Abstract
Aberrant akkumulering av intracellulær β-catenin er en anerkjent karakteristisk for flere kreftformer , inkludert prostata, tykktarm og lever kreft, og er et potensielt mål for utviklingen av kreftbehandling. Her har vi brukt cellebasert lite molekyl screening for å identifisere CGK062 som en inhibitor av Wnt /β-catenin signalering. CGK062 fremmet protein kinase Cα (PKCα) -mediert fosforylering av β-catenin på Ser33 /Ser37, merking det for proteasomal degradering. Dette reduserte intracellulære β-catenin nivåer og dermed antagonized β-catenin respons transkripsjon (CRT). Farmakologisk hemming eller uttømming av PKCα avskaffet CGK062-mediert fosforylering og degradering av β-catenin. I tillegg CGK062 trykt uttrykket av gener som koder for cyklin D1, c-myc, og Axin-2, β-catenin målgener, og dermed hemmet veksten av CRT-positive cancerceller. Videre behandling av nakne mus som bærer PC3 xenograft tumorer med CGK062 i doser på 50 mg /kg og 100 mg /kg (i.p.) i betydelig grad undertrykket tumorvekst. Våre funn tyder på at CGK062 utøver sin anticancer aktivitet ved å fremme PKCα-mediert β-catenin fosforylering /degradering. Derfor har CGK062 betydelig terapeutisk potensiale for behandling av CRT-positive kreft
Citation. Gwak J, Lee JH, Chung YH, Song GY, Oh S (2012) lite molekyl-Based Markedsføring av PKCα-mediert β-catenin Nedbrytning Undertrykker spredning av CRT-positive kreftceller. PLoS ONE 7 (10): e46697. doi: 10,1371 /journal.pone.0046697
Redaktør: Manfred Jung, Albert-Ludwigs-universitetet i Tyskland
mottatt: 30 januar 2012; Godkjent: 07.09.2012; Publisert: 05.10.2012
Copyright: © Gwak et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Basic Science Research Program gjennom National Reserch Foundation of Korea (NRF) finansiert av departementet for utdanning, vitenskap og teknologi (2012R1A2A2A01002941). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Wnt /β-catenin sti, som aktiveres av et samspill av Wnt1, Wnt3a, og Wnt8 med frizzled (FZ) reseptorer og low-density lipoprotein reseptor-relaterte protein5 /6 (LRP5 /6) co -reseptorer, spiller viktige roller i celleproliferasjon, differensiering og onkogenese [1]. Sentralt i denne reaksjonsvei er nivået av cytosoliske β-catenin, noe som regulerer dens målgener. I fravær av en Wnt signal, blir β-catenin fosforylert av både kasein kinase 1 (CK1) og glykogensyntasekinase-3β (GSK-3β), som danner et kompleks med adenomatøs polyposis coli (APC) /Axin (ødeleggelse kompleks) . Dette blir så gjenkjent av F-box β-transducin repeat-inneholdende protein (β-TrCP), en komponent av ubiquitin ligase kompleks, noe som resulterer i nedbrytning av β-catenin [2] – [4]. Aktivering av reseptoren ved dens wnt ligander regulerer negativt ødeleggelse komplisert og fører til cytoplasmatisk β-catenin stabilisering [5].
unormal aktivering av Wnt /β-catenin veien og påfølgende oppregulering av β-catenin respons transkripsjon (CRT) er antatt å bidra til utvikling og progresjon av visse typer kreft [6]. Onkogen mutasjon i β-catenin eller andre komponenter i ødeleggelse komplekset (APC eller Axin) observeres i tykktarmskreft, hepatocelluar karsinom, og prostatakreft [6] – [8]. Disse mutasjonene fører til overdreven opphopning av β-catenin i cytoplasma og deretter β-catenin blir translokert til kjernen, hvor den komplekser med T-celle-faktor /lymfocytt forsterker faktor (TCF /LEF) familie transkripsjonsfaktorer for å aktivere ekspresjon av Wnt /β-catenin responsive gener, for eksempel
c-myc
,
cyclin D1 Hotell og metalloproteinase-7 (
MMP-7
), som spiller viktige roller i tumorigenesis og metastase [9] – [11]. Oppbyggingen av β-catenin er også observert i andre typer av kreft, slik som ovariekreft, melanom, livmorkreft, medulloblastom, og pilomatricoma [6] – [8]. Dermed avvikende aktivering av Wnt /β-catenin veien er en potensiell terapeutisk mål for chemoprevention og behandling av ulike kreftformer.
I denne studien identifiserte vi CGK062, som markert hemmer Wnt /β-catenin veien og celleproliferasjon av CRT-positive cancerceller. CGK062 fremmet degradering av intracellulære β-catenin gjennom PKCα-mediert β-catenin fosforylering.
Resultater
Identifikasjon av CGK062 som en hemmer av Wnt /β-catenin veien
for å identifisere lavmolekylære antagonister av Wnt /β-catenin vei, brukte vi HEK293 reporter celler som stabilt næret TOPFlash reporter og menneske frizzled-1 (HFZ-1) plasmider. Etter inkubering av disse rapportør celler med Wnt3a-CM og hver forbindelse har vi målt ildflue luciferase-aktivitet ved anvendelse av en mikroplateavleser, og deretter identifisert som CGK062 (3- (3,4-dihydroksy-fenyl) -akrylsyre-2,2-dimetyl- 8-okso-3,4-dihydro-2H, 8H-pyrano [3,2-g] kromen-3-yl-ester) som en inhibitor av Wnt /β-catenin pathway (figur 1 A, B og S1). Som vist på figur 1C, behandling av HEK293 rapportør celler med forskjellige konsentrasjoner av CGK062 resulterte i en doseavhengig reduksjon i β-catenin respons transkripsjon (CRT) som var blitt indusert av Wnt3a-CM (IC
50 = 12,3 pM) . CGK062 påvirket ikke FOPFlash aktivitet i HEK293 kontrollceller og cellelevedyktigheten i HEK293 rapportør celler (figur 1C og S2A). NF-kB og p53 reporter aktiviteter ble ikke påvirket av CGK062 (figur S2B og S2C). Disse resultatene tyder på at CGK062 en potent og spesifikt hemmer Wnt /β-catenin veien.
(A) Undersøkelse av forbindelser som inhiberer Wnt /β-catenin pathway. Forbindelser moduler TOPFlash reporter aktivitet ble undersøkt ved hjelp av HEK293 reporter celler. Kontrollene ble analysert i nærvær eller fravær av Wnt3a-CM. (B) Kjemisk struktur av CGK062. (C) Doseavhengig inhibering av β-catenin respons transkripsjon. HEK293 rapportør celler ble inkubert med angitte konsentrasjoner av CGK062 i nærvær av Wnt3a-CM. Etter 15 timer, ble luciferase aktiviteter bestemmes og rapporteres som relativ lysenhet (RLU) normalisert til celle titer. Resultatene er gjennomsnittet av tre forsøk, og viser linjene standardavvik. *,
P
0,05, og **,
P
0,01, sammenlignet med Wnt3a-CM-behandlet kontrollgruppe. (D) cytosoliske proteiner ble fremstilt fra HEK293 rapportør celler behandlet med enten bærer (DMSO) eller indikerte konsentrasjoner av CGK062 i nærvær av Wnt3a-CM i 15 timer og deretter underkastet Western blotting med β-catenin antistoff. (E) Semi-kvantitativ RT-PCR for β-catenin, og GAPDH ble utført med total RNA fremstilt fra HEK293-celler rapportør enten bærer (DMSO) eller indikerte konsentrasjoner av CGK062 i nærvær av Wnt3a-CM i 15 timer. (F) cytosoliske proteiner fremstilt fra HEK293 rapportør celler som ble inkubert med bærer (DMSO) eller CGK062 (25 uM) i nærvær eller fravær av Wnt3a-CM, utsatt for MG-132 (10 uM) i 8 timer, ble underkastet Western blotting med anti-β-catenin antistoff. I (D) amd (F), for å bekrefte lik belastning, ble blot reprobed med anti-aktin antistoff.
I Wnt /β-catenin vei, er CRT i stor grad avhengig av nivået på intracellulær β-catenin, noe som er kontrollert av ubiquitin-avhengig proteolyse [12]. For å undersøke effekten av CGK062 på det intracellulære nivå av β-catenin, analyserte vi mengden av cytoplasmatiske β-catenin ved Western blotting med anti-β-catenin antistoff i CGK062-behandlede HEK293 rapportør celler. Nivået av cytoplasmatiske β-catenin, noe som var blitt akkumulert av Wnt3a-CM, ble dramatisk redusert ved behandling av CGK062 (figur 1D), som er i overensstemmelse med den CRT resultat. For å undersøke hvorvidt reduksjonen av cytoplasmatiske β-catenin protein av denne forbindelsen var på grunn av reduksjon av β-catenin mRNA-nivå i HEK293-celler rapportør, utførte vi semi-kvantitativ RT-PCR for å bestemme mengden av β-catenin mRNA. Som vist i figur 1E, gjorde β-catenin mRNA nivå ikke endres i respons til forskjellige konsentrasjoner av CGK062 i HEK293-celler rapportør.
neste, for å utforske hvorvidt nedregulering av β-catenin ved CGK062 er mediert av proteasome brukte vi MG-132 til å hemme proteasome-mediert protein nedbrytning i HEK293 reporter celler. Som vist på figur 1F, CGK062 konsekvent førte til en nedgang i den β-catenin proteinnivå; Men tilsetningen av MG-132 opphevet virkningen av CGK062 på reduksjonen i β-catenin. Ammoniumklorid, et lysosom-inhibitor, ikke påvirker CGK062-mediert β-catenin nedbrytning (figur S3). Samlet utgjør disse resultatene indikerer at CGK062 undertrykker Wnt /β-catenin vei via en mekanisme som involverer nedbrytning av intracellulære β-catenin.
CGK062-mediert β-catenin nedbrytning krever β-TrCP men ikke GSK-3βactivity
Gitt at fosforyleringen av β-catenin av GSK-3β og påfølgende tilknytning til β-TrCP fører til p-catenin degradering [13], undersøkte vi hvorvidt GSK-3β aktivitet er nødvendig for nedbrytning av β -catenin indusert av CGK062. Når rapportør HEK293-celler ble inkubert med LiCl eller 6-bromoindirubin-3′-oxim (BIO), inhibitorer av GSK-3β, ble CRT-stimulert (figur 2A og 2B), i samsvar med tidligere rapporter [14], [15]. Som vist i figur 2A og 2B, behandling med CGK062 resulterte i undertrykkelse av CRT på en doseavhengig måte. I tillegg, Western blot-analyse ved anvendelse av anti-β-catenin antistoff gående viste at CGK062 førte til en nedregulering av intracellulære β-catenin nivåer, som akkumulert med LiCl (figur 2C), noe som tyder på at CGK062-mediert β-catenin degradering er uavhengig av GSK-3β.
(A) HEK293 rapportør celler ble inkubert med CGK062 i nærvær av 20 mM LiCl. (B) HEK293 rapportør celler ble inkubert med CGK062 i nærvær av 0,75 pM BIO. I (A) og (B), etter 15 timer, ble luciferase-aktivitet bestemt og angitt som relativ lysenhet (RLU) normalisert til celle titer. Resultatene er gjennomsnittet av tre forsøk, og viser linjene standardavvik. *,
P
0,05, sammenlignet med LiCl- eller BIO-behandlede kontrollgruppe. (C) cytosoliske proteiner ble fremstilt fra HEK293 rapportør celler behandlet med enten bærer (DMSO) eller økende mengder av CGK062 i nærvær av 20 mM LiCl i 15 timer og deretter underkastet Western blotting med β-catenin antistoff. (D) HEK293-celler ble transfektert med den Δβ-TrCP ekspresjonsplasmid og deretter inkubert med enten bærer (DMSO) eller CGK062 (25 uM) i nærvær av Wnt3a CM i 15 timer. Cytosoliske proteiner ble underkastet Western blotting med β-catenin og p-TrCP antistoffer. I (C) og (D), ble blotter reprobed med anti-aktin antistoff som en lasting kontroll.
Vi så bestemt om β-TrCP er nødvendig for CGK062-indusert nedbrytning ofβ-catenin. Som vist i figur 2D, ektopisk ekspresjon av en dominant-negativ form av β-TrCP (Δβ-TrCP), som interagerer med fosforylert β-catenin, men er ute av stand til å danne en SCF
β-TrCP ubiquitin ligase kompleks [16] , avskaffet CGK062-indusert nedbrytning av β-catenin. I tillegg gjorde CGK062 ikke påvirke CRT som var blitt aktivert ved overekspresjon av β-catenin mutanter, S45A og S37A (figur S4). Disse resultatene indikerer at β-TrCP og N-terminale rester av β-catenin er nødvendig for CGK062-mediert β-catenin degradering.
CGK062 induserer PKCα-mediert β-catenin fosforylering /degradering
tidligere rapporter har vist at aktivert PKCα katalyserer fosforyleringen av β-catenin ved Ser33 /37 og dens påfølgende tilknytning til β-TrCP fører til p-catenin degradering [17], [18]. For ytterligere å få innsikt i mekanismen, vi først undersøkt om PKCα aktiveres ved behandling med CGK062. Siden aktivert PKCα beveger seg fra cytoplasma til plasmamembranen [19], ble det isolert membranfraksjoner fra CGK062-behandlede og -untreated celler, og måles mengden av PKCα ved Western blot-analyse. CGK062 behandling førte til akkumulering av PKCα ved plasmamembranen i HEK293-celler (figur 3A). Vi har også observert CGK062-indusert membran translokasjon av PKCα i HEK293 celler ved immunfluorescens analyse (figur S5). Konsekvent, CGK062 forbedret kinase aktiviteten til PKCα
in vitro
, da vi brukte syntetisk peptid som inneholder PKCα fosforylering nettstedet som et substrat (figur 3B). Videre BIM jeg, en spesifikk hemmer av PKC avskaffet effekten av CGK062 (figur 3B), noe som tyder på at CGK062 er en
bona fide
aktivator av PKCα.
(A) cytosoliske og membranfraksjoner ble fremstilt fra HEK293-celler som ble behandlet med vehikkel (DMSO) eller CGK062 (25 og 50 uM) i nærvær eller fravær av Wnt3a-CM for Western blotting med anti-PKCα antistoff. Blottene ble reprobed med anti-tubulin eller anti-MDR-antistoffer som fraksjonskontrollene. (B) Indikert peptid ble inkubert med renset PKCα og CGK062 (12,5 og 25 mm) eller BIM (0,5 mm). Mengden av ATP i reaksjonen ble oppdaget av kinase-Glo ™ Lysende Assay kit (Promega). Resultatene er gjennomsnittet av tre forsøk, og viser linjene standardavvik. *,
P
0,05, sammenlignet med bilen kontrollgruppen. (C) cytosoliske proteiner ble fremstilt fra HEK293 rapportør celler behandlet med CGK062 (25 uM) eller BIM (10 uM) i fravær eller nærvær av Wnt3a-CM for Western blotting med anti-β-catenin antistoff. (D) HEK293 rapportør-celler ble transfektert med negativ kontroll (NC) siRNA (40 nM) eller PKCα siRNA (40 nM), og deretter inkubert med CGK062 (25 uM) i 15 timer i fravær eller nærvær av Wnt3a-CM. Cellelysater ble utsatt for Western blot-analyse med anti-PKCα og anti-β-catenin antistoffer. I (C) og (D), ble blottene reprobed med anti-actin-antistoff for å bekrefte lik belastning. (E) GST-β-catenin (100 ng) ble inkubert med renset PKCα og CGK062 (12,5 og 25 uM) eller BIM (0,5 uM). Prøvene ble analysert ved Western blotting med anti-fosfo-P33 /37-β-catenin antistoff. (F) rapportør HEK293-celler ble inkubert med CGK062 (25 uM) og BIM (10 uM) i 15 timer i fravær eller nærvær av Wnt3a-CM. Cytosoliske fraksjoner ble fremstilt og utsatt for Western blot-analyse med anti-fosfo-P33 /37-β-catenin eller anti-β-catenin antistoff. (G) HEK293 rapportør-celler ble transfektert med negativ kontroll (NC) siRNA (40 nM) eller PKCα siRNA (40 nM), og deretter inkubert med CGK062 (25 uM) i 15 timer i fravær eller nærvær av Wnt3a-CM. Cellelysater ble utsatt for Western blot-analyse med anti-p-catenin og anti-P33 /37-p-catenin antistoffer. I (F) og (G), ble den samme mengden β-catenin lagt i hvert kjørefelt.
Vi undersøkte om PKCα aktivitet er viktig for CGK062-mediert β-catenin degradering. Inhiberingen av PKCα aktivitet ved anvendelse av BIM I avskaffet nedregulering av β-catenin ved CGK062 (figur 3C). Spesielt, den selektive uttømming av endogene PKCα bruker små interfererende RNA (siRNA) også opphevet den CGK062-indusert nedbrytning ofβ-catenin (figur 3D), noe som indikerer at PKCα er ansvarlig for degradering av β-catenin av CGK062.
Neste, for å teste om CGK062 direkte fremmer PKCα-mediert β-catenin fosforylering på Ser33 /37, utførte vi en
in vitro
kinase analysen bruker bakterielt uttrykt β-catenin og renset PKCα. PKCα lett fosforylert β-catenin i nærvær av CGK062 og BIM jeg inhiberes dette fosforylering (figur 3E). Vi undersøkte også om CGK062 fremmer PKCα-mediert β-catenin fosforylering på Ser33 /37 og Ser45 i HEK293 reporter celler. Western blot analyse viste at Wnt3a-CM hemmet fosforylering av β-catenin ved Ser33 /37 og Ser45 (figur 3F, S6 og S7). I tillegg CGK062 indusert fosforylering av β-catenin ved Ser33 /37 og Ser45 (figur 3F, S6 og S7), og Ser33 /37 fosforylering ble opphevet ved tilsetning av BIM-I (figur 3F). Konsekvent, CGK062 behandling reddet fosforylering av β-catenin på Ser33 /37, som ble hemmet av Wnt3a-CM, og knockdown av PKCα markert trykt CGK062-indusert Ser33 /37 fosforylering i HEK293 reporter celler (Figur 3G).
CGK062 fremmer også β-catenin nedbrytning i CRT-positive kreftceller
Vi neste testet om CGK062 aktiverer PKCα i CRT-positive kreftceller, for eksempel PC3 (prostatakreft), SNU475 (hepatom), og SW480 (tykktarmskreft). I samsvar med resultater fra HEK293 celler, CGK062 fremmet translokasjon av PKCα til plasmamembranen i disse kreftcellene (Figur 4A). For å bestemme hvorvidt CGK062 hemmer også β-catenin funksjon i CRT-positive cancerceller, ble plasmid TOPFlash transfektert inn i CRT-positive cancerceller, etterfulgt av behandling med økende konsentrasjoner av CGK062. Som vist i figur 4B, CGK062 gående trykt CRT i PC3, SNU475, og SW480-celler. Parallelt med dette eksperimentet, bestemt vi effekten av CGK062 på nivået av cytosoliske β-catenin i disse CRT-positive cancerceller ved hjelp av Western blot-analyse. Konsekvent, behandling av CGK062 resulterte i nedregulering av intracellulær β-catenin nivå på en konsentrasjonsavhengig måte i PC3, SNU475, og SW480-celler (Figur 4C). Vi fant også at CGK062 fremmet fosforylering av β-catenin på Ser33 /37, og dette fosforylering ble avskaffet av BIM jeg i SW480 celler (figur S8). Disse resultatene indikerer at CGK062 induserer også β-catenin nedbrytning i CRT-positive cancerceller.
(A) cytosoliske og membranfraksjoner ble fremstilt fra PC3, SNU475, og SW480-celler ble behandlet med vehikkel (DMSO) eller CGK062 for Western blotting med anti-PKCα antistoff. Blottene ble reprobed med anti-tubulin eller anti-MDR-antistoffer som fraksjonskontrollene. (B) PC3, SNU475 og SW480-celler ble ko-transfektert med TOPFlash og pCMV-RL plasmider og inkubert med CGK062 i 15 timer. Luciferasepreparater aktiviteter ble målt 39 timer etter transfeksjon og rapporteres som relativ lysenhet (RLU) normalisert til
Renilla
luciferasepreparater aktiviteter. Resultatene er gjennomsnittet av tre forsøk, og de linjer indikerer standardavvik. *,
P
0,05, og **,
P
0,01, sammenlignet med bilen kontrollgruppen. (C) cytosoliske proteiner ble fremstilt fra PC3, SNU475, og SW480-celler ble behandlet med bærer (DMSO) eller CGK062 i 15 timer og deretter underkastet Western blotting med β-catenin antistoff. Blottene ble reprobed med anti-aktin antistoff for å bekrefte lik belastning.
CGK062 undertrykker uttrykk for β-catenin-avhengige gener
For å avgjøre om CGK062 påvirker uttrykket av β- catenin-avhengige gener, promotoren aktiviteten til
cyklin D1
, som er en kjent β-catenin-avhengig-genet, ble evaluert. En reporter konstruksjon inneholdende
cyklin D1
promoteren, som inneholder en β-catenin /TCF-4-responsive region, ble transfektert inn i PC3, SNU475, og SW480-celler, etterfulgt av behandling med forskjellige konsentrasjoner av CGK062. Som vist i figur 5A,
cyklin D1
promoter-aktivitet ble undertrykt ved CGK062 i disse CRT-positive cancerceller. Vi vurderte også proteinnivået av cyclin D1 i CGK062 behandlet CRT-positive kreftceller. I samsvar med vår resultatet for
cyclin D1
arrangøren, en doseavhengig reduksjon i cyclin D1 protein uttrykk ble observert i respons til CGK062 (figur 5B) i PC3, SNU475, og SW480 celler. I tillegg, ekspresjon av
c-myc
og
Axin-2
, etablerte nedstrøms mål for β-catenin [9], ble også signifikant redusert i disse CRT-positive cancerceller etter inkubering med CGK062 (figur 5B). Under disse betingelser, har den PKCα nivå ikke endres i respons til forskjellige konsentrasjoner av CGK062 (figur S9).
(A) PC3, SNU475 og SW480-celler ble ko-transfektert med cyclin D1-RL og pSV40- FL, og deretter inkubert med angitte mengder av CGK062 i 15 timer. Luciferasepreparater aktiviteter ble målt 39 timer etter transfeksjon. Cyclin D1 promoter aktivitet rapporteres som relativ lysenhet (RLU) normalisert til ildflue luciferase aktivitet. Resultatene er gjennomsnittet av tre forsøk, og viser linjene standardavvik. *,
P
0,05, og **,
P
0,01, sammenlignet med bilen kontrollgruppen. (B) PC3, SNU475 og SW480-celler ble inkubert med bærer (DMSO) eller CGK062 i 15 timer og deretter celleekstrakter ble fremstilt for Western blotting med anti-Axin, anti-cyklin D1 og anti-myc antistoff. For å bekrefte lik belastning, ble blotter reprobed med anti-aktin antistoff.
CGK062 hemmer spredning av CRT-positive kreftceller
in vitro Hotell og
in vivo
Nylige studier har vist at avbrudd av β-catenin funksjon av antisense, siRNA eller utskilte wnt antagonistegenskaper strategier har blitt vist å spesifikt hemme veksten av CRT-positive cancerceller [20] – [22] . Gitt at CGK062 fremmet nedbrytning av intracellulære β-catenin, hypotese vi at CGK062 også undertrykker spredning av CRT-positive kreftceller. For å utforske denne hypotese, evaluerte vi virkningen av CGK062 på veksten av forskjellige CRT-positive cancerceller. Som vist i tabell 1 og figur S10, CGK062 hemmet effektivt veksten av CRT-positive tarmkreftceller (DLD-1, SW480, HCT15, SNU475, og PC3-celler) med IC
50-verdier fra 1,62 um til 18,60 uM. Samlet utgjør disse resultatene indikerte at CGK062 markert hemmer celledeling av CRT-positive kreftceller.
For å vurdere antitumor aktivitet CGK062 videre
in vivo
, atymiske nakne mus med etablert sc PC3 xenografttumorer ble behandlet daglig med i.p. administrering av CGK062 i 5 uker ved 50 og 100 mg /kg. I forhold til kjøretøyet (kontroll), behandling av mus med CGK062 signifikant hemmet PC3 tumorvekst (figur 6A). En dose på 100 mg /kg CGK062 indusert i nærheten av fullstendig inhibering av tumorvekst. Selv ved en dose på 50 mg /kg, CGK062 inhiberte tumorvekst med ~70% i forhold til kontrollgruppen. Alle mus tolereres behandling uten betydelig tap i kroppsvekt (figur 6B).
(A og B) CGK062 hemmer prostatakreft tumor xenograft vekst
in vivo
. Subkutane PC3 tumorxenotransplantater ble etablert og behandlinger ble administrert som beskrevet i materialer og metoder. (A), var gjennomsnittlig tumorvolum (n = 6) (B), var gjennomsnittlig gjennomsnittlig kroppsvektendring under behandlingen. *,
P
0,05, sammenlignet med bilen kontrollgruppen
Diskusjoner
Aberrant oppregulering av intracellulær β-catenin er involvert i utviklingen. av flere kreftformer, inkludert prostatakreft, tykktarmskreft, og hepatocellulært karsinom [6] – [8]. I denne rapporten, anvendte vi en celle-basert screening for å identifisere CGK062 som en potent inhibitor av Wnt /β-catenin pathway. CGK062 gitt betydelig terapeutisk fordel i forhold til antitumor styrke i ulike β-catenin respons transkripsjon (CRT) -positive kreftceller, for eksempel tykktarmskreftceller (SW480, DLD-en, og HCT15), leverkreft (SNU475), hormon-ildfast prostatakreftceller (PC3).
CGK062-aktivert PKCα katalysert fosforylering av β-catenin på Ser33 /Ser37, og dermed redusert den intracellulære β-catenin nivå ved β-TrCP avhengig proteasomal degradering. I tillegg farmakologisk hemming og PKCα siRNA avskaffet CGK062-indusert β-catenin fosforylering /degradering, noe som indikerer at PKCα er ansvarlig for CGK062-mediert hemming av Wnt /β-catenin veien. Resultatene av flere studier, inkludert noen utført tidligere i vårt laboratorium, antyder en viktig rolle for PKCα i regulering av Wnt /β-catenin signalering. Wnt5a er involvert i mobiliseringen av intracellulær Ca
2+, er den etterfølgende aktivering av PKCα, og hemming av Wnt /β-catenin veien [23], [24]. Orford
et al.
[25] rapporterte at PKC hemmere føre til opphopning av β-catenin i humane brystkreftceller. Nylig ble retinsyre relaterte orphan nukleær reseptor α (ROR a) vist å dempe Wnt /β-catenin signalisering i tykktarmskreft ved å stimulere PKCα-avhengig fosforylering [26]. Tidligere viste vi at PKCα regulerer negativt Wnt /β-catenin signalisering i HEK293-celler, som har normal Wnt /β-catenin veien funksjon [17] og det PKCα regulerer intracellulære β-catenin nivået i tykktarmskreftceller [18]. Den foreliggende studien strekker de tidligere funn ved å vise at aktiveringen av PKCα ved en ny agonist, CGK062, fremmer β-catenin nedbrytning i tre cancercellelinjer – PC3 (prostatakreft), SNU475 (hepatom), og SW480 (tykktarmskreft) – som viser avvikende opp-regulering av den intracellulære β-catenin nivå.
lavmolekylære inhibitorer som antagoniserer CRT har blitt oppdaget av high-throughput screening. Små molekyler som blokkerer sammenhengen mellom Tcf4 og aktiviteter β-catenin forringe β-catenin-avhengige, som celleproliferasjon og duplisering av embryonale ryggaksen i
Xenopus laevis product: [27]. Et annet lite molekyl, ICG-001, som blokkerer interaksjonen mellom β-catenin og cyklisk AMP responselement-bindende protein (CBP), spesifikt induserer apoptose i tykktarmskreftceller [28]. To andre små molekyler, IWR-3 og XAV939, er nylig vist seg å stimulere nedbrytning av β-catenin ved å stabil Axin og derved hemme proliferasjonen av DLD-1 colon cancerceller, som bærer en mutasjon i APC [29], [30 ]. I motsetning til tidligere studert små molekyler, CGK062 redusert det intracellulære nivået av β-catenin gjennom PKCα-mediert fosforylering /degradering. Spesielt, var den i stand til å fremme β-catenin nedbrytning i SNU475 hepatomceller, som bærer en Axin mutasjon, så vel som i SW480 kolon kreftceller med APC mutasjon, og undertrykket vekst av CRT-positive cancerceller. CGK062 markert undertrykte veksten av PC3 prostatakreft i en mus xenograft modell, i samsvar med resultatene av vår
in vitro
analyser.
I konklusjonen, identifiserte vi CGK062 som fremmer PKCα-mediert β- catenin fosforylering og dens degradering. CGK062 trykt uttrykk for sine mål gener, inkludert de koding cyclin D1, c-myc og Axin-2, og dermed undertrykke tumorvekst
in vitro Hotell og
in vivo
. Til sammen CGK062 representerer en lovende kandidat behandling av CRT-positive kreft.
Materialer og metoder
Cell kultur, plasmider, transfeksjon, og luciferase assay
HEK293, PC- 3, SNU475, DLD-1, HCT15, SW480, og Wnt3a-utskillende L-celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC) og opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 120 ug /ml penicillin og 200 ug /ml streptomycin. Wnt3a-kondisjonert medium (Wnt3a-CM) ble fremstilt som tidligere beskrevet [31]. Den HEK293 reporter og kontrollcellelinjen ble etablert som tidligere beskrevet [32]. De pTOPFlash og pFOPFlash reporter plasmider ble hentet fra Upstate Bioteknologi (Lake Placid, NY, USA). Den dominerende negative β-TrCP (Δβ-TrCP) uttrykk plasmid var en gave fra M. Davis (Hebrew University-Hadassah Medical School, Israel). pCMV-RL og PSV-FL plasmider ble kjøpt fra Promega. PKC siRNA er utformet som tidligere beskrevet [17]. Transfeksjon ble utført med Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Luciferase assay ble utført med en Dual Luciferase Assay kit (Promega, Madison, WI, USA).
Screening for en liten molekyl hemmer av Wnt /β-catenin signale
HEK293 reporter cellene ble inokulert i 96-brønners plater med 15.000 celler per brønn i duplikat og dyrket i 24 timer. Wnt3a-CM ble tilsatt, og deretter forbindelser (800-forbindelser), inkludert kumariner, flavonoider, naftokinoner, og terpenoider ble tilsatt til brønnene i en sluttkonsentrasjon på 30 uM. Etter 15 timer ble platene undersøkt for ildflue luciferase-aktivitet og celle-levedyktighet.
Fremstilling av membranfraksjon
Celler dyrket i 100 mm kulturskåler ble vasket med iskald PBS. Cellene ble deretter suspendert i 1 ml iskald ekstraksjonsbuffer (20 mM Tris (pH 7,5), 0,5 mM EDTA, og 0.5 mM EGTA); homogenisert ved anvendelse av en sprøyte (26G); og inkubert på is i 30 min. Homogenatet ble sentrifugert ved 13.400 x
g
i 2 min ved 4 ° C. Supernatanten ble sentrifugert ved 100.000 x
g
i 30 minutter ved 4 ° C i en 100Ti rotor (Beckman, USA). Pelleten ble suspendert i ekstraksjonsbuffer inneholdende 0,5% (w /v) Triton X-100.
Western blotting
cytosoliske fraksjon ble fremstilt som tidligere beskrevet [33]. Proteiner ble separert ved SDS-PAGE i en 4-12% gradient gel (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og overført til nitrocellulosemembraner (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Membranene ble blokkert med 5% fettfri melk og undersøkt med anti-β-catenin (BD Transduction Laboratories, Lexington, KY, USA), anti-fosfor-β-catenin (Ser33 /Ser37 /Thr41) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), anti-fosfor-β-catenin (Ser45) (Cell Signaling Technology), anti-cyclin D1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), anti-myc (Santa Cruz Biotechnology), anti-PKCα (BD Transduksjon Laboratories), anti-Axin (BD Transduction Laboratories), anti-β-TrCP (Santa Cruz Biotechnology), anti-MDR1 (Santa Cruz Biotechnology) og anti-aktin antistoffer (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) . Membranene ble deretter inkubert med pepperrot-peroksidase-konjugert anti-mus IgG eller anti-kanin-IgG (Santa Cruz Biotechnology) og visualisert ved anvendelse av ECL-systemet (Santa Cruz Biotechnology).
RNA-ekstraksjon og semikvantitativ RT -PCR
Total RNA ble isolert med Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. cDNA-syntese, revers transkripsjon og PCR (Polymerase Chain Reaction) ble utført som tidligere beskrevet [32]. Det amplifiserte DNA ble separert på 2% agarosegeler og farget med etidiumbromid.
Immunofluorescensanalyse
HEK293cells ble dyrket på glass kammers objektglass og deretter behandlet med DMSO eller CGK062 i 15 timer. Etter behandling ble cellene vasket med PBS, fiksert med 4% formaldehyd, permeabilisert i 0,3% Triton X-100, og blokkert i 4% bovint serumalbumin i 1 time.
