Abstract
microRNAs (mirnas) er korte ikke-kodende RNA-regulatorer som styrer genuttrykk hovedsakelig gjennom post-transcriptional stanse. Vi har tidligere identifisert
MIR-205
i en signatur for menneskelig livmorhalskreft ved hjelp av en dyp sekvensering tilnærming. I denne studien fikk vi bekreftet at
MIR-205
uttrykk var ofte høyere i menneskelig livmorhalskreft enn sine matchet normale vevsprøver. Funksjonelt, viser vi at
MIR-205
fremmer celleproliferasjon og migrasjon i menneskelige livmorhalskreftceller. For ytterligere å forstå de biologiske rollene til
MIR-205
, vi utførte
in vivo
kryssbinding og argonaute 2 immunoprecipitation av miRNA ribonucleoprotein komplekser etterfulgt av microarray analyse (CLIP-Chip) for å identifisere potensialet sitt mRNA mål. Bruk av CLIP-Chip på gevinst-og tap-av-funksjon eksperimenter, identifiserte vi et sett med utskrifter som potensielle mål av
MIR-205
. Flere mål er funksjonelt involvert i cellulær proliferasjon og migrasjon. To av dem, CYR61 og CTGF, ble ytterligere bekreftet ved Western blot analyse og kvantifisering av mRNA berikelse i Ago2 immunpresipitatene hjelp QRT-PCR. Videre har både
CYR61 Hotell og
CTGF
ble nedregulert i livmorhalskreft vev. Oppsummert våre funn viser nye funksjonelle roller og mål av
Mir-205
i menneskelig livmorhalskreft, som kan gi ny innsikt om sin rolle i livmorhalskreftutvikling og den potensielle verdien for klinisk diagnose.
Citation: Xie H, Zhao Y, Caramuta S, Larsson C, Lui WO (2012)
MIR-205
Expression Fremmer celleproliferasjon og migrasjon av menneskelig livmorhalskreftceller. PLoS ONE 7 (10): e46990. doi: 10,1371 /journal.pone.0046990
Redaktør: Siu Tim Cheung, University of Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 13 april 2012; Godkjent: 07.09.2012; Publisert: 03.10.2012
Copyright: © Xie et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av den svenske Forskningsrådet (523-2009-3517, 521-2010-3518); Åke Olsson stiftelse for Hematologisk forsknings; den svenske Cancer Foundation; Åke Wiberg stiftelse; Kong Gustaf V Jubilee fondet; Kreftforeningen i Stockholm; Axel og Signe Lagerman donasjon Foundation; Karolinska Institutet og Stockholms fylkeskommune. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
livmorhals~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er den tredje vanligste kreftformen blant kvinner på verdensbasis [1], er sterkt assosiert med infeksjon og påfølgende transformasjon av livmorhalsen ved spesifikke humant papillomavirus (HPV) subtyper [2]. Det faktum at livmorhalskreft utvikler seg fra anerkjente pre-maligne former, gir en viktig mulighet for tidlig diagnose og forebygging. I dag som for primærscreening inkluderer cytologiske analyser og HPV identifikasjon. Men disse undersøkelsene ikke pålitelig skille lesjoner med invasiv potensial fra lesjoner som vil spontant regress. Derfor vil utvikling av mer robuste markører for sykdomsprogresjon være et verdifullt supplement til dagens screening metoder.
microRNAs (mirnas) er korte ikke-kodende RNA (~22-nukleotider) som vanligvis styrer genuttrykk på innlegget -transcriptional nivå gjennom mRNA degradering og /eller translasjonelle undertrykkelse [3]. Disse små molekyler har vist seg å spille en viktig rolle i et bredt spekter av fysiologiske og patologiske prosesser, herunder kreftutvikling og progresjon. Vi, og andre, har tidligere identifisert endret miRNA uttrykk signaturer i menneskelig livmorhalskreft [4] – [10]. Flere av disse miRNAs har konsekvent blitt rapportert som dysregulerte i livmorhalskreft (
f.eks
.
MIR-143
,
MIR-145
,
MIR-21
og
MIR-205
). Noen få har også vært funksjonelt preget i menneskelige livmorhalskreftceller. Blant dem,
MIR-143
,
MIR-145 Hotell og
MIR-34a
har vist seg å hemme celledeling, og
MIR-146a
og
MIR-21
å øke cellevekst [8], [10], [11].
Mir-23b
ble nylig funnet å undertrykke uttrykket av urokinase-type plasminogen aktivator (uPA) og indusere celle migrasjon i menneskelige livmorhalskreftceller [12]. Samlet utgjør disse observasjonene tyder på at feilregulert mirnas har en funksjonell rolle i livmorhalskreft utvikling og kan bli brukt som diagnoseverktøy.
I denne studien undersøkte vi den funksjonelle rollen
MIR-205
i human cervical cancer. Dette miRNA var en av de mest betydningsfulle mirnas brukes for livmorhalskreft klasse prediksjon og ble betydelig overuttrykt i livmorhalskreft prøvene sammenlignet med matchede normale kolleger [9]. Økt uttrykk for
MIR-205
har også blitt observert i livmor adenokarsinom [13], hode og nakke plateepitelkarsinom cellelinjer [14], plateepitelkarsinom lungekreft [15] og eggstokkreft [16]. I motsetning til dette reduserte ekspresjon av
MIR-205
har blitt rapportert i melanoma [17] og kreft i spiserøret [18], nyre [19], blære [20], [21], bryst [22] og prostata [23].
Basert på de ovennevnte studiene,
MIR-205
kunne fungere som en onkogen eller tumorsuppressorgenet avhengig av mobilnettet sammenhenger. I samsvar med sin dobbeltrolle, har flere studier vist sin svulst fremme og undertrykkende roller i ulike kreftcellelinjer. For eksempler,
MIR-205
har vist seg å undertrykke cellemigrering /invasjon epithelial gjennom-til-mesenchymal overgang i både humane prostata og brystcancerceller [23], [24], så vel som å målrette
HER3
tyrosinkinase-reseptoren i brystkreftceller [22]. Til støtte for en onkogen funksjon,
MIR-205
ble funnet å målrette
SHIP2
for Akt overlevelse signalering i hode og hals plateepitelkarsinom celler [14]. Gitt kompleksiteten i sin funksjonalitet, vil det være av interesse å undersøke de funksjonelle rollene til
MIR-205
i livmorhalskreftutvikling.
Her beskriver vi de funksjonelle konsekvensene av
speil 205
regulering i menneskelige livmorhalskreftceller. I gevinst-og tap-av-funksjon eksperimenter, viser vi at
MIR-205
regulerer celleproliferasjon og migrasjon i menneskelige livmorhalskreftceller. Vi identifiserte et sett med antatt
ytterligere MIR-205
mål ved hjelp av en biokjemisk tilnærming. Flere av disse kandidat målene er funksjonelt forbundet med celleproliferasjon og migrasjon. To av potensialet
MIR-205
mRNA mål ble ytterligere validert i cellekultur eksperimenter. Våre funn gir en viktig leder for ytterligere innsikt i den funksjonelle rollen
Mir-205
i menneskelig livmorhalskreftutvikling.
Resultater
MIR-205
Expression i human livmorhalskreft prøver
Vi har tidligere identifisert et sett av miRNAs som kunne skille livmorhalskreft prøver fra sine vanlige kolleger ved hjelp av en sekvensebasert miRNA profilering tilnærming [9]. I så klassifikator,
MIR-205
hadde høyest poengsum, noe som tyder på en viktig funksjon i livmorhalskreftutvikling. For å bekrefte den endrede uttrykket nivået av
MIR-205
i livmorhalskreft, vi målte
MIR-205
uttrykk ved real-time kvantitativ revers transkripsjon-PCR (QRT-PCR) i 27 matchet par av livmorhalskreft og normalt vev. Etter avtale med sekvenseringsbaserte resultater,
MIR-205
ble funnet betydelig overuttrykt i menneskelig livmorhalskreft sammenlignet med sine vanlige kolleger
P
0,001; Figur 1A). I 19 tilfeller (~70%) uttrykk for
MIR-205
ble økt kraftig i tumorprøver i forhold til sine normale kolleger; mens i de resterende 8 tilfeller av kreft og normale prøver viste lave, men sammenlignbare uttrykk nivåer av
MIR-205 plakater (figur 1B).
(A)
MIR-205
uttrykk var betydelig høyere i svulstene enn de vanlige prøvene (
P
0,001; paret t-test). (B) Relativt høyere uttrykk av
MIR-205
ble funnet i et flertall av tumorprøver i forhold til sine normale kolleger. (C) Høy uttrykk for
MIR-205
ble påvist hos ME-180, ble C4I og CaSki celler, og lav eller ikke målbare uttrykk nivået funnet i HeLa, SW756, Siha og C33A celler. Data presentert representerer gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter med tre paralleller. Feilfelt representerer standardavvik fra gjennomsnittet.
Funksjonell Konsekvenser av
MIR-205
forordning i Human livmorhalskreft Cells
De funksjonelle konsekvenser av endret
MIR-205
uttrykk ble undersøkt i livmorhalskreft cellelinjer med høyt eller lavt nivå av endogene
MIR-205
. For dette formålet
MIR-205
ble kvantifisert i humane livmorhalskreft cellelinjer ved QRT-PCR. Blant de 7 cellelinjer analysert,
MIR-205
ble funnet sterkt uttrykt i ME-180, C4I og CaSki, mens lav uttrykk /knapt målbare nivåer ble funnet i HeLa, SW756, Siha og C33A (figur 1C) . Neste vi transfektert CaSki celler med en miRNA inhibitor (Anti-MIR-205), og HeLa og SW756 celler med en miRNA etterligne (Pre-MIR-205), og fast bestemt på effekten av
MIR-205
stanse eller overekspresjon på celleproliferasjon, apoptose og migrasjon. Som negative kontroller, anvendte vi en miRNA forløper eller inhibitor uten sekvenshomologi med noen humane transkripter.
Vi observerte at inhibering av
MIR-205
ekspresjon i CaSki-celler førte til en signifikant reduksjon i celle vekst (~15%;
P
0,001), mens overekspresjon av
Mir-205
i HeLa og SW756 celler resulterte i betydelige økninger av celleproliferasjon (~ 20% og ~11% henholdsvis;
P
0,05), sammenlignet med de respektive negative kontroller (figur 2A). Til sammen både gevinst-og tap-av-funksjon eksperimenter konsekvent støttet effekter på cellevekst.
Effekter på cellemigrasjon ble demonstrert ved hjelp av Transwell og sårtilheling migrasjon analyser. Bruke Transwell analysen, viste vi at cellemigrasjon ble betydelig forbedret av
MIR-205
overekspresjon både HeLa og SW756 cellelinjer (~ 20% og ~ 30%, henholdsvis;
P
100 ganger,
P
0,01) og
MIR-30a-5p plakater ( 10 fold,
P
. 0,01) i anti-Ago2 IP forhold til anti-IgG IP eller inngangskontroll (figur S2)
i vår CLIP-Chip analyse, vi utelatt en av de gjentatte mikromatriser fra
MIR-205
overekspresjon eksperimenter på grunn av dårlige hybridisering signaler. Etter filtrering av bakgrunnssignaler, utførte vi unsupervised hierarkisk clustering av de fem mikromatriser basert på deres mRNA uttrykk mønstre. Vi fokuserte på de seks klynger (inkludert 270 utskrifter /252 kommenterte gener) der uttrykk mønstre som vises berikelse i
MIR-205
overekspresjon og utarming i
Mir-205
undertrykkelse eksperimenter (figur S3 og tabell S1). Vi utførte funksjonell annotering på CLIP-Chip mål ved hjelp GENECODIS program. Flere funksjonelle grupper var betydelig anriket (
P
0,05), inkludert cellesyklus, viral reproduksjon, DNA-reparasjon, apoptose, celleproliferasjon og migrasjon (tabell 1). En detaljert liste av funksjonelle merknader er gitt i Tabell S2. Blant de 75 kandidat målene oppført i tabell 1, ble 71 også spådd som
MIR-205
mål i minst en forutsigelse program (tabell S3), og fire mål (
BOD1
,
SEPT2
,
AAGAB Hotell og
DCAF13
) ble ikke spådd av noen av programmene som brukes i denne studien.
Blant kandidat målgener, vi funnet
CYR61 Hotell og
CTGF
var assosiert med både celleproliferasjon og migrasjon (tabell 1), og det er i samsvar med våre funksjonelle konsekvenser observert i denne studien. For ytterligere å forstå uttrykket forholdet mellom
Mir-205
og
CYR61
eller
CTGF
, vi bestemt uttrykk for
CYR61 Hotell og
CTGF
i 28 matchet par av livmorhalskreft og normalt vev ved hjelp QRT-PCR. Våre resultater viste signifikant lavere uttrykk for både
CYR61 Hotell og
CTGF
i menneskelige livmorhalskreft prøvene sammenlignet med sine vanlige kolleger (
P
= 0,002 og
P
0,001, henholdsvis figur 3A-C). Interessant, uttrykk mønstre av disse to utvalgte gener ble omvendt korrelert med
MIR-205
uttrykk (
CYR61
,
Corr
= -0,241,
P
= 0,091;
CTGF
,
Corr
= -0,304,
P
= 0,032; figur 3D). De observerte inverse uttrykk mønstre, sammen med den antatte
MIR-205
bindingssteder (tabell S3, figur S4), gir ytterligere bevis for
CYR61 Hotell og
CTGF
som
MIR-205
mål.
(A) Celleproliferering ble vurdert i menneskelivmorhalskreft cellelinjer transfektert med en
MIR-205
ligne (Pre-MIR-205), inhibitor (Anti-MIR-205) eller tilsvarende negativ kontroll (Anti-MIR Neg kontroll eller Pre-MIR Neg kontroll) ved hjelp av WST-1-analysen. Relativ cellevekst ble normalisert til sine respektive styrebehandlet celler. (B) Grafer som viser relativ cellemigrasjon både
MIR-205
hemming og overekspresjon eksperimenter som vurderes av Transwell migrasjon analysen. (C) Representative bilder av cellemigrering evaluert ved sårheling assay. Skrape sår ble laget på konfluente monolagskulturer etter 48 timer med transfeksjon. Bilder av sårheling ble tatt ved 0, 18 og 24 timer etter at såret (venstre panel). Prosentandelen for sårheling ble normalisert ved sår område på 0 h (panel høyre). Data presentert representerer gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter. Feilfelt representerer standardavvik fra gjennomsnittet. Alle sammenligninger ble evaluert under anvendelse av t-test. *
P
0,05; **
P
0,01; ***
P
0,001;
ns
= ikke signifikant.
Relativt lavere uttrykk for
CYR61 product: (A) og
CTGF product: (B) ble funnet i et flertall av tumorprøver i forhold til deres normale motstykker (n = 28). (C) Uttrykket av
CYR61 Hotell og
CTGF
var betydelig lavere i svulstene enn de vanlige prøvene (
P
= 0,002 og
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Validering av
CYR61 Hotell og
CTGF
som
MIR-205
målgener
for å finne ut om
CYR61 Hotell og
CTGF
kan være mål for
Mir-205
i humane livmorhalskreftceller, søkte vi to forskjellige tilnærminger. Først må vi evaluerte protein uttrykk nivåer av CYR61 og CTGF både
MIR-205
-overexpressing og -depleted livmorhalskreftceller ved hjelp av Western blot analyse. Som vist i Figur 4 (A og B),
MIR-205
over-ekspresjon i HeLa-celler resulterte i en signifikant reduksjon i CYR61 proteinekspresjon (~ 30%,
P
= 0,045) . Hemming av endogen
MIR-205
uttrykk i CaSki celler betydelig økt CYR61 proteinnivå (~15%,
P
= 0,016). For CTGF, observerte vi en liten nedgang eller økning (men ikke statistisk signifikant) protein uttrykk i
Mir-205
-overexpressing eller -depleted celler, henholdsvis. En plausibel forklaring er at CTGF kan reguleres ved flere mirnas eller faktorer, og modulering av
MIR-205
uttrykk alene var ikke tilstrekkelig til å gi betydelige endringer i CTGF proteinekspresjon nivå.
(A) representant Western blot viser protein uttrykk nivåer av CYR61 og CTGF i celler transfektert med en
MIR-205
etterligne,
MIR-205
hemmer, eller tilsvarende rykke ut og håne transfeksjon kontroller. (B) CYR61 protein uttrykk ble betydelig undertrykt i
Mir-205
-overexpressing (behandlet med Pre-MIR-205) celler og betydelig økt i
Mir-205
-depleting (behandlet med Anti -miR-205) celler i forhold til deres respektive negative kontroller. CTGF protein uttrykk var litt undertrykt i HeLa celler behandlet med Pre-MIR-205, og noe økt i CaSki celler behandlet med Anti-MIR-205, men effekten var ikke statistisk signifikant. Data presentert representerer gjennomsnittet av minst fire uavhengige forsøk. QRT-PCR analyse av
CYR61
(C) og
CTGF product: (D) mRNA i Ago2-immunopresipitert RNA av
MIR-205
-overexpressing eller -depleted celler som sammenlignet med mock-transfeksjon kontroll. Relativ uttrykk nivå av individuelle mRNA ble normalisert til
MIR-21
uttrykk (som endogen kontroll for Ago2 IP RNA). Brett endringen ble beregnet ved å dividere de normaliserte uttrykket verdiene av Ago2-immunoprecipiated prøver av de normaliserte uttrykk verdiene av sine respektive inngangs prøver. Data presentert representerer gjennomsnittet av minst tre uavhengige eksperimenter. Feilfelt representerer standardavvik fra gjennomsnittet. Alle sammenligninger ble evaluert ved hjelp av
t
-test. *
P
0,05; **
P
0,01; ***
P
0,001;
ns
= ikke signifikant.
I den andre tilnærmingen, vi kvantifisert
CYR61 Hotell og
CTGF
mRNA i Ago2-immunoutfelt mRNA i både
MIR-205
-overexpressing og utarmet celler ved hjelp QRT-PCR, og sammenlignet deres nivå med mock-transfektert kontroller. Dette eksperimentet er basert på antagelsen om at mirnas og deres mRNA mål er fysisk knyttet til Ago2 holdig protein kompleks. Derfor forventet vi anrikning av målet mRNA i
MIR-205
over-uttrykker celler, eller uttømming av mål i celler med
MIR-205
hemming. Faktisk, observerte vi betydelige enrichments av
CYR61 product: (
P
= 0,050) og
CTGF product: (
P
= 0,007) mRNA i HeLa celler med overekspresjon av
MIR-205
, og nedbryting av både transkripsjoner i CaSki celler med
MIR-205
hemming (
P
0,001 for begge målene, figur 4C og 4D) . Disse resultatene tyder på at både
CYR61 Hotell og
CTGF
er mål for
Mir-205
i humane livmorhalskreftceller.
Diskusjoner
Observasjoner av økt eller redusert uttrykk for
MIR-205
i ulike krefttyper tyder på at
MIR-205
kan ha ulike funksjoner i kreftutvikling avhengig av celletype involvert. I tråd med denne oppfatningen, har tidligere studier vist sin svulst undertrykkelse funksjon i både bryst og prostata kreft celler [22] – [24], og det tumorvekst funksjon i hodet og nakke plateepitelkarsinom celler [14]. I dette arbeidet har vi undersøkt videre sin funksjonelle konsekvenser og mål i menneskelige livmorhalskreftceller.
MIR-205
Regulerer celleproliferasjon og migrasjon i Human livmorhalskreft Cells
Her vi først bekreftet ved QRT-PCR at
MIR-205
er betydelig overuttrykt i livmorhalskreft prøver i forhold til sine normale kolleger. Resultatet er i tråd med våre tidligere sekvense basert funnene [9], og med microarray data rapportert av Wang et al. [8]. Gitt den observerte økt uttrykk av
MIR-205
i livmorhalskreft vev, vi videre undersøkt de funksjonelle konsekvensene av
MIR-205
regulering i menneskelige livmorhalskreftceller. I begge
MIR-205
-overexpressing celler (HeLa og SW756), observerte vi signifikante effekter på celleproliferasjon og migrasjon. Etter
MIR-205
inhibering i CaSki-celler, proliferasjon ble signifikant redusert, men effekten på cellemigrering ble bare vist i den til sårheling analysen, men ikke i den Transwell migrasjonsanalysen. En mulig årsak til dette avviket er at cellemigrasjon avhenger av ulike faktorer i de respektive analyser. Den cellemigrering som oppstår under sårheling er avhengig av celle-matriks-interaksjon. Men i Transwell-analysen, celler blir først fremstilt i enkeltceller suspensjon, noe som vil forstyrre celle-celle og celle-matriks-interaksjoner. Videre kan cellemigrering i det Transwell-analysen er avhengig av den kjemotaktiske gradient, som ikke er tilgjengelig i sårtilhelingen analysen.
Påvirkning av celleproliferasjon og migrering som ligner de som ble observert her i human kreft i livmorhalsen har også blitt rapportert i andre celletyper. For eksempel
MIR-205
overekspresjon ført til økt celledeling i mus mammary epiteliale celle forfedre [25] og cellemigrasjon i humane keratinocytter [26]. Som kontrast, økt ekspresjon av
MIR-205
ble funnet å undertrykke proliferasjonen av melanom [17] og brystkreftceller [27], så vel som cellemigrering i en rekke forskjellige kreftcellelinjer, inkludert SK- LU-1-småcellet lungekreft [28], U87 glioblastom [28] og A498 nyrekreft [19]. Samlet utgjør disse funnene støtter dual funksjon av
Mir-205
som en tumor suppressor eller et onkogen videre.
CYR61 Hotell og
CTGF
som nye mål av
MIR-205
på grunn av sin funksjonelle kompleksitet, søkte vi en biokjemisk tilnærming (CLIP-Chip) for å identifisere
MIR-205-
mål interaksjoner
in vivo
. Ved hjelp av denne tilnærmingen, har vi identifisert et sett med
MIR-205
mål fra både gevinst-og tap-av-funksjon eksperimenter. Blant disse, flere er funksjonelt relatert til celle-proliferasjon og migrering; som er konsistent med de funksjonelle konsekvenser observert i denne studien. To av målgener,
CYR61 Hotell og
CTGF
, ble ytterligere validert på protein og /eller RNA-nivåer. Imidlertid må deres presise interaksjon (r) for å bli ytterligere bestemt av luciferase reporter-analyser. I denne studien har vi ikke utføre CYR61 og CTGF hemming i livmorhalskreftceller, er det mulig at andre direkte mål (e) bidrar til
MIR-205
formidlet virkninger på cellulær proliferasjon og migrasjon. Likevel, disse genene hadde signifikant lavere uttrykk i livmorhalskreft prøver enn sine normale kolleger, noe som tyder på at de kan spille en viktig rolle i livmorhalskreftutvikling.
CYR61 og CTGF proteiner er medlemmer av cystein rike 61 /bindevev vekst faktor /nefroblastom (CCN) familie av vekstregulerende. Disse proteinene spille ulike roller i mange cellulære prosesser, herunder utvikling, celledeling, adhesjon, migrasjon, angiogenese og tumorigenesis [29]. CCNS blir avvikende uttrykt i et bredt spekter av tumortyper [29]. Interessant, kan både CYR61 og CTGF fungere som tumor suppressors eller onkogener avhengig av mobil kontekst (se eksempler nedenfor); som er lik dobbel funksjon av
MIR-205
.
I samsvar til våre observasjoner, har dereguleringen av CYR61 og CTGF også vært vist i flere andre studier. For eksempel
CYR61
uttrykk er nedregulert i livmorhalskreft [30], lungekreft [31] – [33], livmorkreft [34] og leverkreft [35]; Imidlertid har det opp-regulering er rapportert i flere tumortyper, inkludert osteosarkom [36], gliom [37], [38], og brystkreft [39], [40]. I likhet med CYR61 har tidligere studier vist motstridende uttrykk mønstre av CTGF i ulike krefttyper. For eksempel, redusert CTGF uttrykk er blitt rapportert i lungekreft [31], brystkreft [40], Wilms tumor [41] og eggstokk-kreft [42]; mens økt uttrykk ble funnet i papillær skjoldbruskkjertelkreft [43], tykktarmskreft [44], hode og nakke plateepitelkarsinom [45], [46] og glioblastom [47].
Interessant,
MIR -205
, CYR61 og CTGF er involvert i felles funksjonelle prosesser og veier. I likhet med de funksjonelle konsekvenser av
MIR-205
observert i denne studien, CYR61 har vist seg å undertrykke cellevekst i lungekreft [32] og hepatocellulær kreft [35]. På den annen side, stanse av CYR61 undertrykker celleproliferasjon og migrasjon i glioma [37] og kreft i bukspyttkjertelen celler [48]. Tap av
MIR-205
uttrykk fører til induksjon av epitelial til mesenchymale overgang (EMT) [23], [24], mens tie av CYR61 uttrykk hemmer EMT [48]. Nedbryting av
MIR-205 Hotell og CYR61 uttrykk hemmer Akt signalisering i keratinocytter, muntlig plateepitelkarsinom celler [14] og glioma celler [37]. Som CYR61 og
MIR-205
, CTGF er også blitt vist å spille både onkogene og suppressor roller i en rekke forskjellige typer cancerceller [45], [47], [49] – [51], og det er også involvert i både EMT [52], [53] og Akt sti [54] – [56]. Til tross for de mange studiene som er nevnt ovenfor, roller CYR61 og CTGF i menneskelig livmorhalskreft fortsatt uklare. Det vil være av interesse å bestemme de funksjonelle rollene til disse faktorene i livmorhalskreft og å vurdere deres interaksjoner med
MIR-205
i ulike krefttyper.
I sammendraget, rapporterer vi funksjonelle effekter på tumor fenotyper og nye mål for
MIR-205
i humane livmorhalskreftceller. Vi viser at
MIR-205
spiller en onkogen rolle i menneskelig livmorhalskreft ved å fremme cellevekst og migrasjon. Videre har vi identifisert et sett av romanen
MIR-205
mål ved hjelp av en kombinasjon av biokjemiske og mikromatrisemetoden. Blant dem,
CYR61 Hotell og
CTGF
ble ytterligere bekreftet på protein og /eller RNA-nivåer. Viktigere, ble disse to genene nedregulert i menneskelige livmorhalskreft prøver. Våre funn tyder på at
MIR-205 Hotell og sine mål (
f.eks
CYR61 og CTGF) kan spille en viktig rolle i patogenesen av livmorhalskreft, og at
MIR-205
(og sine mål) kan gi potensielle diagnostiske verdier for livmorhals patologien.
Materialer og metoder
vevsprøver og etikk erklæringen
Tretti par snap-frosset cervical svulst og matchet normalt vev fra naboregionene av 30 pasienter ble levert av gynekologisk Oncology Group Tissue Bank (Columbus, Ohio). Tumor og prøvene normale vev hadde blitt verifisert som tumor eller ikke-svulsten ved histopatologisk undersøkelse av hematoksylin og eosin-farget parafinsnitt. Ni og tyve par av prøvene ble inkludert i vår tidligere liten RNA profilering av dyp sekvenseringsteknologi [9]. Studien ble godkjent av Karolinska Institutet Ethics Committee. Ingen skriftlig informert samtykke var nødvendig fordi alle kliniske materialer ble deidentified. Den etikk komité styre Karolinska Institutet spesielt fravikes behovet for samtykke
livmorhalskreft cellelinjer
Syv menneskelige livmorhalskreft cellelinjer ble brukt. CaSki, HeLa, SW756, ME-180, Siha, C4I og C33A. CaSki og ME-180 celler ble opprinnelig etablert fra metastaser av livmorhalskreft, og de andre cellelinjer ble avledet fra primære livmorsvulster [57] – [61]. Disse linjene ble vennlig levert av Dr. Keng-Ling Wallin (Karolinska universitetssykehus, Sverige), og hadde blitt kjøpt fra American Type Tissue Culture (ATCC). CaSki og ME-180-celler ble dyrket i RPMI 1640, mens HeLa, SW756, Siha, C4I og C33A-celler ble dyrket i DMEM-medium. Alle celler ble supplert med 10% FBS og 1% penicillin /streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA) og dyrket ved 37 ° C og 5% CO
2 i en fuktet inkubator.
TaqMan® kvantitative Reverse Transcription -PCR (QRT-PCR)
uttrykk av modne miRNAs og mRNA ble kvantifisert ved QRT-PCR ved hjelp av et Applied Biosystems 7500 Fast real-time PCR system (Applied Biosystems). RNA ble ekstrahert ved bruk av Mirvana miRNA isolasjonskit (Applied Biosystems /Ambion, Austin, TX), påføring av små RNA anrikning fra vevsprøver, og total-RNA isolert fra cellelinjer. RNA-konsentrasjoner ble målt ved hjelp av en Nanodrop ND-1000 spektrofotometer (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE).
For moden miRNA, ble cDNA syntetisert fra 25 ng små RNA-beriket RNA for vevsprøver, 120 ng total RNA for cellelinjer eller 15 ng Ago2-immunopresipitert RNA ved hjelp Taqman mikroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). Ferdiglagede TAQMAN mikroRNA Analyser for
MIR-205 plakater (ID 000509),
MIR-21 plakater (ID 000397) og
MIR-30a-5p plakater (ID 000417) ble kjøpt fra Applied Biosystems. Alle reaksjoner ble utført i tre eksemplarer på tre uavhengige anledninger, og relative uttrykk nivåer ble normalisert til det geometriske gjennomsnittet av
RNU6B plakater (ID 001093) og
RNU43 plakater (ID 001095), og rapporteres som to
-ΔCT.
for mRNA kvantifisering, ble cDNA syntetisert fra 200 ng stor RNA fraksjonen (
dvs.
RNA brøkdel igjen etter små RNA berikelse) for vevsprøver eller 50 ng Ago2-immunopresipitert RNA ved hjelp av High Capacity cDNA Reverse Transcription kit (Applied Biosystems).
