Abstract
Bakgrunn
Cysteamine, en antioksidant aminothiol, er det behandling av valget for nefropatisk cystinose, en sjelden lysosomal lagring sykdom. Cysteamine er en chemo-allergi og RADIO agent og dens antitumor effekter har blitt undersøkt i ulike tumorcellelinjer og kjemisk indusert kreftutvikling. Her undersøkte vi om cysteamine har anti-tumor og anti-metastatiske virkninger i transplant menneskelig kreft i bukspyttkjertelen, en aggressiv metastatisk sykdom.
Metodikk /hovedfunnene
Cysteamine anti-invasjons effekter ble studert av matrigel invasjon og cellemigrasjonsanalyser i 10 bukspyttkjertelkreft cellelinjer. For å studere virkningsmekanismen, undersøkte vi celleviabilitet og matriksmetalloproteinaser (MMP’er) aktivitet i cysteamin-behandlede celler. Vi undersøkte også cysteamine anti-metastaser effekt i to ortotopiske murine modeller av menneskelig kreft i bukspyttkjertelen ved å måle peritoneal metastaser og overlevelse av dyr. Cysteamine hemmet både migrasjon og invasjon av alle de ti bukspyttkjertelkreft cellelinjer ved konsentrasjoner ( 25 mm) som forårsaket ingen toksisitet for celler. Det sunket betraktelig MMP aktivitet (
IC
50 38-460 mm) og zymographic gelatinase aktivitet på en doseavhengig måte
in vitro Hotell og
in vivo
; mens mRNA og protein nivåer av MMP-9, MMP-12 og MMP-14 ble noe økt bruk av høyeste cysteamin konsentrasjonen.
In vivo
, cysteamine betydelig redusert metastaser i to etablerte bukspyttkjerteltumormodeller, selv om det ikke påvirke størrelsen av primære svulster. I tillegg, cysteamin forlenget overlevelse av mus på en doseavhengig måte uten å forårsake noen toksisitet. I likhet med
in vitro
resultater, MMP aktivitet ble betydelig redusert i dyre svulster behandlet med cysteamin. Cysteamine hadde ingen kliniske eller prekliniske bivirkninger hos verten selv ved den høyeste dosen.
Konklusjon /Betydning
Våre resultater tyder på at cysteamin, en agent med en velprøvd sikkerhetsprofil, kan være nyttig for hemming av metastase og forlenge overlevelsen av en vert med kreft i bukspyttkjertelen
Citation. Fujisawa T, Rubin B, Suzuki A, Patel PS, Gahl WA, Joshi BH, et al. (2012) Cysteamine undertrykker Invasion, metastaser og forlenger overlevelse ved å hemme matriksmetalloproteinaser i en musemodell for menneskelig kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE 7 (4): e34437. doi: 10,1371 /journal.pone.0034437
Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan
mottatt: 02.06.2011; Akseptert: 2 mars 2012; Publisert: 20 april 2012
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:.. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
Konkurrerende interesser: Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer .
Innledning
Cysteamin er en enkel aminothiol og anti-oxidant som har potensiale for behandling av stråling sykdom, nevrologiske sykdommer og kreft. Cysteamine er også godkjent av Food and Drug Administration for behandling av pasienter med cystinose, en autosomal recessiv lidelse preget av opphopning av cystin i lysosomer [1], [2]. Farmakokinetikken og bivirkninger av cysteamin har blitt svært godt undersøkt [3] – [5]. I kreft-feltet, har mange studier har rapportert anti-kreft-effekter av cysteamin med hensyn til kreftutvikling og proliferasjon. Cysteamin forhindret ikke bare utviklingen av metaplasi, men også carcinogenesis av mammary tumor og gastrisk kreft indusert kjemisk og ved stråling [6] – [8]. Cysteamin alene eller konjugert med nanopartikler eller andre forbindelser undertrykke kreftcelleformering avledet fra neural neoplastiske svulster [9], SMMC-7721 hepatocellulært karsinom [10], brystkreft [11], og melanomcellelinjer [12]
in vitro
. Disse derivatene ser ut til å hemme veksten av kreftceller, synergistisk effekt av andre anti-kreft medikamenter, indusere apoptose eller utøve cytotoksiske effekter på DNA-replikasjon. Cysteamin er også funnet å utøve en bifasisk virkning på autophagy ved å indusere dannelse av autophagosomes på tidlige tidspunkter, men autophagic nedbrytning ved senere tidspunkter [13]. Cysteamin er kjent for å hemme intestinal neoplasia fremkalt ved hjelp av røntgenbestråling [6] og gastrisk karsinogenese indusert av N-metyl-N»-nitrosoguanidin i rotter [9], [14]. Men det er ingen rapport i litteraturen møte de anti-invasive eller anti-metastatiske virkninger av cysteamin i humane kreftformer.
A. For Matrigel invasjon analysen ble cellene inkubert med økende konsentrasjoner av cysteamin i matrigel kammer i 24 timer. Antallet invaderte celler på den motsatte side av membranen ble tellet. B og C. sårtilheling analysen. Cellene ble dyrket til konfluens og riper ved hjelp av en sterilisert gul spiss. De ble inkubert i 24 timer med 0-5 mM av cysteamin og arealet av såret mellom cellelagene ble målt. De sorte horisontale linjer i figuren (kjøretøy) viser området ved tid 0 da sår ble laget og indikerer området av såret når cellene ble ripet (B). D. For celleviabilitet analysen ble kreft i bukspyttkjertelen celler inkubert med forskjellige konsentrasjoner av cysteamin og levende celletall ble tellet etter 24 og 48 timer. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± S.D. av tre bestemmelser. Statistiske betydninger er vist ved †: P 0,01 og ‡. P 0,001
Kreft i bukspyttkjertelen er preget av lokal invasjon av tilstøtende strukturer og metastaser til lymfeknuter og lever i et veldig tidlig stadium. På tidspunktet for diagnose, de fleste bukspyttkjertel kreft allerede er metastatisk, slik at tumor-opererbar [15], [16]. Derfor må innsatsen være fokusert på ikke bare rettet mot primærtumor, men også kontrollere metastaser til å behandle kreft i bukspyttkjertelen.
Matrix metalloproteinaser (MMP) er en gruppe av sink-avhengige endopeptidaser innblandet i pattedyr angiogenese, sårheling, og vev remodellering [17]. I kreft, MMP’er spiller en viktig rolle i celle invasjon og metastase ved å kontrollere nedbrytning av den ekstracellulære matrisen [18]. Særlig spiller MMP-9 en sentral rolle i bukspyttkjertelkreft invasjon, og dens inhibering reduserer levermetastase av kreft i bukspyttkjertelen [15], [19]. Derfor har mange MMP hemmere av bred for å begrense spesifisitet blitt undersøkt for sine anti-kreft effekt. Noen MMP-hemmere vellykket undertrykke tumorvekst og metastasering i dyremodeller [20] – [22], men de klarer å vise anti-kreft effekt i kliniske studier. En grunn er deres alvorlige bivirkninger, spesielt de som involverer alvorlig ledd- og muskelsmerter [23], [24]. Derfor er det viktig å identifisere MMP-inhibitorer med liten eller ingen bivirkninger.
A. For å måle total MMP-aktivitet i bukspyttkjertelcancercellelinjer, ble celler inkubert med 0-5 mM av cysteamin i 24 timer, totalt protein ekstrahert og aktiviteten målt ved anvendelse av fluorogent substrat. Effekten av cysteamin på MMP-9 på proteinnivå ved hjelp av ELISA (B), MMP-9, MMP-12 og MMP-14 mRNA-nivåer (C) og gelatinase zymographic aktiviteter (D) ble bestemt etter inkubering av kreft i bukspyttkjertelen celler med cysteamin for 24 timer. MMP-9 aktivitet ble bestemt ved hjelp av ELISA og mRNA ved QRT-PCR. β-actin ble brukt til en referanse genet i QRT-PCR. Data representerer MMP-9-protein i pg /ug totalt cellelysat og RFU prosentforhold av mRNA /β p-aktin. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± S.D. av målinger in triplo og eksperimentene ble gjentatt tre ganger. Statistiske betydninger vises med *: P 0,05, †: p 0,01 og ‡. P 0,001
IC
50 av MMP ble bestemt ved å inkubere hver MMP enzym med forskjellige konsentrasjoner av cysteamin og batimastat i en fluorimetrisk assay som beskrevet i materialer og metoder.
IC
50 er konsentrasjonen av inhibitor hvor 50% hemming av proteolyse oppstår.
I denne studien undersøkte vi de anti-invasive effekter av cysteamin, som har en utmerket sikkerhetsprofil, i bukspyttkjertelkreft cellelinjer
in vitro
. Vi undersøkte også den anti-metastastic- virkning av cysteamin i dyremodeller av human kreft i bukspyttkjertelen, spesielt å bestemme om det kan redusere kreft metastase i ortotopiske kreft i bukspyttkjertelen modeller i mus med immunsvikt. Til slutt ble sikkerheten ved subkutan cysteamin vurderes i tumorbærende mus.
Materialer og metoder
Cell kultur og reagenser
bukspyttkjertelkreft cellelinjer (HS766T, MIA-PaCa2 , Panc-1, ASPC-1, PK-1, Mpanc96, BxPC-3, KLM, HPAF-II, og SW1990) ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Cysteaminhydroklorid ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) og oppløst i destillert vann.
Cell Migration analysen
Cell migrasjon analysen er en klassisk sårtilheling analyse [25]. For denne analysen ble cellene dyrket i 10 cm petriskåler inntil de er helt sammenflytende. Cellemonolag ble skrapet med en steril gul mikropipette spissen og vasket med PBS tre ganger; cellene ble deretter dyrket i medium inneholdende 0-5 mM av cysteamin i 24 timer. Fem tilfeldige felt ble valgt, og bildene ble tatt ved hjelp av en invertert mikroskop. Den gjennomsnittlige område (mm
2) av gapet mellom cellelagene ble beregnet ved hjelp IPLab bildebehandlingsprogrammer (BD Biosciences-Bioimaging, Rockville, MD).
HS766T og MIA-PaCa2 celler (2 × 10
6) ble implantert direkte inn i bukspyttkjertelen av 5-6 uker gamle kvinnelige naken
nu /nu
mus og deretter bukhulen og huden ble lukket ved hjelp av klipp. Økende doser av cysteamin ble injisert s.c. som beskrevet i materialer og metoder. Primære svulster og metastatiske lesjoner av ≥ 5 mm ble talt i kjøretøy og cysteamin behandlet mus.
en product:: P 0,05,
b
: P 0,01 og
c product:: P 0,05,
d:
P 0,001. +: Moderate ascites, ++: alvorlig ascites, -:. Ingen ascites
HS766T og MIA-PaCa2 celler (2 × 10
6) ble implantert direkte inn i bukspyttkjertelen på 5-6 uke gammel kvinne naken
nu /nu
mus og deretter bukhulen og huden ble lukket ved hjelp av klipp. Fra dag 4 etter tumorimplantering ble mus ble behandlet to ganger daglig med bærer eller 25, 100, 250 mg /kg /dag av cysteamin til slutten av forsøket. Den mus med tumorer ble avlivet 4 uker etter celle implantasjon. A. En representant mus fra hver behandlingsgruppe husing MIA-PaCa2 svulst vises. Gule piler indikerer primære svulster i bukspyttkjertelen og blå trekanter viser metastatiske lesjoner. I et annet eksperiment, tak og cysteamin behandlede mus ble fulgt for å overleve. Kaplan-Meier overlevelseskurver av mus huser HS766T (B) og MIA-PaCa2 (C) svulster.
Matrigel invasjonen assay
Cell invasjonen ble analysert i BD BioCoat Matrigel invasjonen kamre ( BD Biosciences, 24 brønner, 8 um porestørrelse), som beskrevet tidligere [26]. Kort fortalt ble cellene inkubert med forskjellige konsentrasjoner av cysteamin (0-5 mM) i 24 timer. Ikke-invaderte celler ble fjernet fra den øvre overflate av membranen med en bomullsdott, og cellene på den nedre overflate av membranen ble fiksert og farget med H E. Tre tilfeldige felt per kammer ble talt opp. Data ble vist som gjennomsnitt ± S.D. av tre bestemmelser.
Mus med HS766T svulster ble behandlet med økende doser av cysteamin og kroppsvekt ble målt på dag 10 og dag 25 etter tumor implantasjon. Det var ingen signifikant forskjell mellom behandlingsgruppene.
tumorbærende mus ble behandlet med økende doser av cysteamin og serum ble oppsamlet fra halevenene to ganger, det vil si pre-cysteamin behandling (dag 4) og post- behandling (dag 18). Lever, muskel og nyrefunksjon biomarkører ble evaluert etter cysteamin behandling. Alaninaminotransferase (ALAT), kreatin kinase (CK), aldolase, og kreatinin (Cr) ble målt i hver gruppe. Det var ingen signifikante forskjeller mellom behandlingsgruppene.
Celleviabilitet analysen
Celleviabilitet av bukspyttkjertelkreft cellelinjer ble målt ved å telle levedyktige celler. I korthet, 3 x 10
5 celler ble sådd per brønn i en 6-brønns plate med 2,0 ml fullstendig medium og inkubert over natten for plettering. Cellene ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av cysteamin i 24-48 timer. Etter inkubering ble cellene løsnet med trypsin, vasket og farget med 0,4% trypanblått. Celletallet ble manuelt telles ved hjelp av en hemocytometer og presenteres som antall levedyktige celler per milliliter.
A. På dag 30 etter ortotopisk implantering av kreft i bukspyttkjertelen celler, ble svulster oppsamlet, totalt protein ekstrahert og MMP-aktivitet bestemmes ved hjelp av fluorogent MMP-substrat. B. MMP-9-mRNA-nivåer ble bestemt i total-RNA ekstrahert fra tumorer ved QRT-PCR. β-aktin ble benyttet for en referanse-gen. C. MMP-9 proteinnivået ble bestemt ved hjelp av ELISA. D. Zymographic Assayet ble utført i cysteamin behandlede tumorer. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± S.D. av tre eksemplarer til fire paralleller bestemmelser. Forsøket ble gjentatt to ganger. Statistiske betydninger vises med *: P 0,05, †: p 0,01 og ‡. P 0,001
Måling av MMP aktivitet
MMP aktivitet ble målt ved MCA-KPLGL -Dpa-AR-NH2 Fluorogenic peptidsubstrat (R 5 mm i diameter telles. Den totale vekten av primær tumor og metastatiske noduler ble også målt. Bilder ble tatt umiddelbart etter ofre dyrene. I tillegg ble muse overlevelsestid overvåket i et uavhengig forsøk. Mus ble ofret da de hadde alvorlige ascites eller kakeksi. Mus i begge tumormodeller ble veiet på dag 10 og dag 25 etter behandling Cysteamin.
Måling av enzymer i museserum
Mus ble blod oppsamlet fra halevenen. Serumnivåer av alaninaminotransferase (ALAT), kreatin kinase (CK), aldolase og kreatinin (Cr) ble målt ved hjelp av ulike kits hentet fra Pointe Scientific, Inc. (Canton, MI) og Caldon Biotech, Inc. (Vista, Ca), etter produsentens anvisninger.
MMP aktivitet og MMP-9 uttrykk i primære svulster
Når musene ble avlivet på dag 30, ble primære svulster samlet inn. For ekstraksjon av totalt protein, ble tumoren fuktet med lyseringsbuffer og homogenisert ved hjelp av TissueRuptor (QIAGEN); supernatanten ble oppsamlet. Total RNA ble ekstrahert ved hjelp FastRNA pro grønn kit (MP Biomedicals, Solon, OH) etter produsentens anvisninger. MMP-aktivitet, gelatin hydrolysering av MMP-aktivitet, og de mRNA og proteinnivåene til MMP-9 ble bestemt som angitt ovenfor.
Statistisk analyse
Dataene for enzymatisk aktivitet, ELISA, og QRT-PCR var forhold mellom hver gruppe av ANOVA. Overlevelseskurver ble generert av Kaplan-Meier metoden og sammenlignet ved hjelp av log-rank test.
Resultater
Cysteamine hemmer kreft i bukspyttkjertelen celle migrasjon og invasjon uten å være cytotoksisk for celler
Vi først undersøkt effekten av cysteamin på kreft i bukspyttkjertelen celle invasjon ved hjelp av Matrigel invasjon analysen. For denne analysen har vi brukt 10 forskjellige bukspyttkjertelkreft cellelinjer i et matrigel invasjon kammer. Som vist på fig. 1A og fig S1, cysteamin hemmet celle invasjon i en konsentrasjonsavhengig måte. Selv den laveste konsentrasjon av cysteamin (0,05 mm) betydelig hemmet celle invasjon i alle bukspyttkjertelkreft cellelinjer.
Vi undersøkte neste effekten av cysteamin på migrasjon av samme 10 bukspyttkjertelkreft cellelinjer i invasjonen analysen. For overføringen analysen ble en sårheling test som benyttes. De representative bilder av mobilnettet sårtilheling i HS766T celler er vist i figur 1B. Cellemigrering ble betydelig inhibert ved og over 0,05 mM av cysteamin i alle 10 cellelinjer (figur 1C og fig S2). De sorte horisontale linjer i figur 1B (kjøretøy) viser området på tidspunktet 0 da såret ble gjort. Siden cysteamine mediert lignende effekter i alle 10 cellelinjer i disse analysene, velger vi to tilfeldige cellelinjer for alle andre analyser.
Vi har også undersøkt cytotoksisitet av cysteamin mot to bukspyttkjertelkreft cellelinjer (HS766T og MIA-PaCa2 ). Antall levedyktige celler etter 24 og 48 timers behandling cysteamin ble tellet. Cysteamin viste celle toksisitet ved 12,5 mM konsentrasjon i begge cellelinjene som ble testet, men ingen tegn på toksisitet ble observert ved lavere konsentrasjoner som antallet levedyktige celler som var lik med ubehandlede celler (figur 1D). Disse resultatene tyder på at både celle migrasjon og invasjon ble hemmet på en ikke-cytotoksisk konsentrasjon av cysteamin.
Cysteamine hemmer MMP enzymatisk aktivitet i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer
For å undersøke mekanismen for hemming av cellemigrasjon og invasjon av cysteamin, undersøkte vi effekten av cysteamin på MMP enzymatisk aktivitet. Cysteamin hemmet MMP aktivitet i to representative bukspyttkjertelcancercellelinjene som ble testet i et konsentrasjonsavhengig måte (figur 2A).
IC
50 {konsentrasjonen av cysteamin hvor 50% MMP enzymaktivitet (proteolyse) er hemmet} ble beregnet ved ELISA (figur 3). Cysteamine direkte hemmet hver MMP enzymatisk aktivitet, med en
IC
50 av 38-460 mikrometer. Siden MMP-9 spiller en sentral rolle i bukspyttkjertelkreft invasjon, vi undersøkt sine mRNA og proteinnivåer i begge cellelinjer. I motsetning til den enzymatiske aktivitet, protein og mRNA-nivåer av MMP-9 ble beskjedent øket ved den høyeste konsentrasjon av cysteamin (5 mM) (figur 2B og 2C). Vi observerte også at mRNA for to andre MMP (MMP-12 og MMP-14) viste en beskjeden økning i likhet med MMP-9 i respons til cysteamin-behandling (fig. 2C). I kontrast, zymographic gelatinhydro aktivitet resultater for MMP-9 signifikant forskjellig fra mRNA uttrykk og både pro og aktiv MMP-9 aktiviteter falt betydelig på en doseavhengig måte (figur 2D).
Cysteamine avtar metastaser og forlenger overlevelse av immunsvikt mus implantert orthotopically med menneskelig kreft i bukspyttkjertelen
Vi undersøkte anti-metastase effekten av cysteamin i to ortotopiske musemodeller ved hjelp av humane bukspyttkjertelen kreft cellelinjer. Mus ble behandlet to ganger daglig med cysteamin subkutant fra dag 4 etter tumorimplantering til slutten av forsøket. På dag 30, var antallet og vekten av de primære tumor og metastatiske noduler målt (figur 4). I begge tumormodeller, har størrelsen og vekten av de primære tumorene ikke viser noen forskjell mellom kontroll og behandlede grupper. Imidlertid, cysteamin betydelig redusert antall metastatiske noduler i en doseavhengig måte. Ved høyeste dose (250 mg /kg /dag), cysteamin betydelig redusert antall metastaser av HS766T tumoren ved ~90% (34 til 3,6). Den totale vekten av metastatiske knuter av MIA-PaCa2 tumor ble også redusert med ~90% ved den høyeste dosen. I tillegg er to av fem mus i HS766T tumormodell og 4 av 5 mus i MIA-PaCa2 tumormodell utviklet ascites i deres bukhule. Men ingen mus utviklet ascites ved 100 og 250 mg /kg /dag dose i enten tumormodell. Et representativt bilde av fire mus med MIA-PaCa2 tumor er vist i figur 5A. Vi har også sammenlignet overlevelsen av mus mellom ulike behandlingsgruppene. Mus overlevelsestiden ble betydelig forlenget ved behandling med ≥100 mg /kg /dag cysteamin i begge tumormodeller (figur 5B og 5C).
Vi har også overvåkes nøye den generelle tilstand og kroppsvekt av musene i løpet av forsøksperioden . Det var ingen signifikant forskjell i generelt utseende og kroppsvekt blant fire grupper av dyr i begge tumormodeller (figur 6). På samme måte var det ingen forandring i serumenzymer som representerer leverfunksjon (ALT) eller muskelskade (Aldolase) og heller ikke tegn på skjelettmuskelskader eller nyrefunksjon (kreatinin-kinase og kreatinin) i de cysteaminbehandlede gruppene (figur 7). Dessuten ble ingen systemisk giftighet påvist i noen vitale organer som lever, nyre, hjerne, hjerte, lunge og i cysteamin-behandlede mus når de evalueres ved histologisk undersøkelse (figur S3).
Cysteamin avtar MMP-aktivitet i primære tumorer ortotopiske
MMP-aktivitet i primær ortotopiske tumorene ble målt på dag 30. Cysteamin redusert MMP-aktivitet i både tumorer (HS766T og MIA-PaCa2) ved 100 og 250 mg /kg cysteamin doser (figur 8A). I de samme prøvene, målt vi mRNA ved hjelp av Q-RT-PCR og proteinnivåer av MMP-9 ved hjelp av ELISA. I motsetning til
in vitro
resultater, gjorde cysteamin ikke påvirke mRNA og proteinnivåer av MMP-9 i primære svulster høstet fra mus (Figur 8B og 8C). Imidlertid zymografi assay for MMP-9 viste en doseavhengig reduksjon i gelatinase aktivitet (fig. 8D).
diskusjon
Vi viser at cysteamin hemmer bukspyttkjertelkreft cellemigrering og invasjon ved direkte hemming av MMP enzymatisk aktivitet
in vitro
. Denne nyoppdagede eiendom cysteamin resulterte i hemming av metastasering av menneskelig kreft i bukspyttkjertelen celler orthotopically implantert på bukspyttkjertel av immunsvikt mus; Effekten var cysteamindoseavhengig. Cysteamin redusert ikke bare antall metastaser i bukhulen, men også redusert ascites generert av aggressiv bukspyttkjerteltumormetastase. I motsetning til dette ble det ikke observert noen signifikant forandring i størrelsen eller vekten av den primære tumor i bukspyttkjertelen. I samsvar med denne observasjonen gjorde cysteamin ikke forårsake noen virkning på cellelevedyktighet i bukspyttkjertelkreft linjer opp til en konsentrasjon som forårsaket signifikant inhibering av cellemigrering og invasjon. Mus behandlet med cysteamin levde lengre tid sammenlignet med kontrollmus som ble behandlet med hjelpestoff. Begge
in vitro Hotell og i primære svulster
in vivo
, redusert MMP enzymatisk aktivitet med cysteamin behandling mens deres uttrykk på mRNA og proteinnivåer ikke endret. Zymographic Resultatene bekreftet cysteamin indusert MMP-hemning
in vitro
og
in vivo.
Disse observasjonene indikerer at blokkering av katalytiske aktiviteter av MMP’er ved cysteamin er kritisk i hemming av tumormetastase i dyremodell av bukspyttkjertel kreft.
De anti-metastatiske effekten av cysteamin ble formidlet uten synlige tegn på toksisitet. Mus behandlet med selv den høyeste dosen av cysteamin (250 mg /kg /dag) viste ingen bivirkninger relatert til generelle utseende, kroppsvekt, muskelskader, serumenzymer og serumkreatininnivåer. I tillegg er store organer fra behandlede dyr viste ingen tegn på histologiske skader. Disse observasjonene stemmer overens med den kjente sikkerhetsprofilen av cysteamin hos mennesker [2], [3]. Cysteamine forårsaket bare gastrointestinale symptomer hos personer, som det økt magesyre produksjon og redusert gastrointestinal motilitet [31]. Imidlertid ble disse effektene kontrollert ved samtidig bruk av protonpumpehemmer [32]. Det er bemerkelsesverdig at cysteamine tilstrekkelig hemmet kreft celle migrasjon og invasjon
in vitro
på 50 mikrometer, en konsentrasjon som kan oppnås
in vivo
. Oral administrering av cysteamin (gitt med 6 timer ved 60 til 90 mg /kg kroppsvekt per dag) kan øke cysteamin plasmanivået opp til ~ 50 pM [3], [33] – [35]. I tillegg, 100 mg /kg /dag s.c. injeksjon av cysteamin i dyr er lik den anvendte dose for cystinose, og denne dosen en signifikant reduksjon i tumormetastase og forlengelse av overlevelse. Vi anser at cysteamin kan trygt administreres i klinikken for å kontrollere kreft i bukspyttkjertelen metastaser.
Begge mRNA og proteinnivåer for MMP-9 var beskjedent til moderat oppregulert
in vitro
ved høyeste dose av cysteamin. Tilsvarende mRNA av MMP-12 og 14 ble også beskjedent oppregulert ved den høyeste dosen. Denne økningen i MMP-9 ble ikke observert
in vivo
, kanskje fordi kreft i bukspyttkjertelen celler ble inkubert med cysteamin bare i 24 timer, mens
in vivo
tumorer ble utsatt for cysteamin kontinuerlig i 27 dager. Vi gjorde ikke forsøk på å måle cysteaminnivåer i svulster
in vivo
fordi intracellulære metabolske skjebne av cysteamin
in vivo
er svært komplisert og vanskelig å måle fordi det binder seg til gratis tiol, spesielt cysteiner av cellulære proteiner. I stedet, avhengig vi hovedsakelig på de biologiske effektene av cysteamin på MMP virksomhet og tumorvekst. Ikke desto mindre, den økte MMP-9, MMP-12 og MMP-14 nivåer ved den høyeste konsentrasjonen
in vitro
kan representere en midlertidig kompenserende virkning av celler på grunn av en plutselig reduksjon av MMP aktivitet ved cysteamin. I motsetning til den katalytiske aktiviteten til MMP-9 hydrolyserer gelatin i zymografi analysen viste ingen slik oppregulering etter behandling med høyeste dose av cysteamin av bukspyttkjertelcancercellelinjene
in vitro
samt ortotopiske tumorer
i vivo
. Faktisk i zymografi assay for MMP-9, cysteamin forårsaket en doseavhengig reduksjon i gelatinase aktivitet. Disse resultater antyder at enzymatisk inhibering av MMP-9 ved cysteamin kan være involvert i reduksjon av invasjon og metastase av kreft i bukspyttkjertelen. MMP1, MMP2, MMP7, og MMP9 har også blitt vist å bli uttrykt i bukspyttkjerteltumor [36], [37], men effekten av cysteamin på protein og mRNA-nivåer for alle disse MMP ble ikke undersøkt med unntak av MMP9. Således, foreliggende undersøkelse mangler data på effekten av cysteamin på protein og mRNA-nivåer for alle MMPs, inkludert MMP2. Det er imidlertid viktig å påpeke at cysteamin hemmet enzymatisk aktivitet av MMP’er, som omfatter alle MMP’er.
Den anti-MMP-aktivitet av cysteamin var lavere enn den til bestemte MMP-inhibitorer så som marimastat og batimastat (
IC
50
nM til lave mikrometer i forhold til høy mikrometer utvalg for cysteamin), men cysteamine kan bedre tolerert
in vivo
. Faktisk batimastat hatt problemer med dårlig oral biotilgjengelighet [24] og marimastat mislyktes i klinikken som høyere dose produsert høye muskel toksisitet og dårlig overlevelse hos pasienter med brystkreft metastase [38]. I den foreliggende undersøkelse, mus tolereres opp til 250 mg /kg /dag cysteamin uten noen synlig, biokjemiske eller histologiske tegn på toksisitet eller muskulær skade.
I tidligere kreft behandlingsstudier, ble cysteamin brukt på grunn av sin anti- oksidative og radio-beskyttende effekt [39]. I disse studiene ble det observert at cysteamin hadde også anti-kreftfremkallende og anti-proliferative aktivitet i en rekke kreftformer. Vi rapporterer nå at cysteamine utøver anti-MMP og anti-metastatiske effekter. Imidlertid, cysteamin ikke påvirke den primære bukspyttkjerteltumorstørrelsen, noe som tyder på at det må brukes samtidig med andre antitumormidler, for eksempel gemcitabin for optimal anticancer-effekter [13].
