Abstract
kreft biomarkører lette screening og tidlig oppdagelse, men er kjent for bare noen få krefttyper. Vi demonstrerte prinsippet om å indusere tumorer til å skille ut et serum biomarkør ved hjelp av en systemisk administrert genavlevering vektor som er rettet mot tumorer for selektiv ekspresjon av en manipulert kassett. Vi utnyttet tumor-selektive replikasjon av en betinget replikerende Herpes simplex virus (HSV) kombinert med et replikasjonsavhengig sen viral promoter for å oppnå tumor-selektive biomarkør ekspresjon som et eksempel genavlevering vektor. Virusreplikasjon, cytotoksisitet og biomarkør produksjonen var lav i hvilende normal human forhud keratinocytter og høy i kreftceller
in vitro
. Etter intravenøs injeksjon av virus 90% av tumorbærende mus oppviste høyere nivåer av biomarkør enn ikke-tumorbærende mus og ved obduksjon, vi har oppdaget virus utelukkende i tumorer. Vår strategi for å tvinge svulster til å skille ut et serum biomarkør kan være nyttig for kreft screening i høyrisikopasienter, og muligens for å overvåke respons på behandlingen. I tillegg, fordi onkolytiske vektorer for tumorspesifikk genavlevering er cytotoksiske, kan de komplettere screening strategi som en «theragnostic» middel. Kreften screening tilnærmingen presenteres i dette arbeidet introduserer et paradigmeskifte i nytten av genet levering som vi ser blir forbedret ved alternative vektorer rettet mot genet levering og uttrykk til svulster. Avgrense denne tilnærmingen vil innlede en ny æra for klinisk kreft screening som kan implementeres i den utviklede og uutviklede verden
Citation. Browne AW, Leddon JL, Currier MA, Williams JP, Frischer JS, Collins MH, et al. (2011) Cancer Screening ved systemisk administrasjon av en Gene Levering Vector Encoding Tumor-Selective utskillbare Biomarker Expression. PLoS ONE 6 (5): e19530. doi: 10,1371 /journal.pone.0019530
Redaktør: Syed A. Aziz, Health Canada, Canada
mottatt: 1 mars 2011; Godkjent: 31 mars 2011; Publisert: 11. mai 2011
Copyright: © 2011 Browne et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av CancerFree Kids Pediatric Cancer Research Alliance (AWB) og NIH pris 1R01-CA114001-01A2 (TPC). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
deteksjon Tidlig kreft er avgjørende for å forbedre kur priser fordi kreft stadium spår prognose. Kreft-assosiert blod biomarkører er blitt identifisert i noen kreftformer, slik som prostataspesifikt antigen (PSA) i prostata cancer og alfa-fetoprotein i noen lever og kimlinje-kreft. Biomarkører har ikke blitt identifisert for de fleste barn kreft og mange voksne kreftformer. Nye innovasjoner i systemisk genoverføring øke utsiktene til selektivt å levere og aktivere gener som koder for lett påvise biomarkører i kreftceller som ikke produserer kjente serum biomarkører. Vi har søkt å utvikle en prototypisk cancer screening strategi hvorved den genetiske informasjonen som koder for en universell serum biomarkør for kreft ville bli injisert i en pasient systemisk vil leveres til og uttrykt i tumorceller i en tumor-selektiv måte. Tumorer ville effektivt bli tvunget til å skille ut et serum biomarkør, som deretter kan bli målt i blod eller urin som et screening-test, mens tumorfrie pasienter ville vise ingen eller bare lave nivåer av biomarkør etter systemisk administrering av genet leveringsvektor (fig. 1a)
(a) trinn for kreft screening strategi er som følger:. 1) kreft målretting Herpes simplex virus (HSV) injiseres systemisk. 2) Engineered HSV selektivt replikerer i svulster mens blir fjernet fra friske ikke-kreft vev. 3) Biomarker selektivt produsert i svulster. 4) Blodprøver blir samlet og analysert for biomarkør nivåer. 5) Serumnivåer av eksogent levert biomarkør er høyere i tumorbærende mus enn friske tumorfrie mus. (B) Gene kart for vill-type HSV og romanen rekombinant RQ-M38G.
eksogent tilført gen-kodet biomarkører krever tumor-målrettet genet levering og /eller uttrykk. Målretting av små molekyler og partikler til tumorer kan oppnås ved passiv Enhanced Permeability og oppbevaring (EPR) [1], [2], [3], ligand-guided aktiv målretting [4], [5], [6], [7 ], tumor-mikromiljøet avhengig målretting [8], [9], [10], eller en kombinasjon av hver [11]. Virus er naturlig forekommende nanopartikler som er optimalisert for å levere genetisk informasjon i målcellene. Den store fordelen med virus enn ikke-virale vektorer for DNA levering er deres iboende forkjærlighet for replikasjon i tumorer og påfølgende forsterkning av signalet.
Herpes simplex virus (HSV) type 1 er en modell genet levering vektor fordi det kan infisere et bredt spekter av humane celletyper, transduce både skillevegger og hvilende celler effektivt, være konstruert for å uttrykke transgene produkter, akseptere transgener som drives av heterologe eller homologe promotere, er epigenomic, har skalerbar produksjon, og kan trygt bli kontrollert med antivirale medikamenter [ ,,,0],12]. Selektive mutasjoner i HSV gener gi kreft-selektive virusreplikasjon. Mutasjon i HSV gener som koder for ribonukleotidreduktase store subenheten (ICP6 /U
L39) og avdøde viral protein ICP34.5 (γ
134,5) begrenser robust virusreplikasjon til svulster [13], [14], [ ,,,0],15], har [16] og er vist å være trygg i kliniske studier. Aktivering av den strenge sent viral U
L38 gen er avhengig av foregående sekvensiell aktivering av umiddelbare tidlig og tidlig virale gener og cellulære transkripsjonsfaktorer [17] og U
L38 promoter (U
L38p) har blitt påvist som skal aktiveres selektivt på kreftceller i sammenheng med replikasjonskompetente γ
134,5
– /- HSV-mutanter [18]. Avhengigheten av sent genuttrykk ved aktivering av tidlige gener gjør U
L38p en sterk kandidat for levering av transgener til kreftceller med selektiv uttrykk i sammenheng med en dobbel mutant HSV mangler ICP6 og γ
134,5.
Vi utviklet et HSV som et eksemplar gen levering vektor for å indusere biomarkør sekresjon selektivt fra svulster. Andre har innarbeidet gener som koder utskillbare biomarkører til onkolytiske virus som journalister for virusaktivitet [19], [20], [21], [22] og genkassetter for ikke-invasiv monitorering virus levert gener [23]. Natrium-jodid symporter gener er kodet i onkolytiske virus også legge til rette for nukleærmedisin avbildning og behandling i infiserte tumorer [24], [25]. Nylig ble Gaussia luciferase (Gluc) identifisert og utviklet som en kraftig ny reporter molekylet [26] som er lett utskilles fra celler som gjør det nyttig for både
in vitro Hotell og
in vivo
applikasjoner der uttrykk kinetikk er av interesse. Vi ansatt Gluc som en prøve biomarkør for dette bevis på prinsippet fordi Gluc er 1000 ganger sterkere enn andre luciferases, er mer følsom enn utskillbare alkalisk fosfatase, og er synlig i blod og urin
in vivo product: [27], [ ,,,0],28]. Ved hjelp av en rettet rekombinasjon tilnærming [29], konstruerte vi et HSV-mutant, RQ-M38G, med Gluc under kontroll av den avdøde viruspromoter U
L38 (fig. 1b).
Vi har søkt å evaluere vår konstruert virale genavlevering vektor i dyremodeller for flere forskjellige tumortyper som dannes forskjellige steder: intraperitoneal, subkutan, intramuskulær og ortotopiske intrarenal tumorer. Etter systemisk injeksjon av vår genavlevering vektor (RQ-M38G) i blodet fra tumorbærende mus, observerte vi RQ-M38G fremstilling av kreftcelleavhengig cytotoksisitet og biomarkør produksjon. Vi har også registrert flere tilfeller der RQ-M38G var i stand til å tvinge mikroskopiske kreft byrder å produsere detectable blod biomarkør. Disse eksperimentelle studiene viste til prinsippet om å oppdage svulster ved å tvinge dem til å uttrykke en utskillbare biomarkør.
Resultater
In vitro
karakterisering av mutant HSV RQ-M38G
rQ-M38G-mediert Gluc transduksjon, replikasjon og cytotoksisitet ble testet ved å infisere en rekke celletyper med forskjellige viruskonsentrasjon og vurdering Gluc nivåer i kulturmediet (fig. 2a, fig. S1), virusgenomet kopitall (fig. 2b, fig. S2) og cytotoksisitet (fig. 2c, fig. S3) på dagene 2, 4 og 6 etter infeksjon. Cellereplikasjon avhengig cytotoksisitet ble observert i replikerende human forhud keratinocytter (HFK-r) mens cytotoksisitet ble svekket eller fraværende i differensiert /hvilende humane forhud keratinocytter (HFK-q) (Fig. S3). Vero, en afrikansk grønn ape nyrecellelinje som er kjent for ettergivende HSV replikering, viste høy Gluc uttrykk og RQ-M38G replikering følgende lavdose RQ-M38G infeksjon (MOI = 0,001, en virus per 1000 celler).
(a) Gaussia luciferase (Gluc) transgene ekspresjon, (b) virusreplikasjon, og (c) cytotoksisitet etter infeksjon av Vero-celler, og et panel av humane tumorcellelinjer med rQ-M38G (MOI = 0,001).
Vi vurderte transgene uttrykk, virusreplikasjon og cytotoksisitet følgende rQ-M38G smitte av 5 humane tumorcellelinjer. SK-NEP_Luc (Ewing sarkom) viste forhøyet Gluc uttrykk, virusreplikasjon og cytotoksiske mottakelighet ligner på Vero celler. Osteomet (Osteosarkom), STS26T_dsRed (MPNST), og S462.TY (MPNST) hver demonstrert lavere følsomhet i alle tre analyser. Til slutt, vurderte vi cytotoksisitet i 3 veletablerte musetumormodeller avledet fra et C57 /BL6 bakgrunn (fig. S3) og flere spontan murine skjoldbruskkjertelen eller småcellet lungetumorlinjer som genereres av en samarbeidspartner (data ikke vist). HGF116 (rhabdomyosarkom) var den eneste cellelinje som viser noen målbar cytotoksisitet, men bare ved en høy dose virus (MOI = 1, en infeksiøs virus per celle). Disse dataene identifisert SK-NEP_Luc som et ettertraktet mål for
in vivo
screening ved hjelp RQ-M38G mens andre menneskelige kreftcellelinjer ble spådd å være mindre mottagelig for screening med RQ-M38G.
Systemisk administrering av rQ-M38G for å identifisere tumor nærvær
Vi testet egnetheten av rQ-M38G som en genavlevering vektor for å tvinge tumorspesifikt sekresjon fra et biomarkør etter systemisk administrering av rQ-M38G i mus med og uten tumorer . Elleve mus ble injisert orthotopically med 10
6 SK-NEP_Luc celler til nyre subcapsule. Tumor-implanterte mus og kontrolltumorfrie mus ble deretter injisert intravenøst (i.v.) med 1,2 x 10
7 pfu av RQ-M38G 5 uker etter tumorimplanteringen. På dag 1, 4 og 7 etter virus injeksjon mus ble fotografert for å identifisere ildflue luciferase-positive tumorer og blodprøver ble samlet opp ved retro-orbital øye blø og analysert med hensyn på serum Gluc (fig. 3a).
In vivo
bilde identifisert 10 av 11 mus som fikk kreftcelle injeksjoner hadde dannet svulster (fig. 3b). En mus (# 9) aldri dannes en svulst og en mus (# 11) hadde en svulst som var nesten ikke påvisbar. I alle musene hvor tumorbelastning var tydelig (9 ut av 11), serum Gluc nivåene var 15 til 440 ganger høyere enn tumorfrie mus, mens serum Gluc fra de andre to mus forble under kontroll museserum Gluc nivåer (fig. 3). Derfor RQ-M38G administreres systemisk å indusere biomarkør produksjon ga en følsomhet på 90% for SK-NEP_Luc-bærende mus. Lignende resultater ble for svulster i ulike anatomiske områder (Fig. S4).
(a) Tid løpet av Gluc uttrykk i nyre subcapsule (RSC) SK-NEP_Luc bærende og tumorfrie mus injisert systemisk med 1,2 × 10
7 pfu eller rQ-M38G. Tall i legenden representerer individuelle mus. (B) Gluc uttrykk og
in vivo
avbildning av SK-NEP_Luc-bærende mus fire dager etter systemisk injeksjon av 1,2 × 10
7 pfu av RQ-M38G. Serum Gluc nivåer for mus injisert med svulst og kontroll som ikke fikk kreft injeksjoner (søylediagram), og
in vivo
luciferase avbildning av mus som fikk kreftcelle injeksjoner.
Å bestemme plasseringen av rQ-M38G i vev følgende iv injeksjon og bekrefter at serum Gluc signal som ble uttrykt av tumorer og ikke normale organer, ble organene høstet fra mus 7 dager etter infeksjon og virus utsatt for immunofluorescens for GFP uttrykk og kvantitativ PCR for virusgenomer. Bare tumorer viste GFP-ekspresjon i både kontroll (data ikke vist) og eksperimentelle mus (Fig. 4a) injisert systemisk med RQ-M38G. Kvantitativ PCR for virus genomet eksemplarer reflektert samme fordeling av virus i tumorbærende mus som ble sett med GFP uttrykk der viruskopier var minst 2100 ganger høyere i svulstene enn friske vev (Fig. 4b). Immunfluorescens og qPCR indikerer at virusinfeksjon dominerte i svulsten mens den er minimal i friskt vev. Derfor, systemisk administrert RQ-M38G lykkes med å identifisere tilstedeværelsen av SK-NEP_Luc tumorer ved å tvinge tumorer for å fremstille en utskillbare biomarkør. Vi viste lignende funn i tumormodeller som er mindre utsatt for virus infeksjon inkludert modeller av maligne perifere nerve slire svulster (i både subkutan og intraperitoneal steder) og osteosarkom (Tall S5, S6, S7).
(a) GFP immunofluoresence i SK-NEP_Luc bærende mus med og uten systemisk virus administrasjon. Mus som fikk virus (# 1 og # 2) viste selektiv GFP-ekspresjon i tumor, mens mus som mottok ikke noe virus (No Virus Control) viste globale GFP-negativitet. Scale bar = 15 mikrometer. (B) Biofordeling av virus i mus med SK-NEP_Luc tumorer etter systemisk administrasjon som bestemmes av qPCR for virale genomer.
Induksjon av Gluc uttrykk i svulster ved intratumoral virus injeksjon
En ble observert klar forskjell mellom SK-NEP_Luc og de tre andre tumormodeller testet som hvert viste lavere
in vitro
cytotoksisitet og Gluc uttrykk kombinert med lavere biomarkør uttrykk
in vivo
. For å finne ut om å levere større doser av viruset til svulster kan øke
in vivo
biomarkør uttrykk, vi administreres RQ-M38G direkte inn svulster ved intratumoral injeksjon i modeller av S462.TY og Osteomet.
Mus bærende subkutan flanke Osteomet svulster større enn 200 mm
3 ble injisert med 1,9 × 10
5 pfu av virus. Blodprøver ble tatt og analysert for Gluc ved hvert tidspunkt (Fig. S7a), mens to mus ble avlivet ved hvert tidspunkt, og analysert for virale genomiske kopier av qPCR (fig. S7b). Serum Gluc-nivåer i blodet fra mus som har svulster injisert med RQ-M38G var høyere enn Gluc nivåer i kontroll uinfiserte mus, og økende Gluc over tid føres en profil tilsvarende viruskopiantall i tumorer. Til tross for en 4000-fold genomisk forsterkning i tumorer, serum Gluc nivåene steg bare 10 ganger over infiserte kontroller. Intratumoral injeksjon med 8 × 10
3 pfu eller 8 × 10
7 pfu av virus ble gjentatt i S462.TY svulster når svulstene var større enn 500 mm
3. Fire dager etter i.t. injeksjon serum Gluc nivåer ble analysert som er plottet i fig. S8. Alle mus som mottok intratumoral injeksjon av virus demonstrert høyere Gluc nivåer enn tumorfrie kontroller uten en betydelig forskjell i Gluc konsentrasjon mellom lav dose og 10.000 gangers høy virus dose, noe som tyder på metning ved den lave dosen (i det minste til ved intratumoral rute).
Biomarker følsomhet
Små dyremodeller brukes til å oppdage minimal kreft byrder dagens teoretiske skalerbarhet utfordringer når oversette resultatene til menneskelig skala praktiske. For å møte disse utfordringene vi søkt å vurdere teoretiske deteksjonsgrenser for vår biomarkør basert på en
in vitro
analyse og oppdage små tumorbelastninger
in vivo
av 3 metoder: IVIS luminescens bildebehandlings, virus-mediert Gluc uttrykk i serum og post-mortem histologisk analyse. Blodvolumet i en mus er omtrent 2 ml (8% av den 25 totale kroppsvekten g [30]). Sfærisk SKNEP-Luc tumor består av 10
6-celler ble bestemt til å være 1,83 mm i diameter ved å måle volumet opptatt i en sentrifugert prøve av et likt antall celler, forutsatt at små svulster består hovedsakelig av tumorceller. Ti til 1 million celler ble sådd ut i 2 ml av cellekulturmedier og ko-infisert med RQ-M38G ved en MOI på 3 for å sikre at hver celle ville bli infisert. To dager etter infeksjon cellekulturmedier ble samlet og analysert for Gluc konsentrasjon. Virus-mediert Gluc uttrykket kan bli pålitelig løses ved samtidig transducing 1.000 celler, som tilnærmet en sfærisk svulst i diameter 183 mikrometer (Fig. S9).
Ewings sarkom svulster (SKNEP-Luc) av forskjellige størrelser ble etablert i 11 mus ved å injisere 10
6 celler i den venstre nyre subcapsularly i 3 grupper av mus på 3 sammenhengende uker. Mus med svulster som hadde utviklet seg over 2, 3 og 4 uker og 4 tumor-free kontroll mus ble infisert systemisk med 1 × 10
7 pfu av RQ-M38G. Fire dager etter infeksjonen ble musene avbildes via IVIS, ble blodprøver tatt for Gluc kvantifisering, og musene avlivet for histologisk tumor liming.
In vivo
bildebehandling for luciferaseekspresjon avslørt mus baring svulster drastisk forskjellige i størrelse på tidspunktet for infeksjon og offer (ekstreme eksempler er vist i fig. 5a). Serum Gluc-konsentrasjonen i tumor-bærende mus 4 dager etter infeksjon viste Gluc nivåer høyere enn tilsvarende infiserte tumorfrie kontrollmusene (Fig. 5b). Histologisk evaluering av svulster i hver mus avslørte en makroskopisk tumor og mikroskopisk tumor foci i mus
i
og
ii
henholdsvis (figur 5c.).
a)
in vivo
avbildning av to mus (
i
og
ii
) har veldig forskjellige SKNEP-Luc tumorbelastninger. b) konsentrasjonen Serum Gluc i mus I, II og fire kreftfrie kontroll mus 4 dager etter systemisk infeksjon med 1 × 10
7 pfu av RQ-M38G. c) Hematoxylin og eosin makroskopiske bilder av tumorbærende nyrene (T = svulst, skala barer = 1 mm) og innfellinger av mikroskopisk tumor foci i nyreparenchymet av mus
ii product: (skala bar = 200 nm).
Diskusjoner
Vi utviklet en ny kreftscreening strategi hvor svulster blir tvunget til å skille ut en biomarkør. Vi utviklet en betinget replicative HSV, RQ-M38G, selektivt tvinge kreftceller til å skille Gaussia luciferase som en demonstrasjon av denne screening strategi. Tumor-bærende dyr som er gitt intravenøs RQ-M38G uttrykte høye nivåer av biomarkør sammenlignet med tumorfrie dyr, som viste bare lav, bakgrunn uttrykk. Anvendeligheten av rQM-38G for screening syntes å være en funksjon av kapasiteten til en gitt tumor for å støtte HSV replikasjon. Uavhengig av tumortype eller plassering, tumor screening av RQ-M38G var svært følsom for nærvær tumor.
Et kritisk trekk for kreft screening er evnen til å detektere små svulster, til slutt i mennesker. En
a priori
bekymring var at små svulster kan være forbundet med mindre vaskulær areal tilgjengelig for HSV oppføring. Dette problemet synes ikke å være en begrensning på mus, fordi i noen av modellene var vi i stand til å påvise svulster så små som 4-5 mm i diameter (50 mm
3) og i en annen modell vi har oppdaget mikroskopisk tumorbyrde . Skalerbarhet for mennesker (med større blodvolum) er vanskelig å forutsi, men noen anslag er mulig.
In vitro
evaluering av et økende antall SKNEP-Luc tumorceller indikerer at infisere så få som 1000-celler i et volum av cellekulturmedier lik en museblodvolum utbytter påvisbart Gluc sekresjon. Derfor er samtidig ekspresjon av Gluc fra 1000-celler til enhver tid i en mus teoretisk påvisbar. Under disse betingelser som infiserer 10% av celler i en tumor med en diameter på 400 pm (10
4 celler) vil være synlig i en mus. Når skalert fra en mus til et menneske den teoretiske grensen for deteksjon økes ved et forhold på 1:2600 (25 mg mouse:65 kg menneske), og fortynning av biomarkør i en større gjennomsnittlig humant blodvolum på 4,7 L. Ved hjelp av disse tallene, den teoretiske grensen for deteksjon ved infiserer 10% av celler i en tumor blir endret fra en 394 um diameter masse i en mus til en 1-4 mm svulst diameter i et menneske. Hvis bare 1% av tumorcellene blir transdusert med virus, kan tumorer så små som 8,5 mm i diameter fremdeles være påvisbare ved hjelp av disse beregninger. Denne følsomhet antyder sterkt potensiale for å identifisere minimal tumorbelastninger selv når skalert til humane proporsjoner.
Muligheten av denne screeningstrategi for å avsløre tumorer er avhengig av virale faktorer, tumor-mikromiljøet, og biomarkør deteksjon begrensninger som hver kan være forbedret for virkelige verden praktiske. Her benyttet vi et dobbelt svekket HSV å gjennomføre en svulst spesifikk transduksjon og genuttrykk. Slike vektorer er allerede dokumentert å være trygt for menneskelig bruk [31]. Alternative virus med enkle eller mindre dempende mutasjoner vise større onkolytiske kapasitet er også allerede i kliniske studier (f.eks HSV1716, se www.clinicaltrials.gov, NCT00931931). Kobling dette screening strategien til mindre svekkede virus vil trolig diversifisere sin nytteverdi blant de ulike solide maligniteter samt øke den terapeutiske komponent. Agenter som er samtidig både diagnostiske og terapeutiske har fått navnet «theragnostic.» Det er mulig vår strategi kan bli videreutviklet ved bruk av en mer robust kreft-avhengige promotor å kjøre biomarkør uttrykk. Forbedret vektor leveransen til tumoren, kan også oppnås ved bruk av tumor målretting lite molekyl og nanopartikler opptak forbedrende strategier som nylig er beskrevet med bruk av internal RGD peptider [8]. Eventuell kommersialisering av vår foreslåtte screening strategi ville ha nytte av å bruke biomarkører som allerede er i utstrakt bruk som HCG (graviditetstest), PSA (prostata kreft) og αFP (lever og bakterie celle maligniteter). Biomarkør analysesensitiviteten i sammenheng med denne screeningstrategi kan likevel forbedre eksponentielt som blir realisert med microfluidic teknologier [32], [33], [34], [35].
En betydelig bekymring for den prototypiske cancer screening-metode utviklet i dette arbeidet er utviklingen av en immunrespons mot den genavlevering middel eller transdusert biomarkør som ville være til hinder for gjentatt bruk av screening. Tidligere arbeid på feltet har vist at pre-vaksinert dyr likevel oppleve terapeutisk nytte av HSV med vedvarende effekt [36]. Fordi 80% av befolkningen har vært utsatt for HSV, vil implementere denne deteksjon strategi med HSV avhenger effekten av konstruerte HSVs gitt til immunkompetente personer som tidligere har vært utsatt for vill-type HSV stammer.
In vitro
screening for musetumorcellelinjer viste at alle mus linjer vi testet viste forholdsvis lav mottakelighet for infeksjoner ved vårt svekket mutant virus, på linje med normale hvilende menneskeceller. In vivo modeller av HGF116 viste ingen virus følsomhet følgende i.t. eller intravenøst injeksjon. Dermed kan vi ikke vurdere vår kreft screening strategi i en immunkompetente modell til identifisering av musemodeller som er mer utsatt for menneskelig HSV. Implementering av denne strategien kan utvikle seg med ikke-virale vektorer [37] eller virale vektorer maskert i liposomer [38].
Utfordringen befolkningsdekkende kreft screening er utvikling av kliniske tester som er fiskalt praktisk, universell over et spektrum av krefttyper, og lett å implementere. Fysisk undersøkelse, mens rimelige, ofte ikke klarer å identifisere kreftformer som er dypt eller asymptomatisk. Imaging fordeler av høy følsomhet, men kan ikke alltid skille uspesifikke eller godartede massene fra ondartet sykdom (f.eks, kan lunge knuter være granulomer eller kreft), er økonomisk utfordrende og vanskelig å bredt gjennomføre. Med identifisering av egnede biomarkører, kan kreft screening potensielt være økonomisk levedyktig med automatisert pasientnær testing (POCT) teknologier (www.i-stat.com, www.biosite.com, www.siloambio.com [39]).
Dette arbeidet demonstrerer prinsippet om å indusere uttrykk for en utskillbare transgen i kreft ved hjelp av en systemisk administrert genet levering middel som en biomarkør for å screene for tumor tilstedeværelse. Romanen screening prinsippet foreslått og demonstrert i dette arbeidet kunne holde umiddelbare konsekvenser for pasienter med kjent kreftrisiko som genetiske predisposisjoner (BRCA-1, NF1 mutasjoner) eller pasienter med en historie med kreft som har høy risiko for tilbakefall. I siste instans kan eksogen administrering av en kreft målretting genavlevering middel (infeksiøs eller ikke) tvinge noen malignitet for å skille ut en biomarkør og kan brukes som en universell første skritt for populasjons bred kreft screening. Virkningen av denne tilnærmingen vil revolusjonere teknologien for diagnose av kreft i industrialiserte land og utviklingsland hvor bildebehandling og biopsi-basert diagnostikk ikke kan være så lett tilgjengelig.
Materialer og metoder
Cells og virus
humane tumorcellelinjer er blitt beskrevet tidligere [40], [41] eller ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), bortsett fra SK-NEP_Luc, som var en slags gave fra Jason Frischer (CCHMC, Cincinnati, OH). Celler ble dyrket i DMEM eller McCoys 5A medium (ATCC, SK-OV-3 SK-NEP_Luc) med 10% føtalt bovint serum (Hyclone, Logan, UT) og penicillin /streptomycin (Life Technologies, Carlsbad, CA). Mus C57 /BL6 cellelinjer LLC
GFP [42] (Lewis lungekarsinom) og B16-BL6 (melanom) var snill gaver fra Joe Palumbo (CCHMC, Cincinnati, OH) og HGF116 (rabdomyosakrom) ble avledet fra en genmodifisert mus. Primær human forhud keratinocytter (HFK) var en slags gave fra Susa Wells (CCHMC, Cincinnati, OH), dyrket i EpiLife Media (Cascade Biologics, Portland, Oregon) og differensiert i hvilende keratinocytter med 10% FBS og 1 mmol /L CaCl
2 [43]
rQ-M38G ble konstruert som følger: a. U
L38 promoter ble isolert fra HSV rRp450 ved PCR ved anvendelse av primere utformet tidligere [18] som ble modifisert til å inkludere en 5 « Bglll og 3 «Hindlll setene (F1, R1 i tabell S1) og klonet inn i Bglll og Hindi områder av pCMV-Gluc (Invitrogen), utskifting av CMV arrangøren. Den U
L38p-Gluc kassett ble forsterket av PCR PU
L38p-Gluc med inkluderingen av en 5’SpeI og 3 «EcoRI og klonet i Spel-EcoRI-setene av «HSV-Quick» shuttle plasmid, PT-OriSIE4 /5 [29] (en slags gave fra Yoshinaga Saeki, The Ohio State University, Columbus, Ohio), der Oris (E4 /5 Kpnl fragment hadde blitt fjernet. det resulterende plasmid, PT-U
L38p-Gluc, ble anvendt i det HSVQuick BAC systemet til å generere rQ-M38G [29]. Primere for PCR-analyse og sekvensering er vist i Tabell S2. virus ble formert og titrert [44] ved plakk-analyse på Vero-celler. Celle cytotoksisitet ble bestemt i 96-brønners vevkulturplater ved hjelp av en modifisert MTS /PMS assay (Promega, Madison, WI).
Gaussia luciferase-assay
Gluc-aktivitet ble målt på 10 ul prøver av vevskultur media eller serum ved kjemiluminescens analyse [45] på en autoinjecting luminometer ved å injisere 50 mL av 50 mikrometer coelenterazine (Prolume, Pinetop, AZ) til hver prøve i tre eksemplarer og integrere signalet i 2,5 sekunder [26].
virus biofordelingsstudier
Dyrestudier studier~~POS=HEADCOMP ble godkjent av Cincinnati Children Hospital Institutional Animal Care og bruk Committee (Animal protokoll # 9D12095). 5-6 uker gamle Balb /c atymiske nakne mus (Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN) ble injisert med 1-5 millioner celler. Celler ble fremstilt i 33% Matrigel (Becton Dickinson, Bedford, MA) og 66% fosfat-bufret saltvann (PBS, pH 7,4) for subkutan (s.q.) injeksjon og PBS bare for renal subcapsule (r.s.c) eller intraperitoneal (i.p.) injeksjon. Virus doser er beskrevet i teksten. Virus ble suspendert i 100-150 mL PBS for nålevenen injeksjoner og 50-100 mL PBS for intratumorale injeksjoner, som ble fordelt i 5 fraksjoner hele svulsten.
Tissue forberedelse og immunfluorescens
Vev ble fikset, forankret, og skåret i 12-micron seksjoner ved hjelp av standard prosedyrer. Snittene ble permeablized med 0,2% Triton-X i PBS i 10 minutter, blokkert i 10% normalt geiteserum i 60-90 minutter, og inkuberes med kylling anti-GFP (# 16901, Millipore /Chemicon, Billerica, Massachusetts) i 60 minutter , skylles tre ganger med PBS, og inkubert med sekundært antistoff (geite-anti-kylling FITC, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA), skyllet med PBS, og montert med Fluoromount-G (elektronmikroskopi Sciences, Hatfield, PA). Alle lysbildene ble så fotografert med OpenLab bildebehandling (Impro, Waltham, MA) på en invertert fluorescerende Zeiss mikroskop.
HSV genomet kvantifisering
DNA ble isolert fra mus vev ved hjelp av Gentra Puregene DNA kit (Qiagen, Valencia, CA) og kvantifisert ved hjelp av Nanodrop 2000 spektrofotometer (Thermo Scientific, Wilmington, dE). Real-time PCR ble utført ved hjelp av ABI 7500 system (Applied Biosystems, Foster City, California) [46]. Standarder ble laget av renset HSV1716 viral DNA.
RQ-M38G genuttrykk og replikering studier i cellelinjer
Celler ble smittet i 12-brønners skåler for en time og høstet til tider indikert. 100 ul av cellesuspensjonen ble anvendt for å måle Gaussia luciferase, mens den gjenværende cellesuspensjonen ble utsatt for tre sykluser med frysing og tining og sentrifugert ved 20 000 x g. Pelletene ble resuspendert i 200 pl PBS. DNA ble isolert ved hjelp av DNeasy blod og vev kit (Qiagen, Valencia, CA). Fast real-time PCR ble utført ved hjelp av 7900HT Fast Real Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, California). Standard DNA eller DNA ekstrahert fra infiserte celler (40 ng) ble tilsatt til 10 ul av SYBR Premiks Ex Taq II Kit (Takara, Otsu, Shiga, Japan), 1,6 ul av en tymidin-kinase-primer-blanding (TK 290-F: 5 « TCG CGA ACA TCT ACA CCA CAC AAC; TK 400-R: 5 «CGG CAT AAG GCA TGC CCA TTG TTA; hver ved 400 nM), 0,4 ul Rox (Takara) og PCR-grad vann til et sluttvolum på 20 ul per reaksjon. PCR var en syklus på 95 ° C i 30 sekunder, 40 sykluser av 95 ° C i 3 sekunder, 60 ° C i 15 sekunder og 72 ° C i 25 sekunder.
In vivo
bildebehandling
Mus ble injisert ip med 150 mg /kg av D-luciferin (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) og avbildes ved IVIS200 (Calipur Lifesciences).
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
