PLoS ONE: Primær Cilia er tapt i preinvasive og Invasive Prostata Cancer

Abstract

Prostatakreft er den nest vanligste diagnosen kreft hos menn over hele verden. Lite er kjent om rollen som primær flimmerhårene i preinvasive og invasiv prostatakreft. Imidlertid har redusert cilia ekspresjon observert i humane kreftformer, inkludert kreft i bukspyttkjertelen, renal celle karsinom, brystkreft, kolangiokarsinom, og melanom. Hensikten med denne studien var å karakter primær flimmerhårene uttrykk i preinvasive og invasiv menneskelig prostatakreft, og å undersøke sammenhengen mellom primær flimmerhårene og Wnt signalveien. Menneskelig prostata vev representant stadier av prostatakreft formasjonen (normal prostata, prostata intraepitelial neoplasi (PIN), og invasiv prostatakreft (inkludert perinevral invasjon)) ble farget for ciliary proteiner. Frekvensen av primære cilia ble bestemt. Det ble observert en nedgang i andelen ciliated cellene i PIN, invasiv kreft og perineural invasjons lesjoner i forhold til det normale. Cilia lengder ble også målt for å teste indirekte funksjonalitet. Cilia var kortere i PIN, kreft, og perineural invasjon lesjoner, noe som tyder dysfunksjon. Primære cilia har vist seg å undertrykke den Wnt pathway. Økt Wnt signal har vært innblandet i prostatakreft. Derfor undersøkte vi en sammenheng mellom tap av primær flimmerhårene og økt Wnt signal i normal prostata og i preinvasive og invasiv prostatakreft. For å undersøke Wnt signal i vår årsklasse, ble serie vevssnitt farget for β-catenin som et mål på Wnt signalering. Nuclear β-catenin ble analysert og Wnt signalering ble funnet å være høyere i un-cilierte celler i normal prostata, PIN, en undergruppe av invasive kreftformer, og perinevral invasjon. Våre resultater tyder på at cilia normalt virker til å undertrykke den Wnt signalveien i epitelceller og at cilia tap kan spille en rolle i signalisering økes Wnt i noen prostatakreft. Disse resultatene tyder på at flimmerhårene er dysfunksjonell i menneskelig prostata kreft, og øke Wnt signal skjer i en undergruppe av kreft

Citation. Hassounah NB, Nagle R, Saboda K, Roe DJ, Dalkin BL, McDermott KM (2013 ) Primær Cilia er tapt i preinvasive og Invasive prostatakreft. PLoS ONE 8 (7): e68521. doi: 10,1371 /journal.pone.0068521

Redaktør: Vladislav V. Glinskii, University of Missouri-Columbia, USA

mottatt: 1 mars 2013; Godkjent: 30 mai 2013; Publisert: 02.07.2013

Copyright: © 2013 Hassounah et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av stiftelsen Science of Arizona (http://www.sfaz.org), Kreft Biology Training Grant (NIH, T32CA009213), University of Arizona Cancer Center Support Grant (NIH, P30CA023074), en R00 (NIH- NICHD, R00HD056965); og bedre enn noensinne Foundation (http://azcc.arizona.edu/outreach/bte). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

den primære cilium er en microtubule basert organeller som stikker ut fra plasmamembranen og fungerer omtrent som en «antenne» til å oppfatte ekstracellulære signaler. Primære flimmerhårene er vanligvis immotile men kan ane fysiske og kjemiske signaler. Celler med primær cilia ha bare en enkelt cilium som strekker seg fra celleoverflaten. I bunnen av den primære cilium er basal legemet (også kjent som mor centriole), som er forankret til plasmamembranen. Den basale kropps nucleates de mikrotubulidynamikk bunter som strekker seg opp cilium (figur 1A). Hundrevis av proteiner har blitt identifisert som utgjør den primære cilium [1]. Mange av disse proteinene lokalisere til cilium for å regulere de sensoriske eller signaleringsfunksjoner av primær cilium. Cilia opptre som antenner gjennom sensing ekstracellulære signaler og bidra til å regulere cellesignalisering; for eksempel primære cilia er negative regulatorer av Wnt veien [2,3]. Spesielt primære cilia dempe Wnt signale respons ved compartmentalizing Wnt signalproteiner, for eksempel positiv regulator Jouberin [3]. Cilia har demonstrert rolle i utviklingsbiologi og menneskelige sykdommer kjent som ciliopathies (f.eks Joubert syndrom (JBTS), polycystisk nyresykdom (PKD), Bardet-Biedl syndrom (BBS), og Nephronophthisis (NPHP)) [4].

bilder fra (A) normal prostata og (B) invasiv prostatakreft. Serielt tilstøtende lysbilder ble farget med H E for å visualisere vev morfologi eller beiset fluorescens for kjerner (Hoechst, blå), primær flimmerhårene (Ac-Tub, rød) og centrosomes (γ-Tub, grønn). Merkede strukturer er lumen (Lum), kreft (Ca), og stroma (Strm). Innfelt viser forstørrelsen av (A) et primært cilium på en normal epitelial celle og (B) en sentrosomen uten en cilium på en kreftcelle. Asterisk betegner spesifikk farging (C, topp). Box plott av prosent ciliated epitel og kreftceller per pasient for hver vevstype: normal, prostata intraepitelial neoplasi (PIN), kreft (Ca), og perinerual invasjon (Peri). Oransje linje og bue tilsvarer Q4 (kvartil 4, større enn 75

th persentil for normalt vev) og blå linje og pil tilsvarer Q1 (kvartil 1, mindre enn eller lik 25

th persentil for normal vev). Statistikken ble utført ved hjelp av lineær regresjon (*** = p 0,001) (C, nederst). Prosentandelen av pasienter med unormalt høy prosent cilier (Q4, oransje) eller et unormalt lavt prosent cilier (Q1, blå). (D) Prosent av Ki67 positive invasive kreftceller og perineural invasjon kreftceller pr pasient (x-aksen) som funksjon av prosent cilierte kreftceller for den samme pasient (y-aksen). Statistisk analyse var en ikke-parametrisk Spearman korrelasjon.

Cilia også spille en kausal rolle i tumorigenesis [5,6]. Musemodeller viser at i noen sammenhenger flimmerhårene er pålagt å fremme kreft mens i andre miljøer tap av flimmerhårene øker svulst forekomst. Redusert cilia uttrykket har blitt observert i humane kreftformer, inkludert kreft i bukspyttkjertelen, nyrecellekreft, brystkreft, kolangiokarsinom, og føflekkreft [7-11]. Disse studier støtter hypotesen om at primær cilia kan fungere som en tumor suppressor organell i noen vev. Tap av primær flimmerhårene ble ytterligere demonstrert i premaligne bukspyttkjertelen intraepitelial neoplasi, noe som tyder på at flimmerhårene tap kan måtte oppstå tidlig å tillate for kreft i bukspyttkjertelen formasjon [10].

Hyppigheten og funksjonalitet av primær flimmerhårene i preinvasive og invasiv menneskelig prostatakreft har ikke blitt nøye karakterisert. Prostatakreft er den nest vanligste diagnosen kreft og den sjette største årsaken til kreft dødsfall hos menn over hele verden. Den kanoniske Wnt signalveien har vært innblandet i menneske prostatakreft, men rollen til denne veien i prostata kreft er ikke fullt ut forstått. Den aktuelle studien er rettet mot karakter primære cilier frekvens og funksjon i menneske prostatakreft og for å undersøke sammenhengen mellom primære cilier uttrykk og Wnt signalering. Vi viser at primær flimmerhårene frekvensen er redusert i alle stadier av prostatakreft, fra tidlig preinvasive lesjoner til invasive etapper. Primære cilia lengder er også redusert i preinvasive og invasiv prostatakreft, noe som tyder på tap av funksjon. Vi viser videre at flimmerhårene fravær korrelerer med økt kjernefysisk β-catenin lokalisering i normal prostata vev, og kjernefysisk β-catenin er oppregulert i PIN, en undergruppe av prostatakreft, og perineural invasjon områder.

Materialer og metoder

Menneskelige vevsprøver

Alle formalinfiksert parafin-embedded vevsprøver ble innhentet fra Tissue Oppkjøp og Cellular /molekylær analyse Shared service (TACMASS) ved University of Arizona Cancer Center. Prostatektomi vevsprøver ble kjøpt fra pasienter som gjennomgår åpen radikale prostatectomies fra 2006 til 2009. Vev fra bare én pasient ble ervervet gjennom transuretral reseksjon av prostata. For prostata vev, ble til sammen 32 blokker fra 25 tilfeller valgt basert på tilstedeværelsen av områder av interesse, som ble identifisert av en patolog ser på arkivert hematoxylin og eosin (H E) lysbilde -stained vev for hver vevsblokk . Ut av de 25 tilfellene, 23 tilfeller hadde kreft ligger på vevsblokk. I sju tilfeller ble to vevsblokker brukes fra samme pasient for å få alle vev områder av interesse. Tissue microarray (TMA) lysbilder ble også brukt fra vev kjøpt fra pasienter som gjennomgår åpen radikale prostatectomies fra 1992 til 2001. Fem TMA lysbilder som inneholder ~ 54 kjerner (1 mm hver) per lysbilde ble utnyttet. Hver pasientprøve ble representert fire ganger mellom TMA skred med tre kjerner fra svulstvev og en kjerne fra normalt vev. Fra TMA skred, ble vev kjerner fra i alt 53 pasienter valgt basert på tilstedeværelsen av brukbare vev med kreft og /eller perineural invasjon lesjoner. Av TMA vev fra 53 pasienter, en pasient hadde bare perineural invasjon lesjoner. For alle prostata vevsprøver de beskrevet, et enkelt urolog utførte operasjoner. Pasient og kliniske data ble også oppnådd for de fleste pasienter, inkludert alder ved kirurgi, patologisk tumorstadium, pre-operative gratis prostataspesifikt antigen (PSA) nivåer, biokjemisk tilbakefall, tid til biokjemisk tilbakefall, kapsel penetrasjon, og største tumorvolumet. Skriftlig samtykke ble gitt av pasientene for deres informasjon skal brukes til forskning. Biokjemisk tilbakefall ble definert som fri serum PSA 0,1 ng /ml for to påfølgende målinger. Utvalget av hvor lang tid mellom kirurgi og siste oppfølging er 10 måneder til 16 år. Patologisk normale og kreftfrie prostata-vev fra 10 pasienter ble anvendt som kontroller og ble oppnådd fra pasienter med blærekreft som gjennomgikk cystoprostatectomies.

Serial vevssnitt ble kuttet for hver pasientprøve. Den første serie delen ble farget for H E og hele vev delen ble skannet med en 20x objektiv ved hjelp av automatiserte DMetrix lysbilde skanner (DMetrix, Inc.). Digitale bilder ble kommentert ved hjelp av Okular programvare (DMetrix, Inc.) ved en sertifisert patolog for hver av de områder av interesse per vev lysbilde. For hele kullet områder av interesse som ble benyttet var som følger: patologisk normal prostata fra pasienter med blærekreft (n = 10), patologisk normal prostata tilknytning til kreft (n = 16), benign prostatahyperplasi (BPH; n = 8), prostata intraepitelial neoplasi (PIN; n = 24), lavgradig PIN (LG PIN; n = 13) og høyverdig PIN (HG PIN; n = 18), lavgradig (LG, Gleason sum poengsum = 6; n = 35) og høy grad av kreftformer (HG; Gleason sum rille 6; n = 40), og perinevral invasjon lesjoner (n = 18). Alle de vevstyper ble tatt fra den radikale prostatectomies, med unntak av patologisk normal prostatavev fra pasienter med blærekreft (disse var fra cystoprostatectomies). Sju pasienter hadde både LG (økt kjernefysisk til cytoplasma ratio, og økt kjernefysisk størrelse) og HG (tilstedeværelse av fremtredende nucleoli, økt kjernefysisk til cytoplasma ratio, og økt kjernefysisk størrelse) PIN. Gleason sum score er en gradering metode som brukes for å vurdere graden av differensiering [12]

immunfluorescens

Vevet lysbildeserie til H . E-farget lysbilde ble brukt for co-farging av cilia, centrosomes og cytokeratin 5 (CK5). Parafininnstøpte vev objektglass ble deparaffinized i en tørr inkubator ved 65 ° C i 15 minutter og hydrert ved vasking med xylen (2 x 10 min), 100% isopropanol (2 x 10 min), 70% isopropanol (2 x 10 min) , 50% isopropanol (2 x 10 min), og ultrarent vann (2 x 10 min). Alle vaskinger ble ved romtemperatur. Antigen henting med en 1 mM EDTA avsløre løsningen ble utført ved hjelp av en 2100 Retriever (elektronmikroskopi Sciences) i henhold til produsentens instruksjoner. Tissue lysbilder ble plassert i Shandon coverplates (Thermo Scientific, Cat # 72-110-017) og deretter inn Sequenza Skyv Stativer (Thermo Scientific, Cat # NC0263065). Tissue lysbilder ble blokkert med ChemMate antistoff fortynningsbuffer (Ventana Medical Systems, Inc., Cat # ADB250) med geit serum (5%) (Invitrogen Corporation, Cat # 16210-064) i 45 minutter ved romtemperatur. Primære og sekundære antistoffer ble fortynnet i ChemMate antistoff fortynningsbuffer på 1: 1000. Primære antistoffer ble brukt mot acetylert tubulin (mus-IgG monocloncal

2B, Sigma, Cat # T7451, klon 6-11B-1), γ-tubulin (mus monoklonalt IgG1, Sigma, Cat # T5326, klon GTU-88), og CK5 (kanin polyklonalt, Abcam, Cat # ab24647), og inkubert på vevet over natten ved 4 ° C. Fem objektglass ble farget med en annen primær antistoff mot CK5 (klar til bruk monoklonalt muse-lgG1, Leica Micro, Cat # CK5-R-7-CE) for å bekrefte spesifisiteten til CK5 antistoffet som brukes. En prostatavevet lysbilde med normale og kreft områder ble også farget med en primær antistoff mot Arl13b (monoklonalt IgG

2a, UC Davis /NIH NeuroMab Facility, klone N295B /66) for å kontrollere merking av flimmerhårene med antistoff mot acetylert tubulin. Objektglassene ble deretter vasket med PBS i 10 minutter (3 x 10 min). De sekundære antistoffer som ble brukt var tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) -merket geit anti-mus-IgG

2B (Southern Biotech, Cat # 1090-1003), Alexa 633-merket geit anti-mus-IgG1 (Invitrogen, Cat # A21126) , Alexa 546-merket geit anti-mus-IgG

2a (Invitrogen, cat # A21133) og fluorescein-isotiocyanat (FITC) -merket geite-anti-kanin-IgG (Southern Biotech, Cat # 4052-02). Sekundære antistoffer ble inkubert med vevet i 45 minutter ved romtemperatur. Platene ble vasket med PBS i 10 minutter (3 x 10 min). Hoechst 33342 (Cat # H3570, Invitrogen) ble anvendt som en counterstain ved 1: 1000 og inkubert på objektglass i 10 minutter, etterfulgt av vasking med PBS i 5 minutter (2 x 10 min). Lysbilder ble montert med 1,5 Dekk (0,16 til 0,19 mm tykkelse) (Fisher Scientific, Cat # 12-544B) ved hjelp Forleng Gold Antifade montering media (Cat # P36934, Invitrogen).

Confocal avbildning

vevet lysbilde som var serielt tilknytning til digitalt skannet H E lysbildet ble fluorescens-farget for flimmerhårene, centrosomes, CK5 og Hoechst. Leica TCS SP5 II laser scanning confocal mikroskop (Leica Microsystems) ble brukt til bilde det fluorescens-farget lysbilder. Områder av interesse ble funnet ved hjelp av en lav-effekt forstørrelse objektiv (10x, 0,4 PI Apo) for å visualisere Hoechst counterstain på det fluorescens-farget lysbilde og ved å referere til den kommenterte serielt tilstøtende H E som ble digitalt skannet. Dette tillot oss å finne nøyaktig samme område av interesse som hadde blitt kommentert av patologen på H E. Når området av interesse ble funnet, ble Z stabler da overtatt med fiolett-laserdiode ved 405 nm for å påvise Hoechst farging ved en total tykkelse på 2 ± 0,5 um, med et Z-trinn tatt hver 1 um. Cilia ble deretter avbildes innenfor disse områder av interesse ved hjelp av et 63x objektiv (1,4 NA PL Apo) med helium neon-lasere (543 nm og 633 nm), ble CK5 avbildes med den argonlaser (488 nm), og den fiolette-laserdiode (405 nm) ble brukt til å påvise Hoechst farging. Z-stabler ble kjøpt til en total tykkelse på 5,0 ± 0,5 mikrometer, med en Z-skritt tatt hver 0,34 mikrometer (bildeoppløsning 2048×2048 piksler). Vi kjøpte et utvalg av 1-6 bilder per sted med 63x objektiv per vevstype per pasient, og dette varierte avhengig av størrelsen av plasseringen. Z bildene ble behandlet etter oppkjøpet til maksimalt anslag som bruker Leica LAS AF programvare for bildeanalyse.

Confocal bildeanalyse

Cilia frekvens og cilia lengder ble oppnådd for hver celletype bruker Leica LAS AF programvare. Cilia ble bare scoret da både stråle axoneme og sentrosomen var synlig sammen. For hver celletype [CK5 positive (CK5 +) epitel /kreftceller, CK5 negative (CK5-) epitel /kreftceller, og CK5-stromale celler], ble kjerner telles med telling verktøy, og cilia lengder ble målt ved hjelp av skalaen bar verktøy. Antallet cilier per celletype ble dividert med totalt antall kjerner pr celletype for å oppnå en prosentandel av cilierte celler. Minst 171 kjerner ble regnet per vevstype per pasient (maks = 2770, median = 782). Median cilia lengder per pasient ble bestemt og brukt i data og statistiske analyser. Boksplott viser dataene, hvor 75

th og 25

th persentilene er preget av de øvre og nedre boks grenser, henholdsvis. Den svarte linjen innenfor boksen betegner medianen. Slengere er definert som enten 25

th persentil -1.5X interkvartilt område, eller 75

th persentil + 1,5x indre kvartilområdet (åpne sirkler). Ekstreme uteliggere ble definert som enten 25

th persentil -3x interkvartilt område, eller 75

th persentil + 3X indre kvartilområdet (selges sirkler). Vi utnyttet data innhentet om prosent flimmerhårene og flimmerhårene lengden funnet i normal prostata å etablere en cutoff for å gi en relativ sammenligning poeng å flimmerhårene som finnes i PIN og kreftprøver. De øvre og nedre 25

th percentil ble valgt som våre relative normale tidsavgrensninger og dette ble holdt konsekvent gjennom vår analyse. Fra boksplott, var prosentandelen av pasienter med en unormal prosent av ciliated celler eller unormal median cilier lengde beregnes. Disse unormale målingene ble definert av 75

th og 25

th persentiler av normal. Verdier ble ansett som unormalt høyt hvis de falt over 75

th persentil av normal og unormalt lav hvis de falt på eller under 25

th persentil av normal. Ingenting er kjent om nøyaktige lengder av flimmerhårene som trengs for normal funksjon. Derfor vår øvre og nedre 25

th persentil cutoff bare gi en referanseramme for forhold til normal.

Immunohistochemistry

formalinfiksert parafin-embedded tissue lysbilder ble farget med en lignende protokollen som brukes for immunofluorescently fargede objektglass som er beskrevet ovenfor. Antigen gjenfinning ble utført som beskrevet, men med den Vector antigen avsløre-løsning (1: 106) (Vector Laboratories, Cat # H-3300), fulgt av quenching av endogen peroksidase-aktivitet ved romtemperatur i 20 minutter under anvendelse av hydrogenperoksyd i metanol (0,3% ). Slides ble deretter vasket med PBS (4 x 10 min) som er lagt inn i Shandon coverplates (Thermo Scientific, Cat # 72-110-017) og deretter inn Sequenza Skyv Stativer (Thermo Scientific, Cat # NC0263065). Slides ble så blokkert med 2,5% normal hesteserum blokkeringsbuffer (Vector Laboratories, Cat # S-2012) i 20 minutter, og deretter med ChemMate antistoff fortynningsbuffer (Ventana Medical Systems, Inc., Cat # ADB250) med geit serum (5 %) (Invitrogen Corporation, Cat # 16210-064) i 45 minutter. Alle vaskinger og blokkerende trinn var ved romtemperatur. Primære antistoffer ble fortynnet i ChemMate antistoff fortynningsbuffer. De følgende primære antistoffer ble brukt: p-catenin primære antistoff (1: 400, mus-monoklonalt IgG1, BD Transduction Laboratories, Cat # 610154) og Ki67 (1: 100, mus-monoklonalt IgG1, Dako, Cat # M7240, klon MIB-1 ). Kolonadenokarsinom vev glass ble anvendt som en positiv kontroll for β-catenin og Ki67 farging. Tissue lysbilder med sekundært antistoff bare ble anvendt som en negativ kontroll. Primære antistoffer ble inkubert på vevene over natten ved 4 ° C. Objektglassene ble deretter vasket i PBS (3 x 10 min). En universell anti-kanin-anti-muse-sekundært antistoff konjugert til peroksydase (ImmPress Universal-reagens, Vector Laboratories, Cat # MP-7500) ble inkubert med vevet i 30 minutter, etterfulgt av en vask i PBS i 5 minutter. 3-amino-9-etylkarbazol (AEC) med høy følsomhet substrat kromogen (Dako, Cat # K3461) var anvendelse som peroksydasesubstrat for β-catenin og Ki67 farging. AEC ble inkubert på lysbilder i 3 minutter for β-catenin flekker og 7 minutter for Ki67 farging. Tissue glass ble skylt med destillert vann i 5 minutter. Hematoxylin 1 (Thermo Scientific, Cat # 7221) ble brukt til å counterstain vev lysbilder. Hematoxylin 1 ble fortynnet 1: 3 og inkubert på vev objektglass i 15 sekunder og deretter skylt i ledningsvann inntil vannet rant klart. Faramount Vandig Mounting Media (Dako, Cat # S3025) ble brukt for montering lysbilder med 1,5 dekk (0,16 til 0,19 mm tykkelse) (Fisher Scientific, Cat # 12-544B).

Immunohistochemistry analyse

Hele lysbilder farget for β-catenin ble skannet med en automatisert Dmetrix skanner ved 20x forstørrelse (DMetrix Inc.). Lysbilder farget for Ki67 ble skannet med en 20x objektiv med BioImagene scanner (Ventana Medical Systems). De samme stedene som brukes for primær flimmerhårene analyse ble funnet ved å referere til den kommenterte H E lysbilde. Disse områdene av interesse ble eksportert som TIFF-filer fra Dmetrix skannefiler, og som JPEG-filer fra BioImagene skannefilene, og lastet inn Definiens Tissue Studio 3.0 programvare (http://www.tissuestudio.com). Tissue Studio 3.0 Programvare ble testet for absolutt avtale med manuelle hånd tellinger utført av to separate etterforskere. Bilder fra seks normal prostata og seks prostatakreft steder ble blindt scoret for nukleær farging av Gli1, hvor hver kjerne ble scoret som enten positiv eller negativ. For hvert bilde, ble Tissue Studio 3,0 brukt sammen til å kvantifisere antallet av positive og negative celler /kjerner. En statistisk test som blir brukt til å måle konsistensen og absolutte enighet av målinger foretatt av forskjellige observatører (intrakorrelasjons) ble anvendt på data oppnådd for de seks normale og cancerøse prostatavevet. Den intra korrelasjonskoeffisient ble bestemt som 0,7, ved hjelp av SPSS 19 (Statistical Package for Social Sciences, IBM Corporation)., Som er ansett som sterk enighet

For Ki67 analyse, noen pasient vev kan ikke brukes til analyse på grunn for mange seriesnitt mangler mellom Ki67-farget lysbilde og H E sklie, noe som gjør det umulig å finne den eksakte området som brukes til primær flimmerhårene analyse. Antallet pasienter som brukes for kreft var 72, og det antall pasienter som brukes for perinevral invasjon var 15. For den Ki67 analyse med Definiens Tissue Studio, en modifisert Nuclei (positiv /negativ) oppløsning ble anvendt. Epiteliale /kreft og stromal avdelinger av kreft og perinevral invasjon områder ble separat analysert ved hjelp av manuell ROI Selection (velge deler) segmentering verktøyet, med en segmentering av 8. hematoxylin og immunhistokjemi (IHC) terskelen ble satt til 0,12 vilkårlige enheter (au ) og 0,03 au, respektivt. IHC terskelen ble bestemt ved å identifisere den letteste positivt farget kjerne i utvalget og bruke denne verdien som cutoff for positivitet. En Nucleus Morfologi og Filter skritt ble brukt til å utelukke gjenstander feilaktig identifisert som kjerner. Fra de eksporterte resultatene ble positive indekser beregnet per vevstype per pasient.

Noen pasientvev kunne ikke brukes for β-catenin analyse på grunn av mangelfull seriesnitt, eller for mange seriesnitt mangler mellom β- catenin farget lysbilde og H E lysbilde, gjør det umulig å finne den nøyaktige plasseringen. For normal, antall steder benyttet var 26, fra 10 pasienter. For PIN, antall steder var 19, fra 13 pasienter. For kreft, ble 154 steder brukt, fra 64 pasienter. For perineural invasjon lesjoner, antall steder som brukes var 23, fra 11 pasienter. For β-catenin analyse med Definiens Tissue Studio, prosentandel og intensiteten av kjernefysiske farging i epitel og kreftvev ble kjøpt. Stroma ble ekskludert fra analysen siden β-catenin er hovedsakelig uttrykt i epitelceller. For analyse ble en modifisert Kjerner, membran og Celler løsning som brukes. Forstørrelsen og oppløsningen ble satt til 20x og 0,5 mikrometer /pixel, henholdsvis. En manuell ROI Utvalg (Tegn polygoner) ble brukt for normal, PIN, kreft, og perineural invasjon områder til separat analysere epithelial rommet. I normale, basal celler, som ble identifisert ved posisjon, morfologi og i henhold til CK5-farget seriemessig tilstøtende vev avsnitt, ble valgt hver for seg fra den luminale celler for analyse. I PIN, kreft, og perineural invasjon lesjoner, ble hele epithelial /cancer rommet valgt for analyse. Etter regioner av interesse ble valgt, ble separate kjerner og celler identifisert ved hjelp av manuelt innstilte parametere og terskler, etterfulgt av klassifisering av kjerner basert på manuelt satt terskler. For å identifisere kjerner og celler, «membran» ble valgt for IHC markør. For kjernen deteksjon, ble hematoxylin og IHC terskler satt til 0,055 vilkårlig enhet (a.u.) og 1,02 a.u. hhv. For påvisning av membraner og celler, ble IHC terskelen satt til 0 a.u., og membrantykkelsen til en piksel. Atomkjerner klassifisering terskler ble satt til å klassifisere en kjerne som har enten ingen, lav, middels eller høy immunhistokjemisk farging. Disse tersklene ble valgt individuelt basert på lysbilder fra en kontroll prostata vevsprøve brukes i alle fargekjøring, ved å identifisere den mørkeste og letteste atom farging. Den letteste farging ble brukt til å sette ingen /lav farging terskel, det høyeste farging ble brukt til middels /høy terskel, og verdien i mellom disse to tersklene ble brukt for lav /middels terskel. Atom terskler for ingen /lav farging varierte 0,3 til 0,4 au, lav /middels farging varierte 0,45 til 0,55 au, og middels /høy flekker varierte 0,6 til 0,7 au

Den histologiske Poengsummen ble beregnet fra følgende formel: 3X (% kjerner farget høy) + 2X (% kjerner farget medium) + 1X (% kjerner farget lav). Den histologiske poengsum ble bestemt for hvert enkelt sted som hadde blitt brukt for flimmerhårene analyse, og dette ble plottet mot prosent flimmerhårene. Det bør bemerkes at det finnes flere steder per pasient, og dette ble tatt hensyn til under statistisk analyse.

Statistisk analyse

Prosent prikk-celler og cilia lengder ble målt for individuelle celler av deltakeren og celletype: CK5 +, CK5-, og stromale celler. Scatter plott av prosent Cilierte celler og cilia lengder avdekket svært skjeve fordelinger. Som et resultat, er medianer rapportert i tabeller av sammendragsstatistikk. Statistisk signifikans ble vurdert ved hjelp av en lineær regresjonsmodell som gruppert på tilfeller for å kontrollere for flere observasjoner per deltaker. De avhengige variablene ble log transformert for å gjøre dem mer normal. Forskjeller mellom diagnostiske kategoriene ble oppnådd ved å montere indikatorvariabler for hver diagnose. Lineære trender i alvorligheten av diagnosen ble testet ved å montere diagnose som en kontinuerlig variabel. Sammenhengen mellom prosent flimmerhårene og Ki67 score på kreft ble utført ved hjelp av en ikke-parametrisk Spearman korrelasjon. Sammenhenger mellom prosent flimmerhårene og pasientdata ble kvantifisert ved hjelp av lineær regresjon. Analyse for forskjeller i atom β-catenin ble utført ved bruk av korrelasjon, lineær regresjon, og to-for-to tabeller. Alle analyser ble utført i STATA (StataCorp). En p-verdi på mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. De statistiske analysene kontrollerer ikke for multiple sammenligninger.

Resultater

Primær flimmerhårene uttrykk er redusert i preinvasive og invasiv prostatakreft

For å karakterisere hyppigheten av primær flimmerhårene i forskjellige alvorlighetsgrader av menneskelig prostatakreft, ble primære cilier nærvær fastsatt for de ulike vevstyper: kreft-fri normal vev, prostata intraepitelial neoplasi (PIN), kreft og perineural invasjons lesjoner (se tabell 1 for detaljer). Den første serie delen ble farget med H E for å identifisere områder av normal, PIN, kreft og perineural invasjon lesjoner. H E lysbildet ble brukt som referanse for å finne de vevstyper av interesse på den tilstøtende serie delen, som var farget for acetylert tubulin (Ac-Tub) for å visualisere primær flimmerhårene og γ-tubulin (γ-Tub) for å identifisere tilhørende centrosomes (Figur 1A og 1B). Primær cilia frekvens og lengde ble kvantifisert. Totalt 90,427 kjerner ble tellet med et gjennomsnitt på 20,782 kjerner telles per vevstype og en gjennomsnittlig utvalg av 248-1603 kjerner pr pasient (tabell S1A i tabell S1).

N (%)

Age på diagnose (år) n = 76 6020 (26,3) 60-6411 (14,5) 65-6926 (34,2) 70-7416 (21,1) 743 (3,9) Median = 65 Mean = 64 ± 7 Range = 46-77Gleason sum scoren = 75635 (46,7) 7-1040 (53,3) PIN grade * n = 24Low grade13 (54,2) Høy grade18 (75) Patologisk stagen = 77pT1-pT225 (32,5) pT352 (67,5) Volum av største tumor (cc) n = 25 3,08 (32) 3,0 til 6,09 (36) 06.01 til 09.04 (16) 9,1-122 (8) 122 (8) Median = 4 Mean = 6,3 ± 8,3 Range = 0.13-42Pre operativ gratis serum PSA (ng /ml)n=58 3.03 (5,2) 3,0 til 6,024 (41,4) 6,1 til 9,015 (25,9) 9,1 til 124 (6,9) 1212 (20,7) Median = 6,4 Mean = 11,2 ± 20,4 Range = 1.8-154Biochemical tilbakefall * * n = 78Yes44 (56,4) No34 (43,6) Tabell 1. Sammendrag av pasienten og kliniske data. product: * Syv pasientprøver har både lav karakter og høygradig PIN (prostata intraepitelial neoplasi). ** Biokjemisk tilbakefall definert som gratis serum PSA 0,1 ng /ml for to påfølgende målinger. Tid fra operasjon til sist registrerte PSA-målinger for pasienter uten biokjemiske tilbakefall varierer fra 12,5 måneder til 15,2 år, og for pasienter med tilbakefall tiden fra operasjonen til biokjemiske tilbakefall varierer fra 1,3 måneder til 13 1 år. CSV Last ned CSV

Tap av primær flimmerhårene ble sett i prostata preinvasive prøver (PIN, lavgradig (LG) og høyverdig (HG) kombinert). Median prosentandel av cilierte epitelceller i PIN (median = 5,7%) ble redusert 36% i forhold til normale epitelceller (median = 8,9%; p = 0,24; figur 1C, topp og tabell S1A i tabell S1). Selv om dette ikke er en statistisk signifikant forskjell, 70,8% av PIN-prøvene hadde et unormalt lavt (fallende på eller under 25

th persentil av normal, Q1) prosentandel av ciliated epitelceller (figur 1C, bunn og tabell S1B i Tabell S1). Det var også en generell betydelig lineær trend å redusere prosent flimmerhårene med økende alvorlighetsgrad av prostatakreft (p 0,0001, Tabell S1 A i tabell S1). Selv om denne modellen foruts økende alvorlighetsgrad fra normal, PIN, invasiv kreft, og deretter til perinevral invasjonen, erkjenner vi at ikke alle kreftutvikling i denne sekvensen. Det bør legges merke til at separering av de PIN-prøvene til LG og HG-grupper ikke avsløre en statistisk signifikant forskjell i prosent av cilierte celler gjennom hele studien, så LG og HG PIN ikke ble separert for ytterligere prosent cilia-analyser.

Legg att eit svar