Abstract
Mål
Hemoglobin (Hgb) er den viktigste oksygen og karbondioksid bærer i celler i erytroide avstamning og er ansvarlig for oksygentilførsel til de pustende vev i kroppen. Imidlertid er Hgb også uttrykt i nonerythroid celler. I denne studien, ble uttrykket av Hgb i menneskelig livmor livmorhalsen carcinoma celler og dens rolle i livmorhalskreft undersøkes.
Metodikk
Uttrykket nivået av Hgb i livmorhalskreft vev ble vurdert ved kvantitativ revers transkriptase-PCR (QRT-PCR). Vi har anvendt flere metoder, så som RT-PCR, immunoblotting, og immunhistokjemisk analyse, for å bekrefte Hgb ekspresjon i cervikale kreftceller. Virkningene av ektopisk ekspresjon av Hgb og Hgb mutanter på oksidativt stress og cellelevedyktigheten ble undersøkt ved cellulære reaktive oksygenarter (ROS) analyse og laktat-dehydrogenase (LDH) matrise, respektivt. Begge Annexin V-farging assay ved strømningscytometri og caspase-3-aktivitetsanalyse ble benyttet, henholdsvis, for å evaluere celle apoptose.
Resultatene
QRT-PCR-analyse viste at Hgb-α- (HBA1) og Hgb-β-globin (HBB) genekspresjon var signifikant høyere i livmorhalskreft enn i normalt vev i livmorhalsen, mens ekspresjon av hematopoetiske transkripsjonsfaktorer og erytrocytt spesifikke markørgener ikke ble økt. Immunfarging eksperimenter bekreftet ekspresjon av Hgb i kreftcellene i livmorhalsen. Hgb mRNA og protein ble også funnet i humane livmorhalskreft cellelinjer Siha og CaSki, og Hgb uttrykk ble oppregulert med hydrogen peroxide-induced oxidative stress. Viktigere, ektopisk uttrykk for villtype HBA1 /HBB eller HBA1, snarere enn mutanter HBA1
H88R /HBB
H93R ikke binde hemo, undertrykt oksidativt stress og forbedret celle levedyktighet.
Konklusjoner
de foreliggende funn viser for første gang at Hgb er uttrykt i livmorkreft celler og kan fungere som en antioksidant, demping av oksidativt stress-indusert skade i livmorhalskreftceller. Disse dataene gir en betydelig innvirkning ikke bare i globin biologi, men også i forståelsen av livmorhalskreft patogenesen assosiert med oksidativt stress
Citation. Li X, Wu Z, Wang Y, Mei Q, Fu X, Han W ( 2013) Karakterisering av Adult α- og β-globin Forhøyet av Hydrogenperoksid i livmorhalskreftceller som spiller en celle~~POS=TRUNC rolle mot oksidativt Fornærmelser. PLoS ONE 8 (1): e54342. doi: 10,1371 /journal.pone.0054342
Redaktør: Russell O. Pieper, Universitetet i California-San Francisco, USA
mottatt: 9 juli 2012; Akseptert: 12. desember 2012; Publisert: 17 januar 2013
Copyright: © 2013 Li et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av tilskuddene fra Natural Science Foundation National of China (nettsiden er https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default 124.htm) (No. 31201033, 31270820, 81230061 og 81001184) og ble delvis støttet av tilskudd fra National Basic Science and Development Programme of China (nettsiden er https://www.973.gov.cn/Default_3.aspx) (No. 2012CB518103 og 2012CB518105). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Hemoglobin (Hgb), den store heme-proteinet av erytrocytter, letter transporten av oksygen og karbondioksyd i blod. Den Hgb molekylet er en samling av fire globular protein subenheter. HgbA, den vanligste typen av Hgb i voksne mennesker, er en tetramer består av to hemeinneholdende a- og p-subenheter som holdes sammen av ikke-kovalente interaksjoner (α
2β
2) [1], [2] . Andre virveldyr hemeinneholdende proteiner med strukturell homologi med globin kjedene myoglobin, som er mye finnes i virveldyr hjerter og tverrstripet og glatt muskulatur [3], cytoglobin, for det meste er beskrevet i bindevev [4], og neuroglobin, bredt uttrykt i hjernen [ ,,,0],5].
felles funksjon av Hgbs som et virveldyr hoved oksygen og karbondioksid bæreren er en forholdsvis ny tilpasning i løpet av evolusjonen, er nødvendig for å sikre riktig levering av oksygen til alle cellene i kroppen via hjelp av det vaskulære nettverket . I tillegg til denne klassiske rolle, kan Hgbs utføre andre cellulære aktiviteter, inkludert intracellulær oksygentransport, oksygen sensing, NO scavenging, hydrogenperoksyd scavenging, og jern metabolisme regulering [6]. Nyere studier rapporterte oppdagelse av HGB kjeder i andre celler enn de av erythroid serien, inkludert nerveceller [7], [8], [9], netthinneceller [10], [11], alveolære epitelceller [12], [ ,,,0],13], [14], endometrium [15], rotte nyre mesangialceller [16], hepatocytter [17] og makrofager [18]. Det ble spekulert at funksjonen til Hgb i nevroner kan være oksygen lagring [9]. I alveolære epitelceller, kan hypoksi-indusert Hgb ekspresjon spiller en rolle i den oksygenføleveien [14]. Microarray analyser av MN9D dopaminerge cellelinjer stabilt transfektert med Hgb-α-globin (HBA1) og Hgb-β-globin (HBB) kjeder avdekket endringer i uttrykket av gener involvert i oksygen homeostase og mitokondriell oksidativ fosforylering [7]. Dessuten ble Hgb overekspresjon vist seg å redusere oksidativt stress, noe som tyder på at HGB virker som en antioksidant [16], [17].
oksidativt stress forårsaket av en ubalanse mellom dannelse av aktive oksygenmetabolitter og den hastighet hvilke de er spyles ved hjelp av enzymatisk og ikke-enzymatiske antioksidanter, og det har vært forbundet med patogenesen og komplikasjoner av flere sykdommer, inkludert kreft [19]. Overproduksjon eller utilstrekkelig fjernelse av reaktive oksygenarter (ROS) som for eksempel hydrogenperoksyd, hydroksylradikaler og superoksid anion er assosiert med kreft [20] og invasivitet [21]. Enzymatiske og ikke-enzymatiske antioxidant forsvarsmekanismer regulere cellulære redoks balanse og derfor patogenesen av mange sykdommer. Men vår forståelse av rollene oksidanter og antioksidanter systemer i kreftutvikling og tumor utvikling er fortsatt begrenset. Bemerkelsesverdig, viste en fersk undersøkelse at HGB fungerer som en antioksidative peroxidase, demping av hydrogenperoksid induced oxidative stress [22].
Advances in high-throughput microarray teknologi har gjort det mulig å sammenligne genuttrykk profiler mellom primære svulster og normal vev. Mikromatrisebasert genekspresjon analyser identifiserte gener HGB differensielt uttrykt i faste tumorer, inkludert brystkreft, [23], eggstokk-karsinom serøs [24], og kolorektal karsinom [25]. En fersk proteomikk studie viste at serum HBA1 og HBB nivåene var signifikant forhøyet i eggstokkreft pasienter sammenlignet med normale, friske kvinner [26]. Selv om kilden til fri Hgb i serum var ukjent, ble det antatt å være et resultat av oksidativt stress-indusert hemolyse. Mekanismene bak reguleringen av Hgb og dets funksjonelle konsekvenser i solide svulster gjenstår å fullt ut forstått.
I denne studien, viser vi at Hgb-α, voksen kjede 1 (HBA-a1), og Hgb- β, blir voksen kjede 1 (Hbb-b1) uttrykt i karsinomceller av flere typer av faste tumorer. Hgb uttrykk ble påvist i klinisk resected eksemplarer av menneskelig cervical vev og var oppregulert i livmorhalskreft vev sammenlignet med normalt vev. Videre er resultatene indikerte at oksidativt stress opp-regulerer Hgb uttrykk. Viktigere, Hgb overekspresjon redusert oksidativt stress og forbedret levedyktigheten til livmorhalskreftceller. Samlet våre resultater tyder på at Hgb kan være en del av det endogene antioksidantforsvaret, beskytter cellene mot oksidativ skade hos pasienter med livmorhalskreft.
Resultater
Økt Hgb genuttrykk i livmorhalskreft Prøver
For å undersøke differensielt uttrykte gener i livmorhalskreft, analyserte vi en tidligere utgitt microarray datasettet inkludert 33 livmorhalskreft og 24 normale prøver. Sammenlignet med normal cervix epitel, livmorhalskreft prøvene viste en signifikant økning i ekspresjonen av HBA1 og HBB gener (tabell 1). Men den uttrykk for transkripsjonsfaktorer for erytropoide differensiering [27], inkludert NFE2, KLF1 /EKLF, TAL1 /SCL og GATA1 ikke øke. I tillegg gjorde uttrykket av andre hemoglobin gener (HBD, HBE1, HBG2, HBQ1 og HBZ) og erytrocytt spesifikk markørgener, for eksempel SPTB, eRAF og ALAS2 ikke viser en betydelig økning. Disse resultatene tyder på at forhøyet HBA1 og HBB uttrykk i livmorhalskreft ikke skyldes erytropoiese, men fra en annen mekanisme.
For å validere den potensielle rolle Hgb i menneskelig livmorhalskreft, uttrykket nivåer av HBA1 og HBB ble undersøkt hos 20 livmorhalskreft prøver og 10 prøver normale livmorhalsen vev ved QRT-PCR-analyse. De spesifikke primere av HBA1 og HBB ble utformet for QRT-PCR ifølge National Center for Biotechnology Information (NCBI) database. Spesifisiteten av primerne for HBA1 og HBB amplifisering ble bekreftet ved bruk av RNA ekstrahert fra human benmarg og perifert blod som en positiv kontroll (Fig. 1A). For det første, ble RT-PCR-eksperiment utført for å bestemme uttrykket nivåer av HBA1 og HBB gener i 20 livmorhalskreft prøver (fig. 1B). I samsvar med den microarray datasettet, QRT-PCR-analyse viste at uttrykket av HBA1 og HBB var betydelig høyere i livmorhalskreft vev enn i normale livmorhalsen vev (Fig. 1C og D). Med uttrykket av transkripsjonsfaktorer for erytropoiese, inkludert Gata-1, KLF1, og SCL /TAL1 [27], ble ikke endret seg vesentlig i livmorhalskreft vev sammenlignet med kontrollene (data ikke vist). Ekspresjonen av erytrocytt spesifikk markørgener, for eksempel SPTB, eRAF, ble ikke oppregulert i livmorhalskreft vev, noe som indikerer at økningen i Hgb ekspresjon ikke var knyttet til erytropoese. Disse resultatene tyder på at Hgb kan spille en rolle i menneskelig livmorhalskreftutvikling.
(A) For å bekrefte spesifisiteten av HBA1 og HBB primere for QRT-PCR, uttrykk for HBA1 og HBB ble undersøkt i menneskelig benmarg og perifere blodceller. Retrotranscriptase fri (-) som en negativ kontroll, H
2o som et systemkontroll. Mr, Marker. (B) cDNA fra livmorhalskreft prøver ble fremstilt og analysert for ekspresjon av HBA1 og HBB ved RT-PCR. PCR-produktene ble separert på 2% agarosegeler og visualisert med etidiumbromid. GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting. H
2o som en systemkontroll, T, representerer primærtumorprøver. Uttrykket nivåer av HBA1 og HBB ble målt ved QRT-PCR i 20 menneskelige livmorhalskreft prøver og 10 normale kontroller cervical vev. Kvantifisering av den angitte normaliserte HBA1 og HBB nivåer (log
10) av den totale uparede normal cervix (n = 10) og livmorhalskreft (n = 20) prøvene er vist. De Tukey boksene representerer de øvre og nedre kvartil delt på median og værhår er de største og minste verdier, med unntak av uteliggere representert ved sirkler. Alle forskjellene var statistisk signifikant på
P
. 0,05 (C og D)
Påvisning av Hgb Protein i Cervikal karsinom Vev
uttrykk for Hgb på proteinnivået ble undersøkt ved bruk av kommersielle antistoffer mot høyrenset human Hgb. På grunn av den høye homologi mellom globin-familieproteiner, ble spesifisiteten av antistoffet for påvisning av HBA1 og HBB kjedene verifisert ved å transfektere humane embryonale nyre HEK293-celler med ekspresjonsvektorer som bærer EGFP-merket globin isoformer (HBA-a1, Hbb-b1 , HBA-x, Hbb-y, HBA-z), som viste ingen kryssreaksjon med andre globins i farging eksperimenter (fig. S1). For å unngå kryss-reaktivitet med blodceller, ble livmorhalskreft vev grundig vasket i PBS før fiksering. Hematoxylin og eosin (H E) farging av livmorhalskreft vevssnitt viste godt differensiert plateepitelkarsinom (Fig 2A og B).. I cancervev, HBA1 og HBB viste en diffus cytoplasmatisk fargemønster (fig. 2D og F). Et ikke-spesifikt IgG monoklonalt antistoff fortynnet med PBS ble anvendt som en negativ kontroll (figur 2C og E.)
Deler fra parafininnstøpte humane cervikale kreft vev ble utsatt for enten H . E farging eller immnunohistochemical analyse med HBA1 og HBB antistoffer. Livmorhalskreft prøvene viste godt differensiert plateepitelkarsinom (A og B). S, stroma. Cytoplasmatiske farging av HBA1 og HBB ble påvist i biopsiprøver fra livmorhals vev (D og F). Et ikke-spesifikt IgG monoklonalt antistoff fortynnet med PBS ble anvendt som en negativ kontroll (C og E). Dobbelt farging mot p16
INK4A, en spesifikk markør for livmorhalskreft, viste at Hgb ble uttrykt i livmorhalskreftceller (I, K, M og O). Hvit stiplede bokser ble digitalt forstørret (J, L, N og P). Immunfluorescens uten primære antistoff viste ubetydelig signaler i livmorhalskreftceller (G og H).
uttrykk for Hgb protein i livmorkreft vev ble bekreftet ved immunhistokjemi å bruke en bestemt antistoff mot Hgb, som viste tydelig mønstre av diffuse cytoplasma flekker i livmorhalskreft vev (fig. 2I). Utelatelse av det primære antistoff i samme farging system tjente som en negativ kontroll (Fig. 2G og H). Dobbel-farging ved bruk av polyklonale antistoffer med kryss-reaktivitet mot HBA1 og HBB og et antistoff som er spesifikt for
INK4A p16, en spesifikk markør for kreft i livmorhalsen som brukes for cytologi og histologisk diagnose [28], [29], viste ko-lokalisering av Hgb med p16
INK4A i livmorhalskreft vev (fig. 2i-P). Disse resultatene bekreftet at Hgb protein er uttrykt i livmorhalskreftceller.
Påvisning av Hgb mRNA og protein i Kulturlivmorhalskreft Cells
uttrykk for Hgb ble undersøkt ved mRNA og proteinnivåer bruker Siha og CaSki menneskelig livmorhalskreft cellelinjer dyrket
in vitro
å bekrefte vår
in vivo
funn av Hgb uttrykk i livmorhalskreftceller. RT-PCR-analyse ved anvendelse av humane blodcelle-RNA som en positiv kontroll viste tilstedeværelse av mRNA for HBA1 og HBB kjeder av humane Hgb i dyrkede cervikale kreftceller (Fig. 3A). Sekvensering av PCR-produktene viste at de samsvarer med 100% HBA1 (NM_000558) og HBB (NM_000518) mRNA-sekvenser. I overensstemmelse med tidligere studier i alveolare celler og hepatocytter [12], [17], et uttrykk for HBA1 var ca. 9,6 ganger høyere enn for HBB ved QRT-PCR (data ikke vist). Western blot analyse ved hjelp av spesifikke antistoffer mot HBA1 og HBB viste lave nivåer av Hgb protein uttrykk i cellelinjer analysert. Protein ble ekstrahert fra perifere blodleukocytter (PBL) ble anvendt som en positiv kontroll (Fig. 3B). Immunoutfelling viste en tydelig bånd på 17 kDa som er spesielt anriket fra cellelysater (Fig. 3C). Benytte seg av kommersielle andibodies produsert mot humant HBA1 og HBB, ble immunfluorescens analyse utført for å undersøke lokalisering av Hgb protein i Siha celler, som viste en lignende cytoplasmatisk fargemønster av HBA1 og HBB former som for livmorhalskreft vev (Fig. 3D-G). Dobbelt farging avslørte at Hgb ble samlokalisert med livmorhalskreft markør p16
INK4A (Fig. 3H-J). Lignende resultater ble oppnådd i en annen livmorhalskreft cellelinje, CaSki (fig. S2), noe som bekrefter ekspresjonen av Hgb i dyrkede cervikale kreftceller. Spesielt de to celletypene uttrykt mer HBA1 enn HBB på mRNA og protein nivå. Som Hgb er sannsynlig å fungere som heterotetramer av to forskjellige subenheter, vi tok fordel av co-immunoutfellingsstudier eksperimenter for å forhøre om HBA1 og HBB uttrykk i livmorhalskreft er i stand til å danne heterodimerer. Som det kan ses i fig. S3, den svake tilstedeværelsen av endogene HBA1 /HBB heterodimerer ble bekreftet av co-immunoutfellingsstudier eksperimenter.
(A) RT-PCR forsterkning av HBA1 og HBB fra Siha, CaSki celler og menneskeblod RNA. Den HBA1 og HBB transkripsjoner ble klart forsterket fra de menneskelige livmorhalskreft cellelinjer, Siha og CaSki. RNA ble ekstrahert fra blod ble anvendt som en positiv kontroll og GAPDH ble detektert som en lasting kontroll. Amplikon identitet ble bekreftet ved sekvensering. (B) HBA1 og HBB ble analysert ved western blotting. Perifere blodleukocytter (PBL) ble brukt som en positiv kontroll og β-actin ble detektert som en lasting kontroll. (C) Cellelysater fra Siha og CaSki-celler ble immunoutfelt og immunoblottet med de angitte antistoffer. En tydelig bånd på 17 kDa ble anriket fra Siha og CaSki-lysater ved immunoutfelling ved å bruke et anti-humane Hgb-antistoff. Ikke-spesifikk IgG ble anvendt som kontroll immunopresipitasjon. Cytoplasmisk farging av HBA1 og HBB ble påvist i livmorhalskreft celler (D og E, F og G). Dobbelt farging med p16
INK4A, en spesifikk markør for livmorhalskreft for cytologi og histologisk diagnose, viste at Hgb ble uttrykt av livmorhalskreftceller (H-J). Innstikk er forstørret bilde av utvalgte områder (små firkanter).
Up-regulering av HBA1 og HBB Expression i livmorhalskreftceller ved oksidativt stress
For å finne ut om funksjonen til Hgb i nonerythrocytes er forskjellig fra den kjente rollen som oksygenbærer, undersøkte vi ekspresjon av proteinet i Siha og CaSki-celler i respons til oksidativt stress basert på tidligere bevis av antioksidantegenskaper av Hgb. Behandling av Siha celler med H
2o
2 økt uttrykk for HBA1 og HBB på mRNA og proteinnivåer (fig. 4A og B). Lignende resultater ble oppnådd i en annen livmorhalskreft cellelinje, CaSki (fig. S4). Induksjon av Hgb av H
2o
2 ble bekreftet i HEK293 celler (fig. 4C), noe som tyder på at Hgb uttrykk kan være oppregulert av oksidativt stress i ulike celletyper.
(A ) HBA1 og HBB mRNA uttrykk i Siha celler ble indusert av H
2o
2 behandling. Siha celler ble behandlet med H
2o
2 (1 mM) i 24 timer og Hgb mRNA-nivåer ble bestemt ved QRT-PCR. HGB nivåer i kontrollene ble normalisert til 1. Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD (n = 3)
**
P
. 0,01. (B) HBA1 og HBB protein uttrykk ble indusert av H
2o
2 behandling. Helcellelysater oppnådd fra Siha celler behandlet med eller uten H
2o
2 (1 mM, 48 t) ble analysert for HBA1 og HBB nivåer. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. (C) HBA1 og HBB mRNA ble oppregulert av H
2o
2 behandling i HEK293 celler. HEK293-celler ble behandlet med H
2o
2 (1 mM, 36 h). Revers transkripsjon PCR-produktene ble separert på 2% agarosegeler og visualisert med etidiumbromid. GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting. (D) Dose og tidsavhengighet av responsen til Siha celler til H
2o
2 behandling. Siha celler ble behandlet med en serie av konsentrasjoner (0, 0,25, 0,5 og 1 mM) i H
2o
2 til 8, 16, 24 eller 36 timer. Relativ HBA1 mRNA nivå ble bestemt ved QRT-PCR. Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD (n = 3). Verdiene ble normalisert til den HBA1 nivå i kontrollen (0 mM, 8 h), som ble satt til 1. En-veis ANOVA test for multiple sammenligninger ble benyttet for å analysere forskjellene mellom behandlingene.
**
P
0,01;
***
P
. 0,001, sammenlignet med 0 mm behandling
For å undersøke mulig dose og tidsavhengighet i H
2o
2-indusert oppregulering av Hgb ble Siha celler behandlet med ulike H
2o
2 konsentrasjoner for forskjellige tidsperioder, og analysert ved hjelp av standard QRT-PCR. Som vist i fig. 4D, H
2o
2 økt Hgb mRNA nivåer i en dose- og tidsavhengig måte. Effekten av oksidativt stress på ekspresjon av Gata-1 og KLF1, som er transkripsjonsfaktorer som regulerer Hgb ekspresjon i løpet av erytropoese ble undersøkt. I samsvar med en tidligere undersøkelse i hepatocytter [17], opp-regulering av Hgb ved H
2o
2 ikke ble formidlet av Gata-1 og KLF1, noe som tyder på at en annen underliggende mekanisme kan være involvert (fig. S5 ).
Demping av ROS Generation og apoptoseinduksjon av HBA1 /HBB eller HBA1, men ikke HBA1
H88R /HBB
H93R Overuttrykte i livmorhalskreft Cells
for å undersøke den biologiske rollen til Hgb i livmorhalskreftceller, ble HBA1 og HBB overexpressed ved transient transfeksjon av Siha celler. Øket ekspresjon av HBA1 og HBB ble bekreftet ved immunoblotting (Fig. 5A). Basert på en tidligere studie som viser at visse oksidativt stress induserbare gener har antioksidative funksjoner [30], hypotese vi at Hgb kan ha antioksidantegenskaper i livmorhalskreftceller i respons til oksidativt stress. Vi undersøkte derfor intracellulære nivåer av ROS i celler behandlet med H
2o
2 bruker fluorogene sonder og superoksid anion. Ektopisk uttrykk for HBA1 /HBB i Siha celler behandlet med eksogen H
2o
2 undertrykt den intracellulære produksjonen av H
2o
2 og superoksid anion som bestemmes av immunfluorescens analyse (Fig. 5B og C) . Kvantifisering av ROS produksjon ved strømningscytometri viste at fluorescensintensiteten i celler som overuttrykker HBA1 /HBB var betydelig lavere enn i celler transdusert med kontroll lentivirus (fig. 5 D og E). Prosentvis per total celletelling med høye nivåer av hver ROS i celler som overuttrykker HBA1 /HBB ble signifikant redusert sammenlignet med transfeksjon med den tomme vektoren som en kontroll (
P
0,05, n = 3 for hver gruppe, fig . 5F og G). Lignende resultater ble observert i CaSki-celler (data ikke vist). Det faktum at ekspresjonsnivået av HBA1 i livmorhalskreft cellelinjer er høyere enn den for HBB antyder at flere bioaktive molekyler, ikke bare heterodimeren former, men også monomere eller homodimer former av HBA1 proteinet kan være til stede på samme tid i livmorhalskreft celler. Til støtte for denne oppfatningen, ble Siha celler bare tilført med HBA1 og deretter behandlet med eksogen H
2o
2. I samsvar med en nylig studie [31], prosent per total celletelling med intracellulære nivåer av ROS i celler som overuttrykker HBA1 var signifikant lavere enn i celler transfektert med kontroll-vektor (fig. 5H). Hvis du vil forkaste enhver generalisert eller selektive virkning på grunn av uspesifikke overekspresjon av protiens, vi generert en cellelinje som uttrykker en inaktiv form av Hgb bærer en aminosyre forandring i Hans ansvaret for å koordinere hemo protesegruppen (HBA1
H88R [ ,,,0],31] og HBB
H93R, fig. S6). Som det kan ses i fig. 5I, de intracellulære ROS-nivåer i celler som overuttrykker HBA1
H88R /HBB
H93R ikke ble signifikant redusert, sammenlignet med i celler transfektert med tom vektor, noe som tyder på at heme-bindende aktivitet er nødvendig for Hgb antioksidative funksjon.
(A) helcellelysater fra Siha celler transfektert med et plasmid eller kontroll HBA1 og HBB ekspresjonsplasmider ble analysert med et anti-Hb-antistoff for å bekrefte overekspresjon av globin proteiner. Kontroll og HBA1 /HBB- overekspresjon-celler ble farget med fluorogene prober for å påvise intracellulære H
2o
2 og superoksydanioner og utsatt for ekstracellulær H
2o
2 (1 mM) i 10 minutter. Immunfarging bekreftet at den intracellulære generering av H
2o
2 (B) og superoksydanioner (C) ble undertrykket i HBA1 /HBB-overekspresjon celler. Strømningscytometri-analyse bekreftet disse resultatene (D og E), og viste at de intracellulære nivåene av H
2o
2 og superoksydanioner var høyere i celler eksponert for ekstracellulære stimuli enn i ubehandlede celler (B og C). Kvantitative analyser bekreftet at den intracellulære generering av H
2o
2 (F) og superoksydanioner (G) ble hemmet i HBA1 /HBB-overuttrykkende celler (sort kolonne) mer enn i kontrollcellene (grå kolonner;
P
0,05). Kvantitative analyser bekreftet at den intracellulære generering av ROS ble redusert i HBA1-overekspresjon celler (sort kolonne, IH), men ikke i HBA1
H88R /HBB
H93R-overuttrykkende celler (sort kolonne, I), mer enn i kontroll vektor-overekspresjon celler (grå kolonne). *
P
0,05; **
P
0,01;
N
P
. 0,05
En laktat dehydrogenase (LDH) cytotoksisitet analysen, som måler frigjøring av LDH i dyrkningsmediet, ble utført for å undersøke cellenes levedyktighet i henhold til oksidativt stress. Siha celler som overuttrykker HBA1 og HBB viste LDH frigjøringshastigheter på 22,1 ± 2,2% og 32,5 ± 3,4% i respons på behandling med 0,5 og 1 mm H
2o
2 for 24 timer, henholdsvis, sammenlignet med 29,6 ± 3,1 % og 34,6 ± 2,1%, henholdsvis i celler transfektert med tom vektor (
P
0,01 og
P
0,05 for 0,5 og 1 mm H
2o
2, henholdsvis; n = 3 for hver gruppe) (figur 6A).. Siha cellelevedyktighet ble også forbedret ved HBA1 og HBB overekspresjon når cellene ble behandlet med 0,5 mM og 1 mM H
2o
2 i 36 timer (
P
0,01). Lignende resultater ble oppnådd i HBA1-overekspresjon Siha celler (Fig. 6B). Vi deretter undersøkt om funksjonen til Hgb å forbedre celle levedyktighet avhenger av heme-bindingsaktivitet, ved hjelp av HBA1
H88R /HBB
H93R mutanter, som er ute av stand til å binde heme men bevare kjeden konformasjon. Som det kan ses i fig. 6B, mutasjon av Hans ansvaret for å koordinere heme protesegruppen (HBA1
H88R og HBB
H93R) av HgbA svekker dens evne til å forbedre celle levedyktighet.
(A) levedyktighet Siha celler behandlet med 0, 0,5, og 1 mM H
2o
2 til 12, 24 og 36 timer som ekstracellulære oksidativt stress ble evaluert av LDH-frigivelse analysen. Siha celler transfektert med de HBA1 /HBB-uttrykkende vektorer (svart kolonne) viste økt motstand mot H
2o
2-indusert celle sammenlignet med celler transfektert med kontroll-vektor (grå søyle). Lignende forsøk ble framført i begge HBA1-overekspresjon celler og HBA1
H88R /HBB
H93R-overekspresjon celler (B). Siha-celler ble transfektert med de angitte plasmidene. Førti-åtte timer senere ble cellene behandlet med 1 mm H
2o
2 eller venstre ubehandlet i 22 timer. Prosentandelen av apoptotiske celler ble overvåket ved Annexin V-farging, etterfulgt av FACS-analyse (C). Siha-celler ble transfektert med de angitte plasmider og førti time senere, ble behandlet som i (A), Caspase-3-aktivitet i annen gruppe ble målt ved hjelp av spesifikk caspase substrat AcDEVD-pNA som beskrevet under materialer og metoder. Verdier av absorpsjonen ble uttrykt som kontroll som ble angitt som en (D og E). Alle forsøk ble utført in triplo, og ble gjentatt minst tre ganger, og resultatene er uttrykt som gjennomsnitt verdier ± S.E.M. *
P
. 0,05; **
P
0,01;
N
P
. 0,05
ROS (superoksid, hydrogenperoksid og hydroksyl radikaler) er potente intracellulære oksidanter og indusere av oksidativ skade, som har blitt foreslått som kritiske regulatorer av apoptose [32] og behandlinger med antioksidanter beskytter cellene mot apoptose [33]. Gitt at tilstedeværelsen av Hgb (enten HBA1 eller HBA1 /HBB) fører til redusert produksjon av interacellular ROS, kan det tenkes at slike celler beholder evnen til å beskytte seg mot oksidative fornærmelser. Dermed hevet vi spørsmålet om Hgb-mediert beskyttelse mot celledød i Siha celler var rett og slett på grunn av redusert intracellulær akkumulering av ROS. Vi utforsket denne muligheten ved å bestemme effekten av villtype HBA1 /HBB, HBA1, og mutanter HBA1
H88R /HBB
H93R-overekspresjon på H
2o
2-indusert apoptose av flowcytometrisk analyse ved hjelp Siha celler. Som vist på fig. 6C, viste resultatene at befolkningen i de apoptotiske celler indusert av H
2o
2 ble hemmet i både HBA1 og HBA1 /HBB-overekspresjon celler, men ikke i HBA1
H88R /HBB
H93R -overexpression celler. Aktivering av en cystein protease, kalt caspase-3 og generering av ROS ble vurdert nøkkeltrinnene i induksjonen av celledød [34], og det er kjent at ROS generasjon i mitokondriene aktiverer caspase-3 via samarbeid av cytokrom
c
, Apaf-1 og caspase-9 [35]. Vi neste undersøkte effekten av Hgb på kaspase-3 aktivering. I samsvar med den Annexin V-bindingsanalysen, fant vi at den økte aktiveringen av caspase-3 forårsaket av 0,5 mM og 1 mM H
2o
2 etter inkubering i 12, 24 og 36 timer henholdsvis, kan bli betydelig redusert i begge HBA1 og HBA1 /HBB-overekspresjon-celler, sammenlignet med tom vektor (fig. 6D). I kontrast, ektopisk uttrykk for HBA1
H88R /HBB
H93R i Siha celler var ikke effektive i å forebygge H
2o
2-indusert caspase-3-aktivering (fig. 6E), noe som tyder på at heme- bindingsaktivitet er nødvendig for dens funksjon. Oppsummert disse resultatene antydet at både HBA1 og HBA1 /HBB overekspresjon kan ha en antioksidant effekt via scavenging av ROS, og dermed beskytte livmorhalskreftceller mot oksidativt stress-indusert skade.
Diskusjoner
I denne studien, viste vi at Hgb uttrykket ble forhøyet i livmorhalskreft vev sammenlignet med normal cervix vev. Dette er det første bevis på at a- og β-globin kjeder av Hgb er uttrykt i kreftcellene i livmorhalsen. Vi brukte livmorhalskreft cellelinjer Siha og CaSki å undersøke Hgb-α og Hgb-β mRNA og protein uttrykk ved hjelp av tre ulike tilnærminger: RT-PCR, farging og western blot analyse. Videre Hgb dempes hydrogenperoksid indusert oksidativt stress i livmorhalskreftceller, fungerer som en antioksidant.
Den langvarige oppfatningen at Hgb er bare uttrykt i cellene erytropoide avstamning har blitt utfordret i nyere studier viser Hgb ekspresjon i nonerythrocytes, inkludert neuroner [7], [8], [9], netthinneceller [10], [11], alveolære epitelceller [12], [13], [14], endometrium [15], rotte-nyre mesangiale celler [16], [17] hepatocytter og makrofager [18]. Hovedfunksjonen til Hgb i erytrocytter er å transportere oksygen fra lungene til vevet, og å transportere karbondioksyd fra vev til lungen. Den biologiske funksjonen til Hgb i nonerythroid celler er ikke avklart og dets fysiologiske funksjon er fortsatt et spørsmål om debatt. Hgb overekspresjon i en murin dopaminerg cellelinje, MN9D, endret ekspresjon av forskjellige gener som er involvert i oksygen homeostase og mitokondrielle oksidativ fosforylering, noe som tyder på at Hgb kunne fungere som en oksygenlagrings molekylet i nevroner [9]. Hgb overekspresjon i rottenyre mesangial cellelinje SV40-MES13 og den humane leverkreftcellelinje HepG2 redusert hydrogen-peroksyd induserte oksidativt stress, noe som tyder på at HGB virker som en antioksidant [16], [17].
Selv
