Abstract
Bakgrunn
Galectin-3 er kjent for å regulere kreft metastasering. Imidlertid har den underliggende mekanisme ikke blitt definert. Gjennom DNA microarray studier etter galectin-3 stanse den, vi viste her at galectin-3 spiller en nøkkelrolle i opp-regulerer uttrykket av protease-aktivert reseptor-1 (PAR-1) og matriksmetalloproteinase-en (MMP-1) PAR-en og dermed fremme magekreft metastaser.
metodikk /hovedfunnene
Vi undersøkte uttrykket nivåer av Galectin-3, PAR-en, og MMP-1 i magekreft pasient vev og også effektene av stanse disse proteiner med spesifikke sirnas og over-uttrykke dem med bestemte lenti virale konstruksjoner. Vi har også ansatt sebrafisk embryo modell for analyse av
in vivo
magekreftcelle invasjon. Disse studiene viste at: a) galectin-3 stanse reduserer ekspresjon av PAR-1. b) galectin-3 over-uttrykket øker cellemigrering og invasjon, og denne økning kan reverseres ved PAR-en stanse, noe som indikerer at galectin-3 øker cellemigrering og invasjon via PAR-1 oppregulering. c) galectin-3 samhandler direkte med AP-en transcriptional faktor, og dette komplekset bindes til PAR-en promoter og driver PAR-en transkripsjon. d) galectin-3 forsterker også fosfor-paxillin, en PAR-en nedstrøms mål, ved å øke MMP-1 uttrykk. MMP-1 støydempere blokker fosfor-paxillin forsterkning og celle invasjon forårsaket av galectin-tre over-uttrykk. e) stanse av enten galectin-3, PAR-en eller MMP-en betydelig redusert cellemigrasjon til fartøyene i sebrafisk embryo modell. f) Galectin-3, PAR-en, og MMP-1 er sterkt uttrykt og samlokalisert i maligne vev fra mage kreftpasienter.
Konklusjon /Betydning
Galectin-3 spiller en nøkkel rollen aktivere celleoverflatereseptor gjennom produksjon av protease og øker magekreft metastaser. Galectin-3 har potensiale til å tjene som en nyttig farmakologisk mål for forebyggelse av magekreft metastase
relasjon:. Kim S-J, Shin J-Y, Lee K-D, Bae Y-K, Choi I-J, Park SH, et al. (2011) Galectin-3 Forenkler cellemotilitet i Gastric Cancer av Up regulerende Protease-reseptor-1 (PAR-1) og matriksmetalloproteinase-en (MMP-1). PLoS ONE 6 (9): e25103. doi: 10,1371 /journal.pone.0025103
Redaktør: Jean-Marc VANACKER, Institut de Génomique Fonctionnelle de Lyon, Frankrike
mottatt: May 18, 2011; Godkjent: 23 august 2011; Publisert: 22.09.2011
Copyright: © 2011 Kim et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av National Cancer Center (NCC) i republikken Korea tilskuddet (NCC-0910150 og NCC-0810060), Innovative Research Institute for Cell Therapy, republikken Korea (A062260) og denne forskningen ble støttet av den Basic442 Science Research Program gjennom National Research Foundation (NRF) finansiert av departementet for utdanning, vitenskap og teknologi (1031790-1), Sør-Korea. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft som sprer seg (metastaserer) fra opprinnelig sted til et annet område av kroppen, kalles metastatisk kreft. metastatisk kreft har dårlig prognose og høy dødelighet [1]. En full forståelse av den biologisk mekanisme (r) som er involvert i metastase og logiske metoder for å forebygge eller kontrollere metastasering kan føre til praktiske fremgangsmåter for forbedring av overlevelse av pasienter som lider av metastatiske kreftformer. I tidligere studier, fant vi at galectin-3 øker magekreft cellemotilitet med opptil regulerende fascin-en, en aktin-bunting cytoskeletal protein [2]. Galectin-3 er et 31 kDa karbohydrat-gjenkjenning protein som er involvert i tumorgenese, kreftcellevekst og metastase [3], [4], [5] og dens høy ekspresjon i flere humane kreftformer har blitt funnet å korrelere med dårlig prognose av metastatisk kreft.
for å klargjøre hvilken rolle galectin-3 i kreft metastase, vi banket ned sitt uttrykk i magekreftceller ved hjelp av siRNA og undersøkte resultatene i genuttrykk av DNA microarray analyse [6]. Blant tidligere resultater, fant vi betydelig reduksjon i nivået av protease-aktivert reseptor-1 (par-1), et medlem av familien av transmembran G-protein-koblede reseptorer [7], og dens aktivator, matriksmetalloprotease-1 ( MMP-1) (figur S1). Spaltede PAR-1 er auto-fosforylert og transdusert ved ekstracellulær signal (er) gjennom ulike veier, og spiller en avgjørende rolle i tumormetastase [7], [8], [9]. Over-uttrykk for PAR-en har blitt rapportert i flere kreftformer, blant melanomer, bryst og mage kreft. MMP-1 er også oppregulert i et bredt spekter av avansert kreft, og en signifikant negativ korrelasjon er blitt observert mellom dets ekspresjon og pasientoverlevelse [10], [11], [12], [13]. Også flere studier funnet at MMP-1 spiller en avgjørende rolle i metastasering av brystkreft [14], lever og tykktarm kreft [15], og mage kreft [16], [17], blant andre. Det ser ut til at når utskilt, MMP-1 fremmer kreftcelle invasjon gjennom nedbrytning av ekstracellulære matriser og /eller submucosale lag av lymfekar [10], [14]. Tallrike studier har vist at inhibering av MMP fører til hemming av celle invasjon [18], [19].
disse funn førte oss til hypoteser om at galectin-3, PAR-1 og MMP-1 kan være involvert i styrke migrasjon og invasjon av magekreft. For å teste denne hypotesen, gjennomførte vi studier for sin rolle i magekreftceller. I begge
in vitro Hotell og
in vivo
studier, brukte vi sebrafisk embryo modell for å bestemme deres effekter på migrasjon og invasjon av kreftceller med levende organeller. Vi har også bestemt uttrykket nivåer av galectin-3, par-1 og MMP-1 i ondartet vev fra mage kreftpasienter for kliniske sammenhenger mellom disse proteinene i humane prøver.
Resultater
Dempe galectin -3 eller PAR-en reduserer migrasjon og invasjon av menneskelige mage kreftceller
uttrykk nivåer av galectin-3 og PAR-en var høy i de fleste mage kreft cellelinjer. Vi forstummet galectin-3 og PAR-en i MKN-28 celler benytter de respektive sirnas. Behandling med galectin-3 siRNA redusert uttrykk nivåer av både galectin-3 og PAR-1, mens nedsatt PAR-1 siRNA behandling bare PAR-1-ekspresjon, mens ingen forskjell ble observert i galectin-3 (figur 1A). Transfeksjon av SNU-638-celler, som opprinnelig viser ingen uttrykk galectin-3, med galectin-3-kodende plasmid resulterte i økt ekspresjon av både PAR-1 og galectin-3 (figur 1B). Dempe enten galectin-3 eller PAR-en redusert totale antall av trekkende (
p
0,001) (figur 1C) og invadere celler (
p
0,001) (figur 1D), nesten det halve. Disse dataene viste at galectin-3 økte PAR-1 uttrykk og både galectin-3 og PAR-en modulert magekreft celle migrasjon og invasjon.
A, mRNA og protein uttrykk nivåer etter transfeksjon av human magekreft MKN- 28 celler med 20 nM scRNA eller sirnas av galectin-3 eller PAR-1. Total RNA og protein erholdt etter transfeksjon i 48 timer. Celler ble høstet og analysert ved RT-PCR og western-blotting. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. B, Protein nivåer av galectin-3 og PAR-1 av western blotting etter transfeksjon med pcDNA3.1 /NT-GFP-Galectin-3 og vektor kontroll av pcDNA3.1 /NT-GFP i SNU-638 celler. C, utført Cell migrasjon analysen av galectin-3 eller PAR-1 i forstummet MKN-28 celler. Resultatene var til stede som et histogram (*
p
0,001 vs. Cont gruppe), og celle bilder av celle migrasjon analyser. D, Histogram var til stede at mobil invasjon analyser av galectin-3 eller PAR-en i forstummet MKN-28 celler (*
p
0,001 vs. Cont gruppe).
galectin-3 forbedrer magekreft cellemigrering /invasjon ved å øke PAR-1-ekspresjonen
Vi undersøkte sammenhengen mellom galectin-3-induserte økninger i cellemigrering og invasjon på den ene side og PAR-1-ekspresjon på den annen hånd. Vi infisert SNU638 celler med en lentivirus inneholdende galectin-3-ekspresjonskassett, og undersøkt uttrykk for galectin-3 og PAR-1, og målte cellemigrering. Vi fant at over-ekspresjon av galectin-3 ble ledsaget av økt PAR-1 mRNA og protein uttrykk (figur 2A), samt cellemigrering (
p
0,001) (figur 2B) og celle invasjon (
p
0,001) aktiviteter (Figur 2C). Disse økningene ble redusert med PAR-en demping. Disse resultatene antydet at galectin-3 fremmet migrering og invasjon av magecancerceller via oppregulering av PAR-1.
A, mRNA og proteinnivåer av galectin-3 og PAR-1 påvist ved RT-PCR og western blot analyse i SNU-638-celler, infisert med lenti-virus inneholdende LacZ eller galectin-3, og deretter transfektert med PAR-1 siRNA eller scRNA for en negativ kontroll. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. B og C, migrasjon (B) og invasjons (C) analyser ble utført på SNU-638-celler infisert med lenti-virus inneholdende LacZ eller galectin-3-celler, og deretter transfektert med PAR-1 siRNA eller scRNA for en negativ kontroll. Resultatene ble vist som histogram (*
p
0,001 vs. Cont gruppe). D, Skjematisk modell av PAR-en promoter med AP-en bindingssetet, Primere som brukes til ChIP analysen var forberedt på å oppdage AP-en bindingssetet (-463~-474) -666 til -307. E, Galectin-3 samhandler med c-Jun og FRA-en (som en AP-en kompleks [20]) i MKN-28 celler. Immunoutfelling ble utført som beskrevet i «Materialer og metoder», og deretter galectin-3, c-Jun og FRA-1 påvises ved western blot-analyse. Helcellelysater (WCLs) ble anvendt som en positiv kontroll. F, Analyse av kromatin immunpresipitering assay ved anvendelse av antistoffer til galectin-3, c-Jun og Fra-1 i MKN-28-celler transfektert med scRNA og galectin-3 siRNA. PCR-primer for den PAR-1-gen-promoteren ble anvendt for å detektere promoter fragment i immunopresipitatene. Input lane, totalt genomisk DNA som anvendes som kontroll for PCR-reaksjonen. G, Luciferase-aktivitet av AP-1 i lacZ og galectin-3 over-uttrykkende celler. Luciferase assay ble utført med AP-1 uttrykk luciferase vektor transfeksjon til lacZ og galectin-tre over-uttrykke celler (*
p
0,001 vs. Cont). β-galactoside ble brukt som negativ kontroll.
Galectin-tre fremmer PAR-en transkripsjon gjennom interaksjon med AP-en kompleks
Vi har forsøkt å belyse hvordan galectin-3 regulerer PAR -1 uttrykk. Fordi det ble rapportert at AP-en transkripsjonen aktivitet reguleres av galectin-3 [20], fokuserte vi på hvilken rolle denne transkripsjonsfaktor i denne sammenheng (figur 2D). Vi utførte immunoutfellingsstudier og fastslått at galectin-3 direkte interaksjon med både Fra-en og c-Jun i AP-en kompleks, og at dette samspillet var forbundet med oppregulering av AP-1 transkripsjonen aktivitet (figur 2E). Deretter undersøkte vi DNA-bindende aktivitet av AP-1 med og uten galectin-3 av chip analyser (figur 2F). Vi fant at AP-1-komplekset bundet til promoteren av PAR-1 i nærvær av galectin-3, men ikke i dets fravær. Vi vurderte også den transkripsjonelle aktivitet av AP-1 av luciferase-assay etter transfeksjon av en reporter plasmid inneholdende AP-1 bindende sekvens foran en luciferase-driving minimal promoter i LacZ eller galectin-3 over-uttrykke SNU-638-celler (
p
0,001) (figur 2G). Den transkripsjonelle aktivitet av AP-en signifikant økt i galectin-3 over-uttrykkende celler, men ikke i LacZ-overuttrykkende celler. Disse resultatene antydet at galectin-3 til rette for binding av PAR-1-promoteren ved å samhandle med AP-1-komplekset, for derved å øke PAR-1-ekspresjonen av transkripsjonsregulering.
Galectin-3 øker ekspresjonen av MMP-1 og aktivering av PAR-1 signale
MMP-1 er blitt rapportert å regulere PAR-1-aktivering gjennom spaltning av PAR-1 tjoret intracellulær signalisering, og til å påvirke celle invasjon [21]. Som presentert i figur S1, viste vi at galectin-3 er regulert MMP-1-ekspresjon. Derfor fikk vi bekreftet sammenhengen av galectin-3, MMP-1 og PAR-en. Vi analyserte mRNA-ekspresjonsnivåene av MMP-9, som er et mål nedstrøms av PAR-1 [8], etter tie galectin-3, MMP-1 og PAR-1 enkeltvis (figur 3A). Mens galectin-3 stanse redusert ekspresjon av alle tre molekyler (MMP-1, PAR-1 og MMP-9), MMP-1 stanse redusert bare MMP-9 uttrykk og ikke de av galectin-3 eller PAR-1. Interessant, PAR-en stanse produsert de samme effektene som MMP-en demping. Vi har også oppdaget fosforyleringen av cytoskeletal protein paxillin (pY181), et kjennetegn på PAR-en aktiverings [22], [23]. Etter stanse galectin-3, MMP-1 og PAR-en individuelt ble phosphorylaion av paxillin redusert, noe som antydet galectin-3 også regulert PAR-en aktivitet. Vi har også sjekket reduksjon av MMP-9 aktivitet etter å kneble av galectin-3, MMP-1 og PAR-en individuelt (figur 3A).
A, galectin-3, PAR-en, MMP-1 og MMP-9 mRNA og galectin-3, PAR-en, MMP-1, fosfo-paxillin (pY181) og paxillin proteinnivåer etter transfeksjon med scRNA eller hver sirnas av galectin-3, PAR-en, MMP-1 i MKN-28 celler. Total RNA og protein erholdt etter transfeksjon i 48 timer og cellene ble høstet og analysert ved RT-PCR og western blot. MMP-9-aktivitet ble analysert ved zymografi gelatin ved hjelp av mediet av MKN-28-celler. B, mRNA ekspresjonsnivåer av galectin-3, PAR-1 og MMP-1 av RT-PCR; protein ekspresjonsnivåene av galectin-3, PAR-1, MMP-1, fosfo-paxillin (pY181) og paxillin ved western blot-analyse i SNU-638-celler, som ble infisert med lenti-virus inneholdende LacZ eller galectin-3, og deretter transfektert med MMP-1 siRNA eller scRNA for en negativ kontroll. C, invasjon analysen av SNU-638-celler infisert med lenti-virus inneholdende LacZ eller galectin-3-celler, og deretter transfektert med MMP-1 siRNA eller scRNA for en negativ kontroll. Dataene presenteres som histogram (*
p
0,001 vs. Cont gruppe).
Galectin-3 over-uttrykke SNU638 celler viste økt uttrykk nivåer av MMP-1 og PAR-1-proteinet, så vel som deres mRNAs, i tillegg til fosforylert paxillin (pY181). I disse cellene, MMP-1 stanse redusert fosforylering av paxillin uten å endre ekspresjonen av galectin-3 eller PAR-1 (figur 3B). Videre MMP-1 stanse redusert celle invasjon, som blir utløst av galectin-3 over-uttrykket (
p
0,001) (figur 3C), hvilket innebærer at galectin-3 økte MMP-1-ekspresjon som fører til aktivering av PAR-1-signalering.
over-ekspresjon av MMP-1 i kreftceller øker celle invasjon gjennom aktivering av PAR-1 signale
Vi bekreftet at oppregulering av MMP-1 av galectin-3 er viktig for aktivering av PAR-1-signalisering og økt magekreftceller invasjon. En lentivirus (pLECE3 Vector) inneholdende MMP-1 ekspresjonskassetten regulert av CMV-promoter ble fremstilt og infisert i AGS magecancerceller (Figur 4A-B). Som forventet, MMP-en over-uttrykk økt invasjonen potensialet av magekreftceller, og PAR-en stanse betydelig reversert denne økningen (
p
0,001) (figur 4B). Dette ble også bekreftet ved det faktum at over-ekspresjon av MMP-1 øket fosforylering av paxillin, og at ytterligere stanse av PAR-1 blokkert slik fosforylering (figur 4A). I MMP-1 overekspresjon celler, galectin-3 stanse redusert ekspresjon av PAR-1, men ikke den av MMP-1, og også fosforyleringen av paxillin og celle-invasiv potensial (figur 4A-B). Disse observasjonene antydet at overuttrykk av MMP-en økt kreftcelle invasivity ved aktivering av PAR-en signalering. Tatt sammen, disse resultatene antydet at galectin-3 økte ekspresjon av både PAR-1 og MMP-1, og at den økte MMP-1-ekspresjonen aktivert PAR-1-signalering, som i sin tur, lettes kreftcelle invasjon. Disse hendelsene er skjematisk vist i figur 4C.
A, protein uttrykk for galectin-3, PAR-en, MMP-1, fosfo-Paxillin (pY181) og paxillin nivåene ble målt ved western blot analyse, etter smitte med lenti-viral konstruksjon innehold pLECE3 (kun vektor) og pLECE3-MMP-1 i AGS celler, transfektert med galectin-3 eller PAR-1 sirnas. B, Cell invasjon utført av de ovennevnte celler til stede som et histogram (*
p
0,001 vs. Cont gruppe). C, Galecitn-3 forbedrer PAR-1 uttrykk via binding med AP-en transkripsjonsfaktor, også, galectin-tre regulering av MMP-1 uttrykk. MMP-en økning fører til doble effekten i magekreft invasjon; 1) spalting av PAR-en tethered ligand og PAR-en aktiverings 2) nedbrytning av ekstracellulære matriser (ECM).
stanse av galecin-3, PAR-1 eller MMP-1 blokker magekreftcelle migrasjon
in vivo
i en sebrafisk modell
Transgene sebrafisk,
Tg (kdrl: EGFP)
s843 product: [24], uttrykke EGFP spesielt i deres blodkar. De tilsvarende sebrafisk embryo er gjennomsiktig med grønne fluorescerende fartøy. Vi benyttet disse fiskene til å gjennomføre
in vivo
studier av human magekreft cellemigrasjon (figur 5A). Når den røde fluorescerende merket AGS celler ble injisert i plommesekken av sebrafisk embryoer ved 48 HPF (timer etter befruktning), de fleste av transplanterte AGS celler ble lokalisert i sentrum av plommesekken av embryoene etter 4 timer etter transplantasjonen ( hPT). Etter 26 HPT, både normale og scRNA transfekterte celler migrert inn trunk region, og bodde i fartøyet av bagasjerommet og /eller hale av embryoene 50 HPT. Imidlertid er antallet migrerte AGS-celler, hvori hver av galectin-3, PAR-1 eller MMP-1 er stilnet, betydelig redusert (figur 5B). Vi har også telles antall sebrafisk embryoer som viser migrerende celler, og resultatene er vist (figur S2). Åtti 4-93 prosent av sebrafisk embryoer som ble transplantert med kontrollceller eller scRNA behandlede celler viste celler migrerer inn i sine bagasjerommet og hale fartøy på 50 HPT. Men bare 7-11% av embryoer som ble transplantert med celler som galectin-3, PAR-en eller MMP-1 ble forstummet, vises trekkende celler. Disse resultatene antydet, at første, sebrafisk embryo modellen kan brukes til å overvåke overføringen av magekreftceller som et levende dyr, og for det andre at stanse av hver av galectin-3, PAR-1 og MMP-1 forårsaket signifikant reduksjon i magekreft cellemigrasjon
in vivo
.
A, 53 timer etter befruktning (HPF), de transplanterte AGS celler som transfektert galectin-3, PAR-en, MMP-1 siRNA og scRNA (rød) ble plassert i sentrum av plommesekken leve transgen sebrafisk som embryonale fartøyene er visualisert med grønn fluorescens på 4 timer etter transplantasjon (hPT); opp til 50 HPT var tydelig påvist bare kreftceller. B, ble Antall migrerte celler per embryo telles, og vist som histogram. Disse dataene ble hentet fra tre replikert eksperimenter.
Scale barer
, 200 mikrometer og 50 mikrometer i siste paneler. C og D, økt ekspresjon av galectin-3, PAR-1 og MMP-1 i magekreftpasienter. C, Expression og lokalisering av galectin-3, PAR-1 og MMP-1 i maligne vev fra mage kreftpasienter som bruker immunhistokjemiske staing (brun) med H E ved fluorescens mikroskopi. Forstørrelse: (øvre panel) × 200; (Nedre panel) × 400. D, mRNA av galectin-3, PAR-1 og MMP-1-nivåer i vev i mage kreftpasienter som detekteres ved hjelp av RT-PCR (figur S3). Maligne og normale vev ble oppnådd fra 20 pasienter med gastrisk utsettes for RT-PCR, kvantifisert og analysert ved NIH bildeanalysator. Høyere uttrykk nivåer av galectin-3, PAR-1 og MMP-1 i maligne vev er vist som prosent øker over deres nivå i normalt vev.
Uttrykk for galectin-3, PAR-1 og MMP -1 er forhøyet, parallelt i de ondartede vev av magekreftpasienter
Vi er fast bestemt på mRNA og protein uttrykk nivåer av galectin-3, PAR-1 og MMP-1 i normale og maligne vev fra 20 gastric kreftpasienter, deretter ansatt RT-PCR ved hjelp av et bilde J analysator. Som vist på figur 5C og fig S3, 73,7% av kreftpasienter viste høyere ekspresjonsnivåer av galectin-3 og 70% av dem viste høyere PAR-1 og MMP-1-nivåer i sine ondartet vev enn i deres normale motstykker. Videre blant galectin-3-positive pasienter, 71,4% var også PAR-1 positive, mens 64,3% var også MMP-1 positive (figur 5D). Disse data indikerer at det er en parallell økning i ekspresjonen av galectin-3, så vel som PAR-1 og MMP-1, i de ondartede gastrisk vev. Vi har også funnet at disse proteiner co-lokalisert i de ondartede områder av vev, og ikke i ikke-maligne områder (figur 5C). Galectin-3 var tilstede både i cytosol og kjernen, samtidig som PAR-1 og MMP-1 ble sett generelt i cytosol og membranen innenfor det samme område (figur 5C). Disse funnene antydet at både PAR-1 og MMP-1 uttrykk signifikant korrelert med galctin-tre uttrykk i mage kreftpasienter.
Diskusjoner
Denne studien viste at galectin-3 forbedret magekreft celle migrasjon og invasjon. Mekanistisk, dette er også koblet galectin-3 til oppregulering av PAR-1 celleoverflate-reseptor, og aktiviteten MMP-1 protease. Dette er i samsvar med rapporter som viser en sammenheng mellom uttrykk for PAR-1 og tumor invasjon og metastasering i mage og flere andre krefttyper [25], [26], [27]. Denne studien er den første til å demonstrere en direkte interaksjon av galectin-3 og AP-1 komplekse komponenter, c-Jun og Fra-en, og regulering av PAR-1 uttrykk ved AP-1 Transkripsjonsfaktor. Siden det allerede har blitt vist av andre, at over-ekspresjon av Fra-1 fremmer kreftcelleinvasjon og metastase [28], oppregulering av PAR-1 av c-Jun og Fra-1 syntes å være en mulig mekanisme for å forklare sammenhengen av galectin-3 indusert oppregulering av PAR-1 celleoverflate-reseptor, og aktiviteten MMP-1 protease. Denne muligheten er støttet av vår funn av parallelle og samlokalisert uttrykk for galectin-3 og PAR-en i maligne vev av magekreftpasienter.
Det er en roman observasjon at galectin-3 øker MMP-1 uttrykk . Det er klart at over-ekspresjon av MMP-1 kan øke gastrisk kreft celle invasjon aktivitet ved å blokkere celle til celle og celle til matriks-vekselvirkninger ved ECM degradering. Derfor kan en økning av MMP-1-ekspresjonen fremmet av galectin-3 har to virkninger, nemlig PAR-1-aktivering og ECM degradering, og begge er kritiske for magekreft metastasering. Men hvordan galectin-3 regulerer MMP-1-ekspresjonen er fremdeles uklart, fordi ekspresjon av MMP-1 er regulert av en serie av komplekse hendelser, inkludert krysstale mellom flere transkripsjonelle faktorer, slik som AP-1, signal transduser og aktivator av transkripsjon-3, MAP kinase, og hypoksi-induserbar faktor-1 i hypoksi [29], [30], [31].
Etablering sebrafisk (
Danio rerio
) embryo modell for studere migrasjon og invasjon av magekreftceller er en spesiell prestasjon med denne studien fordi egnede dyremodeller ikke var tilgjengelige for å studere menneskelig magekreft metastaser før nå. Sebrafisk modell for å studere genetisk manipulerte kreft og /eller tumorxenografter, har mange fordeler, blant annet muligheten for forover og revers genetiske analyser, åpenhet av embryoene [32], og egnethet for GFP merking av fartøyer [32], [33], [34]. Denne studien viste at RFP merket magekreftceller invadert blodkar mens galectin-3, MMP-1 eller PAR-1 stilnet magekreftceller ikke kunne. Dermed synes sebrafisk embryo for å være en lovende modell for å studere invasjon og metastasering av kreftceller, men videre studier er åpenbart nødvendig for å bekrefte disse funnene.
I konklusjonen, våre studier vist at galectin-3 akselerert magekreft cellemotilitet med opp-regulering av PAR-1 og MMP-1. Videre studier er klart behov for å etablere rollen galectin-3 i kreft metastase og sin egnethet som et terapeutisk mål for utvalgte kreftformer.
Materialer og metoder
Tissues
Pairs 2 mm store biopsiprøver ble innhentet fra adenokarsinom vev av 20 pasienter som gjennomgår diagnostiske endoskopi og endoskopisk submucosal disseksjon, ved National cancer center i Korea, etter å ha innhentet deres skriftlig informert samtykke. Vevsprøvene ble frosset i flytende nitrogen ved -70 ° C umiddelbart etter biopsi inntil bruk. Noen av vevsprøver ble paraffindized for immunhistokjemiske studier etter behov. Disse studiene ble godkjent av Institutional Review Board of National Cancer Center (# NCCNSH 03-024).
Cell Kultur og siRNA transfections
Moderat differensierte humane mage adenokarsinom cellelinjer, AGS, MKN- 28 og SNU-638 ble oppnådd fra Korea cellelinje Bank og opprettholdt som tidligere beskrevet [35]. sirnas brukes i transfections, ble alle levert av Invitrogen (Carlsbad, California). Deres sekvenser er galectin-3 (LGAL3) siRNA; 5′-AUAUGAAGCACUGGUGAGGUCUAUG-3 «, PAR-en siRNA; 5»-CCCAUCUGUGUACACCGGAGUGUUU-3 «, og MMP-1 siRNA; 5»-GGAGAAAUAGUGGCCCAGUGGUUGA-3 «. Transfections ble utført ved hjelp av Lipofectamine RNAiMAX reagens (Invitrogen), etter produsentens anvisninger. Induksjon av transient galectin-3-overekspresjon i SNU-638-celler ble oppnådd ved bruk av pcDNA3.1 /NT-galectin-3 med pcDNA3.1 /NT-GFP. For normalisering kontroll behandling, ble magekreft cellelinjer behandlet med 1 mikrogram av LTX reagenser (Invitrogen).
RNA isolering og RT-PCR-analyse
Total RNA ble isolert fra humane mage kreftceller og pasient vevsprøver, ved hjelp TRIzol Reagens (Invitrogen) etter produsentens anvisninger. Revers transkriptase PCR ble utført ved hjelp av en Reverse Transcription system (Promega Corp. USA), etter produsentens anvisninger. Primerne ble benyttet: 5′-ATGGCAGACAATTTTTCGCTCC-3 «(sense) og 5′-ATGTCACCAGAAATTCCCAGTT-3′ (anti-sense) for human LGAL3 (galectin-3) -genet; 5»-CCAAAACTGAGCATAAGTCC-3 «(sense) og 5′-AGGATGGAGCAAATGTAGTG-3′ (anti-sense) for human F2R (PAR-1) genet; 5»-ACAGCTTCCCAGCGACTCTA-3 «(sense) og 5′-CAGGGTTTCAGCATCTGGTT-3′ (anti-sense) for human MMP-1-genet; 5»-CTCGAACTTTGACAGCGACA-3 «(sense) og 5′-GCCATTCACGTCGTCCTTAT-3′ (anti-sense) for human MMP-9-genet; 5»-AGCCTCGCCTTTGCCGA-3 «(sense) og 5′-CTGGTGCCTGGGGCG-3′ (anti-sense) for human β-aktin-genet; 5»-GGCTGCTTTTAACTCTGGTA-3 «(sense) og 5′-ACTTGATTTTGGAGGGATCT-3» (anti-sense) for human glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH). PCR ble utført i en 20 ul volum ved anvendelse av en Ex Taq (Takara). Den amplifikasjonsrunder (denaturering 95 ° C i 1 minutt, annealing ved 60 ° C i 1 min og forlengelsestrinn ved 72 ° C i 2 minutter), ble gjentatt 32 ganger, etterfulgt av endelig forlengelse i 10 minutter ved 72 ° C.
Bygging av galectin-3 uttrykker lenti-viral vektor og infeksjon
full-lengde human galectin-3 uttrykker konstruere pcDNA3.1-NT-GFP-Gal3, den pcDNA3.1-NT-GFP vektor og den lenti-virale vektoren til å over-uttrykke LacZ, galectin-3 (1-250) i pLL3.7 er tidligere blitt beskrevet [2]. Menneskelig F2R ble klonet inn pLECE3 i BamH1 og Not1 restriksjonsenzymseter, skaper pLECE3-F2R (PAR-1) konstruere. Full-lengde cDNA av F2R, MMP-1, og kontroll mRFP ble anvendt for PCR-amplifikasjon, sammen med primere som er oppført i data S1, og resulterende PCR-fragmentene ble klonet inn i pLECE3 vektoren ved hjelp av Pac1 og Hpa1 restriksjonsenzymseter, skaper den pLECE3 -MMP-en konstruksjon. Dessuten ble det mRFP stedet av pGEM-T-Easy vektor overført til pLL3.7 vektor erstatte GFP regionen ved hjelp alder1 og EcoR1 restriksjonsenzymseter, for å gjøre pLL3.7-mRFP. Lenti-viral vektor produksjon er blitt tidligere beskrevet [2]
Western blot-analyse
cellelysat ekstraksjoner ble fremstilt med RIPA-buffer (1% NP-40;. 0,1% natriumdodecylsulfat; 0,5 % desoksykolat; 150 mM NaCl; 50 mM Tris, pH 7,5) og protease inhibiter cocktail. 20 ug totalt protein fra hvert lysat ble løst i 8-12% SDS-PAGE-geler og elektro-overført til PVDF-membran, og deretter blokkert i 5% skummet melk i 0,05% Tween-20 med 1 x PBS (PBST). Polyklonale primære antistoffer, anti-Galectin-3, anti-ThrombinR (PAR-1), anti-c-Jun, anti-Fra-1 og anti-β-aktin (Santa Cruz), anti-MMP1 (Calbiochem), anti- paxillin og anti-fosfo paxillin (pY181) (Epitomics) ble inkubert med blots ved 1:1000 fortynning i minimale volumer av 5% BSA (bovint serumalbumin) i PBST-buffer i 1 time romtemperatur eller over-natt i 4 ° C. Anti-mus eller anti-kanin geite-HRP-konjugerte sekundære antistoffer (GE Healthcare UK Limited) ble inkubert ved 1:5000 fortynning av 5% BSA i PBST-buffer i 1,5 timer ved romtemperatur. Proteiner av interesse ble oppdaget av forsterket kjemiluminescens (ECL) (Amersham Corp, Arlington Heights, IL, USA).
Immunpresipitasjon
cellelysat ekstrakter ble utarbeidet med IP + buffer (20 mM Hepes, 1 % Triton X-100, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 100 mM NaF, 10 mM natriumpyrofosfat, 1 mM natriumortovanadat, 0,2 mM PMSF, 10 ug /ml protease inhibitor cocktail) i is i 30 min. Etter at fjerningen av produksjonsavfall ved sentrifugering (13 200 rpm ved 4 ° C i 20 min), ble supernatantene kastet en preclearing trinn med protein-A /G-agarosekuler ved 4 ° C i 30 minutter i rotator. Supernatanter ble oppnådd etter en kort sentrifugering (2000 rpm ved 4 ° C i 4 min) ble underkastet immunoutfelling ved å bruke et anti-galectin3 og normal muse-IgG (negativ kontroll). Immunopresipitater ble vasket to ganger i IP-buffer (20 mM Hepes, 1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 100 mM NaF, 10 mM natriumpyrofosfat). Etter 30 pl 2 x SDS-prøvebuffer tilsetning, etterfulgt koker ved 95 ° C i 5 min. Etter supernatanter innhentet etter en kort sentrifugering, ble deres protein uttrykk nivåer fastsatt gjennom den vestlige blot analyse utført.
Immunohistochemistry
For galectin-3 og PAR-en immunhistokjemi, deparaffinized mage kreftpasienter vevsdelene ble forlatt i en mikrobølgeovn i 15 min i citrat-buffer (Vector Laboratories), og deretter inkubert med 3% H
2o
2 i 15 minutter for å blokkere endogen peroksidase, etterfulgt av inkubering med 10% normalt geiteserum (Vector laboratorier) i 1 x PBS i 10 min. Primære antistoffer ble brukt en anti-galectin-3 (1:200) anti-MMP1 (Epitomics) og anti-PAR-en (1:200) antistoffer (Santa Cruz), og neste trinn ble gjort i henhold til instruksjonene fra Vectastain®ABC kit (Vector laboratorier).
