Abstract
Bakgrunn
ovarialcancer (EOC) er den dødeligste gynekologisk kreftform i Forente stater. Dessverre, en validert protein biomarkør-screening test for å oppdage tidlig stadium sykdommen fra perifert blod ennå ikke er utviklet. Denne undersøkelsen vurderer muligheten for å identifisere kreft relevante proteiner fra eggstokkreft proksimale væsker, inkludert vev interstitiell væske (TIF) og tilsvarende ascites, fra pasienter med papillær serøs EOC og oversetter disse funnene til målrettede blodbaserte immunologiske analyser.
metodikk /Principal Funn
Paret TIF og ascites samlet inn fra fire papillær serøs EOC pasienter på tidspunktet for kirurgi gikk immunodepletion, oppløsning av 1D gel elektroforese og i-gel fordøyelse for analyse ved væskekromatografi-tandem massespektrometri noe som resulterte i en samlet identifikasjon av 569 og 171 proteiner fra TIF og ascites, henholdsvis. Av disse peroxiredoxin I (PRDX1) ble valgt for validering i serum ved hjelp av ELISA og påvist å være til stede og signifikant forhøyet (p = 0,0188) i 20 EOC pasienter med en gjennomsnittlig nivå på 26,0 ng /ml (± 9,27 SEM) sammenlignet 4,19 ng /ml (± 2,58 SEM) fra 16 pasienter med normal /godartet ovarian patologi.
Konklusjon /Betydning
Vi har benyttet en arbeidsflyt for høsting EOC-relevant proksimale biofluids, inkludert TIF og ascites, for proteomikk analyse. Blant de differensielt rikelig proteinene identifisert fra disse proksimale fluider, ble PRDX1 vist å være til stede i serum og vist ved hjelp av ELISA for å være forhøyet ved nesten seks ganger i papillær serøse EOC pasientene, i forhold til normale /godartede pasienter. Våre funn viser at lettvinte evnen til å oppdage potensielle EOC-relevante proteiner i proksimale væsker og bekrefte sin tilstedeværelse i perifert blod serum. I tillegg er våre funn av forhøyede nivåer av PRDX1 i serum av EOC pasienter versus normale /godartede pasienter garanterer videre evaluering som en svulst spesifikk biomarkør for EOC
Citation. Hoskins ER, Hood BL, Sun M, Krivak TC, Edwards RP, Conrads TP (2011) proteomikk Analyse av eggstokkreft proksimal Fluids: Validering av Forhøyet Peroxiredoxin 1 i pasient~~POS=TRUNC perifer sirkulasjon. PLoS ONE 6 (9): e25056. doi: 10,1371 /journal.pone.0025056
Redaktør: S. K. Batra, University of Nebraska Medical Center, USA
mottatt: 12 juni 2011; Godkjent: 23 august 2011; Publisert: 30.09.2011
Copyright: © 2011 Hoskins et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Økonomisk støtte ble levert av The Scaife Foundation Pilotprosjekt Program. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Om lag 22 220 kvinner får diagnosen hvert år med ovarialcancer (EOC) og over 13 000 dør av denne sykdommen [1]. Kvinner med EOC har en 5-års overlevelse på 18-34%, hvor dårlig prognose er først og fremst på grunn av det faktum at flertallet av pasientene stede med avansert stadium sykdommen [2]. Påvisning av tidlig stadium sykdommen med en optimal screening test ville ha en positiv innvirkning på total overlevelse; men det er ingen tilgjengelige biomarkører som er tilstrekkelig sensitiv eller spesifikk for utplassering av en egnet test for å være av nytte for screening av befolkningen. Mucin 16, også kjent som kreft antigen (CA) -125, ble oppdaget av antistoff-produksjon av tumor-xenografter [3] og kan lett detekteres i serum. En FDA-godkjent CA-125 immunoassay er i bruk for å overvåke sykdommen respons på kjemoterapeutisk behandling og tilbakefall; imidlertid, er ineffektiv for screening (en off-label bruk) for EOC i den generelle befolkningen måling av CA-125 [4]. Mens immundeteksjon av tumorassosierte antigener har bidratt til kunnskap om naturhistorien til sykdommen, deres tiltak har ennå til konsekvent å identifisere tidlig stadium EOC.
Høy throughput genekspresjonsanalyse av normal eggstokkvev forhold til EOC har avdekket unike gen signaturer uttrykt i EOC. Selv om disse signaturene har gitt ytterligere innsikt i molekylærbiologi av EOC, betyr genuttrykk ikke konsekvent korrelerer med protein overflod [5], spesielt i perifert blod, som representerer den mest klinisk relevant utvalg kilde for rutinemessig analyse utvikling og måling [6]. Mens proteomikk profilering av serum representerer en attraktiv metode for biomarkør oppdagelse, er denne strategien analytisk utfordrende på grunn av det høye dynamiske området av proteinkonsentrasjon i denne prøven, som hindrer oppdagelse av lavere overflod, tumor-relaterte proteiner. Som følge av den iboende analytiske utfordringer knyttet til serum proteomikk, har proksimale væsker fått økende oppmerksomhet for å gjennomføre kandidat protein biomarkører [7]. I tilfelle av EOC, representerer ascites en attraktiv prøve kilde for kandidat oppdagelse som bader den ikke-heftende kreftceller og tilstøtende mesothelial celler og inneholder rikelig informasjon, inkludert vekst, overlevelse og metastasesignaleringsfaktorer [8]. Mens ascites er et viktig medium for å gjennomføre protein biomarkører undersøkelser, mye som serum, den inneholder også proteiner tilstede over et stort dynamisk område av konsentrasjon som krever ulike fraksjoneringsteknikker til for å identifisere lavere rikelig proteiner [9].
tissue interstitiell væske (TIF) er en annen prøve som har fått økende oppmerksomhet som et substrat som kandidat protein biomarkører fra svulstvev kan gjennomføres. Tissue interstitiell væske er en proteinrik eksempelkilde som er antatt å inneholde skilles, skur og /eller effluxed proteiner fra svulsten og nabo stroma. Celis et al. var de første til å undersøke proteiner fra brystkreft og normal TIF [10], hvor det ble vist at proteiner identifisert ved MS-baserte proteomforskning kan bli eksternt validert i et vev microarray som inneholder over 70 brystcarcinom vevsprøver [11]. I en nyere undersøkelse, en MS-basert proteomikk arbeidsflyt for å identifisere forskjellig rikelig proteiner i nyrecellekreft (RCC) viste forhøyede nivåer av enolase 2 (ENO2) og thrombospondin-1 (TSP1) i tumor TIF. Disse ble også verifisert som tilstedeværende og ved forhøyet overflod i RCC-pasient serumprøver sammenlignet med kontrollserum [12]. Denne undersøkelsen viste at proteiner oppdaget i TIF har en høy tilbøyelighet for oversettelse til serumbaserte analyser.
I denne studien har vi benyttet en MS-basert proteomikk arbeidsflyt for å identifisere kreft spesifikke proteiner fra TIF og ascites fra EOC pasienter. Blant de differensielt rikelig proteinene identifisert fra disse proksimale fluider, peroxiredoxin 1 (PRDX1) ble vist å være til stede i serum og vist ved hjelp av ELISA for å være forhøyet ved nesten seks ganger i papillær serøse EOC pasientene, i forhold til normale /godartede pasienter. Vår studie gir ytterligere støtte til hypotesen om at TIF representerer en attraktiv proksimale biofluid for å gjennomføre kandidat biomarkører for eventuell tidlig deteksjon av EOC.
Resultater
Proteininnholdet utvinnes fra TIF og ascites ble visualisert ved oppløsning på en 1D-PAGE gel (Figur 1). En betydelig mengde av humant serumalbumin (HSA) var til stede i begge prøver, men ved lavere nivåer i TIF enn ascites. Denne høyere grad av HSA i ascites er viktig som den effektivt øker den samlede dynamiske området for proteinkonsentrasjon mellom den høyeste (for eksempel HSA) og laveste tallrike proteiner i denne prøvetype. En større representasjon av proteome er tydelig i TIF prøven på grunn av den lavere totale bidraget av HSA til det totale proteininnhold. Gitt de forskjellige bidrag av HSA i disse to prøver, undersøkelsen anvendes en affinitets-baserte immunodepletion protokoll for å fjerne de klassiske meget rikelig serumproteiner som er tilstede i hver prøve. Denne metoden resulterte i en effektiv fjernelse av en rekke meget rikelig proteiner som vist for en TIF prøve (figur 1), slik at for en mer fullstendig sammenligning av proteomikk innhold av ascites og TIF følgende LC-MS /MS-analyse.
(A) Representative ascites og TIF eksempler illustrerer tilstedeværelsen av tallrike proteinarter i begge prøver, så vel som kompleksiteten av høstet TIF prøven. (B) En representant TIF prøve før og etter immunodepletion med Agilent MARS Hu-14 immunoaffinitetskolonne.
Koblede ascites og TIF ble høstet fra fire pasienter (tabell 1), immunodepleted og tilsvarende proteinmengder hvert løst av 1D-PAGE. Hver gel kjørefelt ble kuttet i fem tilsvarende skiver, i-gel spaltet og peptidet fordøyer analysert ved LC-MS /MS i to eksemplarer, noe som resulterer i 10,274 proteinene identifisert på tvers av alle prøvene, inkludert de som er identifisert ved et enkelt peptid. Vi valgte å innføre en eksklusjonskriterium slik at bare de proteinene representert med to spektrale tellinger eller flere på tvers av alle fire pasientprøver fra enten TIF eller ascites ble beholdt for sammenlignende proteomikk dataanalyse, noe som resulterte i et datasett bestående av 569 og 171 proteiner identifisert i alle fire TIF og ascites pasientprøver, henholdsvis (Tabell S1, rå LC-MS /MS-datafiler er tilgjengelig for nedlasting fra Tranche dataregister på https://proteomecommons.org/tranche/). Oppfinnsomhet Pathway Analysis annotering av den cellulære lokalisering av proteiner identifisert avdekket en stor berikelse i cytoplasmic- og atom avledet proteiner i TIF i forhold til ascites (figur 2). Ikke overraskende, var en høy andel av ekstracellulære proteiner til stede i ascites sammenlignet med TIF. Ekstracellulære proteiner dominerte vanlige proteiner identifisert, med de aller fleste kommer fra ascites. Subcellulære proteiner vanligvis stammer fra TIF; disse proteinene var i høyere konsentrasjon i TIF med forminskede nivåer i ascites. Denne kontrast forskjell i opprinnelsen til cellulær lokalisering antyder at TIF inneholder proteiner sterkt reflekterende av den cellulære sammensetningen av vevet mikromiljøet.
Tissue interstitiell væske og ascites proteiner som ble identifisert av to eller flere spektrale teller i hver biofluid, respektfullt, ble analysert for cellulær compartmentalization med Oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA). Nesten 85% av TIF proteiner oppsto i cytoplasma og /eller kjernen. Ascites hadde serum-lignende protein profil med 66% av proteiner blir ekstracellulære opprinnelse.
Blant disse proteiner identifisert, peroxiredoxin 1 (PRDX1) ble identifisert i større overflod (et gjennomsnitt på 13 fold større spektral count) i TIF prøvene sammenlignet med ascites. Vi bekreftet tilstedeværelsen og differensial overflod av PRDX1 i begge biospecimens ved Western blot (Figur 3). Mens PDRX1 er rutinemessig identifisert og studert i vev, søkte vi å finne ut om overflod av PRDX1 ble forhøyet i serum fra en naiv kohort (f.eks ikke en del av vår opprinnelige funn sett) av 20 pasienter med stadium II eller høyere EOC (tabell 2) sammenlignet med pasienter med godartet ovarial patologi (tabell 3). Den midlere nivå av PRDX1 fra disse 20 EOC pasientene ble bestemt til å være 26,0 ng /ml (± 9,27 SEM) og 4,19 ng /ml (± 2,58 SEM) fra 16 kontroll /benigne eggstokkene populasjoner målt ved bruk av et kommersielt tilgjengelig PDRX1 ELISA. Dette tilnærmet seks ganger større overflod av PDRX1 i serum av EOC pasienter ble funnet å være statistisk signifikant (figur 4, p = 0,0188).
Peroxiredoxin en bekreftelse via Western blot-analyse i ascites (A) og TIF ( B) sammenfatter resultatene oppnådd ved den spektrale telling (SC) verdier målt fra væskekromatografi-massespektrometri-analyse av disse prøver.
serum fra 20 pasienter med diagnosen stadium IIC eller høyere kreft i eggstokkene ( tilfeller) og serum fra 20 pasienter med godartet ovarian patologi (kontroller) ble evaluert for PDRX1 tilstedeværelse og mengde av ELISA. Det var en statistisk signifikant forskjell mellom middel PDRX1 nivåer (p = 0,0188) i de to gruppene.
Diskusjoner
Presentasjon med abdominal fylde, tidlig metthet , et bekken masse og ascites er typisk for kvinner med EOC, dessverre men disse symptomer som ofte er tilstede bare når sykdommen er avansert i scenen. En screening test for å oppdage tidlig stadium eggstokkreft, når 5-års overlevelse er nesten 70-90% [13], har ennå ikke utviklet. Den lave forekomsten av tidlig stadium EOC utelukker omfattende studie av sykdom patogenesen, og dermed det meste av forskningen skjer i sent stadium sykdommen. Vi identifiserte kvinner med avansert EOC og samlet sammenkoblede ascites og TIF fra eggstokkene kreftsvulster fra hver pasient for proteomikk analyse. Ascites og TIF ble immunodepleted av meget rikelig proteiner før LC-MS /MS-analyse. Våre data indikerer at ascites og TIF havne svært forskjellige proteinprofiler. Ascites besitter proteomikk kjennetegn lik som serum, som stort sett består av proteiner fra den ekstracellulære rommet. Motsatt er TIF består av proteiner mer representativ for en vev mikromiljøet, med mange stammer fra ulike avdelinger fra celler.
I vår analyse, ble 569 proteiner identifisert i felles mellom alle pasient TIF prøver, sammenlignet med 171 proteiner vanlig identifisert i tilsvarende ascites væske. Blant disse, ble PRDX1 identifisert i større mengder i TIF-prøvene sammenlignet med ascites. TIF er antatt å inneholde en høyere relativ konsentrasjon av proteiner gjennom passiv /enzymatisk Shedding, sekresjon, efflux og apoptose. På en lignende måte ble de samme fremgangsmåter sannsynligvis resultere i «lekkasje» av noen eller alle av de samme proteiner inn i vaskulaturen og perifere sirkulasjon. Den observerte større grad av PRDX1 i TIF i forhold til ascites er ikke uventet for manifold biologically- og analytisk-relaterte grunner. Fra et biologisk synspunkt er TIF hovedsakelig avledet fra tumor mikromiljøet og dermed sannsynlig å inneholde høyere relative konsentrasjoner av tumor /stroma-avledede proteiner i forhold til andre perifere kroppsvæsker, slik som ascites og serum. Konsekvensen av denne forskjellen i dynamisk område av proteinkonsentrasjonen mellom disse kroppsvæsker senker effektivt det dynamiske området til proteinkonsentrasjon i ascites og /eller serum, sammenlignet med TIF. Av disse grunner, representerer inkludering av proksimale væsker som TIF i proteomikk-baserte biomarkører undersøkelser en roman strategi for høsting skur og utskilles proteiner proksimale til svulstvev mikro hvis tilstedeværelse er sannsynlig å bli reflektert i serum fra de samme pasientene.
PRDX1 er en allestedsnærværende vev-avledet protein med kjent funksjon som en antioksidant. PRDX1 beskytter i første rekke celler fra DNA-skade og potensiell mutagenese ved å danne alkoholer følgende enzymatiske reaksjon med reaktive oksygenarter (ROS), for eksempel hydrogenperoksyd og hydroksylradikaler [14]. PRDX1 er av spesiell interesse på grunn av sin kjente forhøyet nivå av genekspresjon i en rekke kreftformer [15], [16]. PRDX1 tilstedeværelse i karsinomer er assosiert med hemming av apoptose, tilsvarende økt tumor overlevelse [16], [17], [18]. Mens det er begrensede data med hensyn til PRDX1 og dens virkninger på EOC patogenese og kliniske utfall, Chung et al. har foreslått at PRDX1 ekspresjon i EOC er en prognostisk indikator for redusert overlevelse [19]. I tillegg er flere andre peroxiredoxin familiemedlemmer (PRDX2-6) antas å være knyttet til eggstokkreft kreftutvikling, der disse har blitt rapportert å være forhøyet i tvils ovarietumorer forhold til godartede eggstokkene lesjoner [20]. Maxwell et al. nylig gjennomført en stor skala proteomikk analyse av laser microdissected endometrial cancer vev og bemerket at selv trinn I endometrial kreft hadde forhøyede nivåer av proteiner involvert i oksidativt stress og inflammasjon sammenlignet med normal endometrium. PRDX1 var blant de oksidativt stress proteiner som ble validerte å være signifikant forhøyet i stadium I endometrial kreft vev [21]. I denne studien ble forekomsten av PRDX1 i TIF og ascites fra eggstokkene kreftpasienter verifisert av western blot å være forhøyet i overflod i TIF i forhold til ascites. Basert på hypotesen om at en undergruppe av TIF proteiner representerer skur /utskilte proteiner fra mikromiljøet og dermed kan være utskiftbart, og dermed synlig, innen perifert blod, forsøkte vi å finne ut nivåene av PRDX1 i blodet serum ved hjelp av en svært validert, kommersielt tilgjengelig ELISA. Disse resultatene viste at pasienter med fremskreden EOC hadde en 6-gangers forhøyet nivå av PRDX1 i deres serum sammenlignet med pasienter med normale /godartet eggstokkene (p = 0,0188).
Selv om PRDX1 ikke har blitt rapportert tidligere å være til stede i serum, basert på en hypotese om at noen (om ikke alle) TIF proteiner er utbyttbar med perifer sirkulasjon, benyttet vi en målrettet ELISA-basert tilnærming til første bekrefte denne hypotesen og sekundært til å stille spørsmålet om dette proteinet er forskjellig rikelig i serum fra pasienter med EOC i forhold til personer med godartede patologier i eggstokken. Vi begrenset denne eksterne validering av PRDX1 til serum fordi forhøyede nivåer av PRDX1 har allerede blitt vist i eggstokkreft vev av western blot og immunhistokjemi [19]. Ideelt sett er paneler av utvalgte biomarkører trolig nødvendig for å utvikle en validert screening test for tidlig EOC deteksjon [22], vår eneste fokus var å demonstrere gjennomførbarheten av å oversette MS-baserte proteomikk funnene fra TIF inn målrettede serumbaserte analyser, i dette tilfellet PRDX1. Vi erkjenner at vi ikke kan konkludere med at PRDX1 er tilstrekkelig følsom og spesifikk å bli betraktet som en screening biomarkør for EOC basert på vår begrensede validering prøve årsklasse, men at det er synlig og forhøyet i eggstokkreft pasientserum sammenlignet matchet godartede kontroller gir ytterligere støtte bevis til hypotesen om at protein kandidater oppdaget i TIF er sannsynlig å være til stede i perifer sirkulasjon.
Materialer og metoder
pasient~~POS=TRUNC
Forskningen ble utført under University of Pittsburgh Institutional Review Board godkjent protokollen # IRB0406147. Alle prøver ble oppnådd etter gjennomgang av skriftlig informert samtykke og ble avidentifisert ved henting og analysert anonymt. Intraoperativ samling av tumor, ascites og serum var fra pasienter med mistanke om kreft i eggstokkene ved tidspunktet for deres første operasjonen og oppstod i løpet av 30 min for kirurgisk fjerning. Alle pasientene var kjemoterapi og strålebehandling naive. Pasienter med avansert EOC (stadium IIC eller høyere) og patologi utprøvd papillær serøs ovarialcancer subtype ble valgt for utvalgets behandling og analyse. Serum som brukes til validering av PRDX1 var avledet fra en intern database med avidentifiserte pasienter klassifisert som å ha EOC eller godartet ovarian patologi. Clinicopathological detaljer om disse pasientene var begrenset til deres gynekologisk historie.
Prøve Processing
For behandling av TIF, ca 0,25-0,50 gram våt vekt av vev oppnådd ved kirurgi ble umiddelbart vasket to ganger for 5 minutter med 5 ml fosfatbufret saltvann (PBS). Vevene ble deretter inkubert i 1 ml PBS i 1 time ved 37 ° C. Etter inkubering, ble vev fjernet og TIF supernatanten ble klargjort av cellulært avfall ved sentrifugering ved 1000
x g
i 2 minutter og lagret ved -80 ° C. Ascites prøver ble aliquotted inn i mikrosentrifugerør, klaret ved 1000
x g
i 2 minutter og lagret ved -80 ° C. Total protein i TIF og ascites prøvene ble kvantifisert ved bicinchoninic (BCA) analyse (Pierce, Rockville, IL). Prøvene ble konsentrert ved hjelp MicroCon-3 sentrifugale filter enheter (Millipore, Bille, MA) i henhold til produsentens instruksjoner og utsatt for immunodepletion av de 14 mest tallrike serumproteiner ved hjelp av Multiple Affinity Removal System (Hu-14, Agilent Technologies, Inc., i Santa Clara, CA) i henhold til produsentens protokoll, med substitusjon av en 4 x prøvefortynningsbuffer snarere enn 1 x buffer for å forhindre mulig prøven tap på grunn av omfattende konsentrasjon av TIF og ascites. De utarmet TIF og ascites prøvene ble byttet inn 25 mM ammonium bikarbonat og protein ble kvantifisert ved BCA-analyse. Tilsvarende blodprøver ble oppsamlet i rød-top vakutainer venøs prøverør (Becton, Dickson and Company, Franklin Lakes, NJ), tillates å koagulere ved romtemperatur i 45 min, sentrifugert ved 2200
x g i 10 min
å samle serum og aliquotted og lagret ved -80 ° C.
i-gel Fordøyelse Protocol
ti mikrogram hver av ascites eller TIF ble vedtatt av 1D-PAGE og gelbåndene ble visualisert ved Coomassie blå. Fem gel bånd ble skåret ut jevnt over alle prøvene og avfarget i 25 mM ammoniumbikarbonat, 50% ACN. Gel Skivene ble redusert med 10 mM DTT ved 56 ° C i 1 time, etterfulgt av alkylering med 55 mM jodacetamid i 45 minutter ved romtemperatur i mørke. Prøvene ble fordøyet med trypsin over natten og peptider ble ekstrahert fra gel bånd med 70% ACN /5% maursyre. Alle prøvene ble lyofilisert til tørrhet og resuspendert i 0,1% trifluoreddiksyre før analyse ved hjelp av væskekromatografi (LC) -tandem massespektrometri (MS /MS).
massespektrometri og bioinformatiske Analyser
peptid ekstrakter fra hver prøve gel bånd ble analysert i duplikat på en Dionex Ultimate 3000 væskekromatografi system (Dionex, Sunnyvale, CA) som er koplet nettet via elektrospray ionisering til en lineær ionefelle (LTQ) MS (ThermoFisher Scientific, San Jose, CA). Separasjonene ble utført ved anvendelse av 75 pm id x 360 um od x 20 cm lang kapillarkolonner av smeltet silisiumdioksyd (Polymicro Technologies, Phoenix, AZ) oppslemming pakket i hus med 5 um, 300 Å porestørrelse C-18 silica-bundet stasjonær fase (Jupiter, Phenomenex, Torrance, CA). Etter prøveinjeksjon på en C-18-forkolonne (Dionex), ble kolonnen vasket i 3 minutter med mobil fase A (2% acetonitril, 0,1% maursyre) ved en strømningshastighet på 30 uL /min. Peptidene ble eluert ved anvendelse av en lineær gradient på 0,33% mobilfase B (0,1% maursyre i acetonitril) /minutt i 130 minutter, deretter til 95% B i ytterligere 15 minutter, alt ved en konstant strømningshastighet på 200 Nl /min. Kolonne vasking ble utført ved 95% B i 15 min for alle analyser, hvoretter kolonnen ble re-ekvilibrert i mobil fase A før påfølgende injeksjoner. MS ble drevet i en dataavhengig MS /MS-modus hvori hver hel MS scan ble etterfulgt av syv MS /MS-skanner som utføres i den lineære ionefelle (LIT) hvor de syv mest vanlige peptid-molekylære ioner ble valgt for kollisjon-indusert dissosiasjon (CID) ved hjelp av en normalisert kollisjonsenergi på 35%. Data ble samlet inn over en bred forløperion utvalg scan range (
m /z
375-1800) og dynamisk eksklusjon ble aktivert for å minimere overflødig utvalg av peptider tidligere valgte for CID.
Tandem massespektra det ble søkt mot Uniprot humant protein database (11/09 release) fra europeiske Bioinformatikk Institute (https://www.ebi.ac.uk/integr8), ved hjelp av SEQUEST (Bioworks 3.3.1, ThermoFisher Scientific). Søkekriterier ble satt som følger: peptider ble søkt fullt tryptiske med opptil to savnet cleavage nettsteder, dynamiske modifikasjoner av metionin oksidasjon (15,9949 Da) og cystein carboxyamidomethylation (57,0215 Da), forløperen masse toleranse på 1,4 Da og fragment ion toleranse på 0,5 Da . Peptider ble ansett legitimt identifisert hvis de møtte bestemt ladetilstand og proteolytiske cleavage avhengig krysskorrelasjons score på 1,9 for [M + H]
1+, 2.2 for [M + 2H]
2 + og 3.5 for [M + 3H]
3+, og et minimum delta korrelasjon på 0,08. En falsk peptid funnrate på mindre enn 2% ble bestemt ved å søke den primære tandem MS-data ved hjelp av de samme kriteriene mot en lokkedue database hvor proteinsekvenser reverseres [5]. Resultatene ble ytterligere filtrert ved hjelp av programvare som er utviklet internt, og forskjeller i protein overflod mellom prøvene ble beregnet ved å summere de totale CID hendelser som resulterte i et positivt identifisert peptid for et gitt protein tiltredelse tvers av alle prøvene (spektral telling) [23].
Western blot analyse
ti mikrogram total protein fra hver prøve ble løst ved 1D-PAGE bruker 4-12% Bis-Tris eller 7% Tris-acetat NuPAGE gels (Invitrogen Carlsbad, CA) og overført til Immobilon-PSQ PVDF-membraner (Millipore) ved hjelp av Invitrogen Xcell II blot Modul ifølge produsentens protokoll. Primært antistoff var rotte-monoklonalt anti-humant PRDX1 (Abcam, Cambridge, MA) og sekundært antistoff ble pepperrot-peroksidase-konjugert esel-anti-rotte (Abcam Cambridge, MA), pre-absorbert med serum. Membranene ble blokkert med 0,5% tørrmelk med TBS med 0,1% Tween-20 (TBST) som fortynningsmiddel. Primært antistoff ble påført ved 1:1000 i TBST og membraner ble inkubert over natten ved 4 ° C. Membranene ble vasket med TBST og inkubert med sekundært antistoff (1:75,000 fortynning) i 1 time ved omgivelsestemperatur. Membraner ble vasket med TBST og inkubert med Pico Super Signal ECL (ThermoFisher) i 5 minutter før kjemiluminescens eksponering.
Peroxiredoxin en ELISA
Nivåene av overflod av PRDX1 i pasientsera ble målt ved hjelp av den peroxiredoxin en menneskelig ELISA kit (BioVendor, Candler, NC) i henhold til produsentens instruksjoner. Serumprøver fra pasienter med kreft i eggstokkene og benign patologi ble fortynnet 1:03 før måling og ble analysert samtidig og i duplikat. Serielle fortynninger av PRDX1 standard ble analysert i parallell med serumprøver. Den optiske tetthet ble plottet mot standard PRDX1 konsentrasjoner for å generere standardkurven i henhold til produsentens protokoll. En ikke-parametrisk Wilcoxon rank-sum testen ble brukt til å bestemme betydningen av differansen mellom de midlere PDRX1 mengder i sera fra pasienter med godartet ovarial patologi i forhold til pasienter med fremskreden EOC. Nullhypotesen var at data i de to observasjonsgrupper er uavhengige prøver fra identiske kontinuerlige fordelinger med like median mot den alternative hypotesen, at gruppene ikke har like medianverdier. Signifikans ble akseptert på en tosidig p-verdi. 0,05
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
Proteiner identifisert fra fire ovarialcancer pasient matchet ascites og vev interstitiell væske (TIF). Listen av protein identifikasjoner (p) representerer de summerte spektrale tellinger (verdier) fra analyser av ascites og TIF, som hver ble løst ved denaturerende gelelektroforese enn fem gelbåndene var i gelen spaltet og analysert i duplikat ved væskekromatografi-tandem massespektrometri
doi:. 10,1371 /journal.pone.0025056.s001 plakater (XLS)
takk
forfatterne ønsker å takke Christopher Vanselow, Maria Vandamme og Agilent Technologies for 4 x Buffer A sammensetning som anvendes i den MARS uttømming protokollen. Forfatterne vil også gjerne takke verdifulle innspill fra de anonyme referees gjennom fagfellevurdering av denne artikkelen.
