.01 i minst 80% av prøvene ble brukt, forlater 9,218 funksjoner for videre analyse. Dataene ble lastet inn MeV v4 [22] hvor de ble log2 transformert og median-sentrert over analyser. Unsupervised clustering ble utført på den totale sett av CRC prøver ved hjelp av gjennomsnittlig kobling clustering med en Pearson korrelasjon som likhet beregning. Betydningen analyse av mikromatriser (SAM) [23] ble brukt til å identifisere vesentlig forskjellig uttrykt gener med en falsk-funnrate (FDR)
≤
5% [24]. Genuttrykk data er tilgjengelige i NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) (Tiltredelse antall GSE36335). Biologiske trasé ble identifisert ved hjelp av web-baserte DAVID programvare med en FDR
≤
5% [25].
Real Time Kvantitativ Reverse Transcription PCR (QRT-PCR)
QRT-PCR ble brukt til teknisk validere økt /redusert uttrykk av 5 kreftrelaterte gener med differensial uttrykk mellom de 4 kolorektal kreft undergrupper. Genene ble valgt til å representere store deregulerte trasé og uttrykk nivåer ble undersøkt i 3 prøver fra hver subtype.
rRNA18S
ble brukt som intern referanse genet og normal kolon prøven som en kalibrator. Genspesifikke primere og Taqman probe-sett for hvert gen ble oppnådd fra Applied Biosystems (Applied Biosystems, Foster City, CA). Revers transkripsjon og PCR ble utført ved hjelp Quantitect revers transkripsjon kit og sonde PCR kit, henholdsvis (Qiagen, Heidelberg, Tyskland).
Validering i eksterne data
Den arvelige genekspresjon signaturen ble validert ved hjelp av GSE4554 datasett og de fire største partier av Kreft Genome Atlas Network (TCGA) RNAseqv2 [26], [27]. For å likne microarray data, de RPKM verdier av TCGA var quantile-normalisert, en forskyvning på 32 ble tilsatt, begrenset oppad til 65 000, og gener ble sentrert. Deretter dataene ble justert for batch variabelen. Alle data ble importert til MeV v4, log2 forvandlet, gener var median-sentrert over analyser og 50% minste varierende gener ble fjernet. Unsupervised hierarkisk clustering ble utført som beskrevet ovenfor. En genekspresjon sentroiden ble konstruert ved å ta gjennomsnittet av ekspresjons-verdiene for prøvene i Lynch syndrom og FCCTX for hvert gen for å etablere en signatur for klassifiserings nærmest sentroiden klassifisering. En prøve fra de eksterne datasett ble tildelt en av de to arvelige undergrupper basert på maksimal Pearson korrelasjon av sin Tyngdepunktet uttrykk til de arvelige tyngdepunktverdier.
Statistical Analysis
Klinisk forening (tumor plassering , differensiering, debutalder og scene) i Lynch syndrom og FCCTX ble bestemt ved bruk av Fishers eksakte test (med betydning satt for
P
0,05). De statistiske analysene ble utført ved hjelp av statistisk programvare pakken IBM SPSS statistikk 20 (SPSS, Chicago, IL, USA).
Resultater
Unsupervised hierarkisk clustering analyse i hele serien (inkludert 39 Lynch syndrom svulster, 37 FCCTX svulster, 21 sporadiske MMR dyktige svulster og 26 sporadiske MMR mangel svulster) identifiserte to viktige undergrupper knyttet til MMR status (Figur S1). Den iboende MMR signaturen var sterk med 3873 differensielt uttrykte gener, hvorav 2159 (56%) var oppregulert i MMR defekte svulster og var relatert til 5 signalveier (tabell S1).
I arvelig svulst undergruppe, SAM analyse identifisert 2188 differensielt uttrykte gener mellom FCCTX og Lynch syndrom tumorer (figur 1). I FCCTX tumorer, G-proteinkoblet signalveien var oppregulert (FDR = 0,6%), mens Lynch syndrom svulster viste opp-regulering av 2 veier relatert til cellesyklusen og mitose (FDR = 1,4%) og oksidativ fosforylering (FDR = 3,5%) (tabell 2).
figuren viser topp-360 differensielt uttrykte gener. Prøver blir arrangert langs x-aksen og show FCCTX svulster (grønn) og Lynch syndrom svulster (blå).
genuttrykket profiler av FCCTX svulster ble nært knyttet til de som er i sporadisk MMR dyktigere kolorektal kreft med gener som er involvert i peptidyl-aminosyre- modifikasjon, enzymbundet reseptor-protein signalisering og vekstregulering. Likeledes, Lynch syndrom og sporadiske MMR defekte tumorer delt gener som er involvert i cellesyklusprogresjon og immunrespons. Sammenligning mellom FCCTX og sporadiske MMR dyktige svulster avslørt 4 differensielt uttrykte gener, mens sammenligning mellom FCCTX og sporadiske MMR mangel svulster identifiserte 3906 differensielt uttrykte gener. Lynch syndrom svulster avvek fra sporadiske MMR stabile svulster ved 415 differensielt uttrykte gener og fra sporadiske MMR mangel svulster ved 91 gener. Blant sporadiske svulster, 1384 gener skilte MMR dyktige og mangelfulle svulster.
De genetiske profiler ble validert i uavhengige datasett, dvs. GSE4554 (Affymetrix microarray) og TCGA (RNA sekvensering) [26], [27]. Begge datasett består i hovedsak av sporadiske kolorektale saker, herunder 51 MMR stabile svulster og 33 MMR defekte svulster i GSE4554 datasettet og 91 MMR stabil, 19 MMR defekte og 28 MMR-lave stabile svulster i TCGA datasettet. Unsupervised hierarkisk clustering basert på våre 2188-genet signatur identifisert av oss, resulterte i to store grupper relatert til MMR status. Den arvelige signatur riktig klassifisert 82% og 80% av MMR stabile svulster som FCCTX og 100% og 94% av MMR defekte svulster som Lynch syndrom, henholdsvis (figur 2).
a) Clustering basert på GSE4554 og b) Clustering basert på de fire største partier av de TCGA RNAseqv2 datasett. MMR dyktige tumorer (grønn), mikro-lav tumorer (blå) og MMR mangel tumorer (rød) langs x-aksen.
QRT-PCR-basert teknisk validering ble utført ved hjelp av fem kreftrelatert gener som representerer deregulerte trasé observert i MMR stabile og mangelfulle svulster, henholdsvis (figur 3). Resultatene bekreftet økt uttrykk av
MYC Hotell og
AXIN2
i FCCTX svulster, redusert uttrykk for
NDUFA9
i FCCTX svulster og i sporadiske MMR dyktige svulster og økt uttrykk av
H2AFZ
i MMR mangel svulster. Det ble ikke observert store forskjeller for
DNA2
.
Differensial uttrykk for
MYC, NDUFA9
,
H2AFZ
,
AXIN2
, og
DNA2
ble gjort for 12 representative utvalg (3 fra hver gruppe) og QRT-PCR forholdstall ble normalisert til rRNA18S og median sentrert.
Diskusjoner
Innenfor HNPCC undergruppe av arvelig tykktarmskreft, viste vi forsjellige genekspresjonssignaturer i FCCTX og Lynch syndrom svulster, som skiller seg fra 2188 gener. Basert på disse genekspresjon forskjellene våre data at MMR status sterkt påvirker genetiske signaturer, også innenfor fenotypisk lignende familier, som er i overensstemmelse med tidligere studier på sporadiske kolorektal kreft [16] – [18], [27], [36] . De FCCTX og Lynch syndrom profiler skilte seg i 3 store kreftrelaterte pathways, først og fremst knyttet til cellecyklusprogresjonen andmitosis, oksidativ fosforylering og G-protein koblet reseptor signalisering, som er korrelert til tykktarmskreftutvikling [18], [28], [29] [36].
FCCTX svulster viste oppregulering av 1059 gener, flere (n = 16) som ble knyttet til G-proteinkoblet reseptor pathway (tabell 2). En kandidat mål omfatter her
Gnas
genet som koder for G
α-subenheten, og ligger i 20q13.32 regionen som har vist seg å være vunnet i FCCTX svulster [9], [12], [13]. Aktivering mutasjoner i
Gnas
er beskrevet i CRC og er foreslått for å fremme tumorigenesis gjennom aktivering av Wnt og ERK1 /2 MAPK signalveier [28], [29]. Potensialet tumorigent mekanismen er ukjent og hot-spot mutasjon
Gnas
c.601G T har ikke blitt observert i FCCTX svulster [12]. Også andre kandidatgener involvert i spredning og migrasjon, f.eks
CDH26, SRC Hotell og
ASIP
ligger i 20Q [30], [31]. De FCCTX svulster viste også oppregulering av
PTGER1, etter som koder for den EP1-reseptoren som kan fremme spredning og kolorektal tumor utvikling gjennom forandret funksjon av prostaglandin E2 (PGE
2) [32] – [34 ].
Lynch syndrom svulster viste oppregulering av 1129 gener, f.eks gener involvert i G
1 /S-overgangen (
CCNE
,
CCNU
,
E2F2 Hotell og
CDK2
), replikering DNA (
CDC45
,
RPA1
,
RFC5
,
MCM4 Hotell og
POLD3
) og kromosom organisasjon og mitose (
CCNB2
,
MLF1IP
,
CASC5
,
KIF2C Hotell og
PLK4
), som er i tråd med tidligere funn (tabell 2) [16], [18], [35], [36]. Oppregulering av f.eks
WEE1
,
CDKN1A Hotell og
FANCD2
ble også observert i vår studie, og har også blitt rapportert av andre forskere, som kan foreslå involvering av cellesyklus sjekkpunkt maskiner [37 ], [38]. Overekspresjon av sjekkpunkt proteiner har tidligere vært knyttet til Lynch syndrom og oppheving av sjekkpunktet maskiner har vist seg å sensibilisere MMR manglende tumorceller overfor kjemoterapi, [39], [40]. Også gener som er involvert i den oksydative fosforylering vei, f.eks ATP syntase subenhetgenene og kompleks I og III subenhetgenene var blant dem oppregulert i Lynch syndrom svulster. Nedregulering av ATP-syntetase subnit gener og kompleks I, har III og V gener blitt korrelert til metastastic kolorektal kreft, og kan forklare den mer aggressive tumorutvikling og dårlig prognose observert i MMR dyktige tumorer [11], [18], [41] .
i tykktarmskreft, er MMR status en viktig diskriminator relatert til forsjellige genuttrykk profiler, som er støttet av de 3873 differensielt uttrykte gener i vår serie av MMR mangelfulle og dyktige svulster [15], [16] , [27]. Betydningen av MMR status ble også observert da vi søkte på 2188-genet signatur som diskrimineres mellom Lynch syndrom og FCCTX til to uavhengige datasett hovedsakelig inneholder sporadiske svulster. Signaturen riktig definert 80-82% av MMR dyktig og 94-100% av MMR mangel tumorer (figur 2). Flere varmesjokkproteiner og immunresponsgener (tabell S1) ble oppregulert i MMR defekte tumorer, som støtter involvering av immun-responsmekanismer, uavhengig av hvorvidt tumoren var forårsaket av kimlinje eller somatiske MMR-geninaktivering [16] – [ ,,,0],18], [42], [43]. I sporadiske samt arvelige MMR dyktige svulster flere gener i
Wnt
signaliserer ble oppregulert, noe som passer godt med sin sentrale rolle i kolorektal tumorigenesis (tabell S1) [44], [45].
I konklusjonen, arvelige kolorektal kreft innenfor HNPCC undergruppe showet distict genetiske profiler med 2188 differensielt uttrykte gener mellom Lynch syndrom og FCCTX. Disse dataene finne gener og stier som er relevante for videre arbeide for raffinerte diagnostikk og terapi i arvelig tykktarmskreft.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Unsupervised hierarkisk clustering av hele datasettet. Den dendogram viser spontan clustering av 123 kolorektal kreft i to store klynger knyttet til MMR status. MMR dyktige tumorer (grønn), inkludert FCCTX svulster og sporadiske MMR dyktige svulster og MMR mangel tumorer (blå), inkludert Lynch syndrom svulster og sporadiske MMR mangel svulster
doi:. 10,1371 /journal.pone.0071755.s001
(TIF)
Tabell S1.
signalveier oppregulert i MMR dyktige og MMR mangel svulster
doi:. 10,1371 /journal.pone.0071755.s002 plakater (XLS)
Takk
takker Eva Rambech og Martin Lauss, Avdeling for kreftbehandling, Institute of Clinical Sciences, Universitetet i Lund og Anja Nissen, Clinical Research Centre, København universitetssykehus, Hvidovre for teknisk hjelp og bistand og Sabrina Da Silva, Institutt for indremedisin og onkologi, Sir Mortimer B Davis-jødisk General Hospital, McGill University, Montreal, Canada for statistisk støtte.
