Abstract
Bakgrunn
Forstå de molekylære funksjonene til spesifikke svulster kan øke vår kunnskap om mekanismen (e) underliggende sykdomsutvikling og progresjon. Dette er spesielt viktig for tykktarmskreft, som er en heterogent kompleks av sykdommer som er utviklet på en sekvensiell måte gjennom en flertrinns kreftfremkallende prosess. Som sådan, er det sannsynlig at svulster med tilsvarende egenskaper kan stamme på samme måte og har en lignende molekyl oppførsel. Derfor kan spesifikk kartlegging av de molekylære egenskaper være potensielt nyttige for både tumor klassifisering og utvikling av hensiktsmessige terapeutiske regimer. Dette kan imidlertid bare oppnås ved å utvikle høy affinitet molekylære prober med evnen til å gjenkjenne spesifikke markører assosiert med forskjellige tumorer. Aptamerer kan lettest møte denne utfordringen basert på deres mål mangfold, fleksibel manipulasjon og enkel utvikling.
Metode og resultater
Ved hjelp av en metode som kalles cellebasert Systematisk Evolution of ligander ved eksponentiell berikelse (celle-SELEX) og tykktarmskreft dyrkede cellelinjer DLD-en og HCT 116, valgte vi et panel av target-spesifikke aptamerer. Bindingsstudier ved flowcytometri og konfokal mikroskopi viste at disse aptamerer har høy affinitet og selektivitet. Våre data viser videre at disse aptamerer verken gjenkjenne normal kolon celler (dyrket og frisk), heller ikke de kjenner igjen de fleste andre kreftcellelinjer testet.
Konklusjon /Betydning
De valgte aptamerer kan identifisere spesifikke biomarkører forbundet med kolorektal kreft. Vi mener at disse probene kan videreutvikles for tidlig deteksjon, samt prognostiske markører, av kolorektal kreft
Citation. Sefah K, Meng L, Lopez-Colon D, Jimenez E, Liu C, Tan W (2010) DNA aptamerer som molekylære prober for tykktarmskreft Study. PLoS ONE 5 (12): e14269. doi: 10,1371 /journal.pone.0014269
Redaktør: Dimitris Fatouros, Aristoteles-universitetet i Thessaloniki, Hellas
mottatt: 3 mai 2010; Godkjent: 16 oktober 2010; Publisert: 10.12.2010
Copyright: © 2010 Sefah et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Work var finansiert av følgende: NIH: R01 GM079359: Utvikling av molekylære prober for Biomedical Applications; NIH CA122648, berikelse og Påvisning av ekspandert kreftceller. Midlene etaten hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
introduksjon til
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er den tredje vanligste kreftformen (10-15% av alle krefttilfeller) og en av de viktigste årsakene til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis, med anslagsvis en halv million dødsfall på verdensbasis og over femti tusen dødsfall i USA alene.
CRC er en heterogen kompleks av sykdommer forårsaket av destruktive genetiske /epigenetisk endringer som akkumuleres i en sekvensiell måte gjennom en flertrinnskreftfremkallende prosessen [1]. Det er derfor sannsynlig at svulster med tilsvarende egenskaper kan stamme på samme måte og har en lignende molekyl oppførsel. Siden de molekylære egenskapene til en gitt svulst reflektere mekanismen (e) underliggende sykdom utvikling og progresjon, implikasjonen for svulst klassifisering er betydelig. For eksempel har molekylær klassifisering av leukemi og lymfomer enormt forbedret vår forståelse av disse sykdommene [2], [3], [4]. Etterforskningen av de molekylære grunnlaget for to store syndromer, familiær adenomatøs polypose (FAP) og arvelig nonpolypsis CRC (HNPCC), har ført til identifisering av to hovedveier der disse molekylære hendelser kan føre til CRC [5]. Rundt 85% av CRC oppstå hendelser som resulterer i kromosomal instabilitet (CIN), med Aneuploidy og tidlig inaktivering av adenomatosis polypose coli (APC). En ytterligere 15% resultat fra prosesser som genererer mikro ustabilitet (MSI), replikering feil eller tap i vaktmester mismatch reparasjon (MMR) funksjon i forbindelse med HNPCC [6], [7], [8], [9]. Selv om vi har forbedret vår forståelse av de molekylære hendelser som ligger bak utvikling av CRC, har ingen signifikant innvirkning på pasientbehandlingen resulterte. Selv om betydelig fremgang som er gjort i behandlingen av pasienter med CRC bruker folsyre (FA) -modulated 5-flurouracil (5-FU), ca 50% av CRC pasientene etter hvert utvikle metastatisk CRC (mCRC). Imidlertid har bruken av nye kjemoterapeutika, for eksempel oksaliplatin eller irinotekan, enten alene eller i kombinasjon med godkjente biologiske midler, slik bevacizumab og cetuximab, lover å forlenge overlevelsen [10], [11].
Derfor for å maksimere de tilgjengelige behandlinger, er det kritisk viktig å få enda mer innsikt i de molekylære mekanismene bak sykdomsutvikling og progresjon, samt forbedre vårt arbeid for å belyse nye terapeutisk relevante mål og molekylære markører. Slike tiltak vil bidra til å utvide og diversifisere sykdom ledelse alternativer. Studier har også vist at det å flytte sykdom deteksjon til et tidligere trinn ved massescreening og intervensjon på dette stadiet kan redusere risikoen for å dø av CRC [12], [13]. Disse resultatene demonstrerer den sterkt klinisk behov for biomarkører for tidlig deteksjon av CRC slik at sykdommen kan bli effektivt håndtert.
Genomiske teknikker, slik som DNA mikromatriseanalyse, og proteomic metoder, slik som to-dimensjonal (2- -D) elektroforese og massespektrometri, som nå vanligvis brukes for å belyse de uttrykk profiler av gener og proteiner i celler, vev og kroppsvæsker [14], [15]. Faktisk kan identifisering av gener og proteiner som er karakteristisk produsert under utviklingen av kreft potensielt avdekke nyttige biomarkører som vil hjelpe i forvaltningen av CRC. Selv proteomikk har spilt en dominerende rolle innen utvikling av biomarkører [16], og vil fortsette å gjøre det, dagens proteomikk strategiene ikke genererte nok markører for CRC.
Interessant, CRC en av de første kreft som tumor markører ble anvendt for å hjelpe til i sykdomshåndtering. For eksempel har carcinoembryonic antigen (CEA) blitt benyttet i stor utstrekning for å bestemme prognose og overvåke både sykdomsutviklingen og behandling etter kurativ reseksjon. Et høyt nivå av CEA i serum er forbundet med progresjon av kreft. Imidlertid, selv i fravær av kreft, høye nivåer av CEA er blitt rapportert i tilstander slik som hepatitt, pankreatitt, inflammatorisk tarmsykdom og obstruktiv lungesykdom. I tillegg kan andre kreftformer, så som bukspyttkjertel, mage, lunge og bryst, har forhøyede nivåer av CEA, noe som indikerer mangel på spesifisitet av denne markøren. Andre markører, slik som karbohydrat antigen 19-9 (CA19.9), CA242, metalloproteinaser-1 (TIMP-1), tymidylatsyntase, p53, og
APC
-genet, alt mangler den nødvendige sensitivitet og spesifisitet. For å være klinisk nyttig, må en biomarkør være effektiv og har høy prediktiv verdi [7], men ingen slike enkelt biomarkør eksisterer. Selv om ingen konsensus er nådd, ser det ut til at utviklingen av flere biomarkører for påvisning og risikovurdering av en enkelt kreft er favoriserte over enkelt omfattende biomarkører som kan suksessivt forutsi risikoen for alle typer kreft [7]. Dette er enda mer viktig som multipleksing metoder blir mer av en norm enn unntak.
Biomarkører som er direkte forbundet med tumorceller som de er forvandlet fra normalitet til malignitet vil være av betydelig interesse som disse markørene kan være nyttige verktøy for å kartlegge de molekylære funksjonene i syke celler. Muligheten av prober for å identifisere et viktig klinisk prøve, såsom ekspandert ondartede colonocytes, i stedet for normale colonocytes, ville være spesielt viktig for CRC [16]. Nærmere bestemt har når eksfolierte celler fra kolon mukosa blitt sloughed inn i avføringen, er det allerede blitt vist at DNA fra avføring kan isoleres og utsettes for en multi-mål-DNA-analyse. Denne analysen kan for tiden vurdere 15 mutasjons hot spots, inkludert k-ras, p53, APC, BAT-26 og L-DNA. Selv om DNA fecal markører er ganske lovende, de er ikke mye brukt i kliniske settinger og derfor sonder som spesifikt kan oppdage cellene vil være viktig.
I utviklingen av sensitive, selektive molekylære markører for CRC, cellebasert aptamer utvalget har betydelige løftet av sitt potensial til å identifisere flere nyttige markører på relativt kort tid. I løpet av de siste to tiårene, har betydelige anstrengelser er gjort for å utvikle markører for ulike typer kreft ved hjelp av en prosess som kalles den Sytematic Evolution of ligander ved eksponentiell berikelse (SELEX) [17], [18]. Gjennom denne fremgangsmåte, har en rekke oligonukleotidprober (aptamerer) er generert som kan binde seg spesifikt til proteiner forbundet med membraner av forskjellige tumorceller [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25], [26]. Aptamerer er korte, enkelt-trådede oligonukleotider (DNA eller RNA), som vanligvis 100 mer, som har evnen til å bindes til andre molekyler med høy affinitet og spesifisitet. De har blitt generert mot en rekke mål fra små molekyler [27], [28], [29], [30] og peptider /proteiner [31], [32], [33], [34], [35] , [36] til hele celler [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25], [26], så vel som bakterier, virus og virus-assosierte proteiner [37 ], [38], [39], [40], [41], [42], [43]. Den cellebasert utvalg strategi genererer aptamerer som binder seg til ukjente mål i sin opprinnelige tilstand. Ikke desto mindre, kan målet fremdeles bli identifisert gjennom affinitet ekstraksjon og massespektroskopi [44], [45]. For å skape mer sensitive og selektive prober for CRC, har vi utviklet et panel av DNA aptamerer som spesifikt gjenkjenner kolorektal kreftceller. Disse prober ble dannet ved celle-SELEX ved hjelp av tykktarmskreftcellelinjer dyrket DLD-1 og HCT 116. Innledende bindingsstudier ved strømningscytometri og konfokal mikroskopi ved hjelp av disse dyrkede cellelinjer viser at de fleste av våre aptamerer har høy affinitet og selektivitet. Våre data videre viser at disse aptamerer verken gjenkjenne normale tykktarmceller (dyrkede), heller ikke de erkjenner et flertall av andre kreftcellelinjer som ble testet. Resultatene viser klart at sondene identifisere spesifikke membranproteiner forbundet med kolorektal kreft. Vi mener at disse probene kan videreutvikles for tidlig deteksjon, samt prognostiske markører, av kolorektal kreft.
Resultater
I løpet av det siste tiåret, flere aptamerer har blitt utviklet for ulike mål , inkludert rensede molekyler, så vel som komplekse mål, slik som levende celler av forskjellige kreftformer. Vi har brukt cellebasert SELEX strategi for å generere et panel av DNA aptamerer for kolorektal kreft. En tilfeldig ssDNA basseng (ca. 10
14) ble underkastet sekvensiell binding og eluering for å velge fra bassenget DNA-sekvenser som har evne til å binde seg til overflaten markører for målcellen. DLD-en og HCT 116 ble brukt som mål med HCT1116 og HT-29 som respektive kontroller i separate valg. Innføringen av disken utvalget gitt mulighet til å eliminere, i den grad det er mulig, felles overflatemarkører, mens på samme tid berikende differensial markører på målcellene. DNA pool oppsamlet etter hvert seleksjonsrunde ble amplifisert ved PCR, og produktet ble brukt til å fremstille ssDNA for den neste seleksjonsrunde. I dette valget strategien ble inkubering av DNA pool med cellene utført på kulturskåler (cellemonolag). Anriking av det merkede bassenget gjennom suksessiv utvalget ble målt ved flow-cytometri. For å kunne bruke cellene i flowcytometri, ble celler dyrket over natten og dissosiert ved bruk av kort tid (30 sek-1 min) trypsin behandling og /eller ikke-enzymatisk celledissosiasjon oppløsning (MP Biomedicals). Kort tid behandling med trypsin ikke hadde noen observerbar effekt med hensyn til evnen av valget bassenget for å gjenkjenne cellene, ettersom ble ikke observert noen forskjell mellom signalintensitetene av trypsin og ikke-enzymatiske behandlinger (Text S1, figur S1 ). Peak skift (økning i fluorescensintensiteten i forhold til biblioteket) er en indikasjon på fluorescensintensitet av cellen som et resultat av den merkede DNA-sekvens-binding til cellene (figur 1). Med det økende antall valgsykluser, var det en jevn økning i fluorescensintensiteten til målcellene, noe som indikerer at DNA-sekvenser med bedre binding til målcellene ble anriket. Det var imidlertid ingen signifikant toppforskyvning med kontrollcellene, særlig i begynnelsen og midten av seleksjonsrunder. Ved 14
th seleksjonsrunde, var det en signifikant økning i fluorescens signal av målet i forhold til kontrollcellene. En ytterligere to runder (16
th rund) førte til en økning i signalforbedring for kontrollprøven, men ingen signifikant økning for målet. Dette er mulig ved den terminale enden når valget er fortsettes ytterligere, selv når det ikke er noen signifikant signal forskjell mellom de suksessive bassenger til målet. De høyanriket bassengene ble klonet og de positive kloner sekvensert. Sekvensanalyse gitt potensielle DNA aptamer kandidater gruppert i familier basert på deres sekvens homologi. Ca 8 forskjellige homologe familier og mange randomiserte sekvenser ble identifisert for DLD-en markering. Antallet av sekvensene i de forskjellige homologe familiene varierte 6-110 (tabell 1) med få basemutasjoner innenfor en familie. Representative sekvenser fra de ulike familiene ble valgt til å teste sine interaksjoner med målet.
Retning på pilene viser økende runder med utvalg fra fem
th -16
th bassenget. Ettersom valget forløp var der høyere tilsvarende økning i fluorescens-intensitet til målet enn kontrollen. Den plutselige økningen i fluorescens signal av kontroll fra 14
th til 16
th runde uten tilsvarende økning i målet indikerer høyere berikelse.
Den rullende syklus forsterkning (RCA ) produkter av sekvensering ble anvendt for den innledende screening. Produktene fra de valgte brønner ble fortynnet med 100 pl H
20 og anvendt for PCR-amplifikasjon. PCR-produktene ble anvendt for å fremstille ssDNA og deretter anvendt for bindingsanalyser. To sekvenser som har minst en basemutasjon ble valgt fra familier med sekvenser som er større enn 20 (tabell 1). Bruken av RCA produktet gitt oss en raskere metode for screening for potensielle aptamer kandidater. Sekvensene med bindingssignal som er større enn den til kontrollgruppen (Text S1, S2 figuren) ble kjemisk syntetisert og merket med fluorescein-isotiocyanat (FITC) eller biotin ved 3′-enden. Alle syntetiserte sekvenser ble renset ved HPLC og deretter kvantifisert. Bindingsanalyser ble utført ved hjelp av strømningscytometri, som beskrevet, og bindingen signal ble detektert direkte i FL1-FITC for prober, FL2 for streptavidin-konjugert PE eller FL3 for streptavidin-konjugert PE-Cy5.5. Den innledende bindingsanalyser med de syntetiserte sekvenser kalt KDED1 til KDED20 avdekket mange sekvenser som binder til celle målet (figur 2). Noen av sekvensene som tilhører den samme familie, og derfor tenkes som skal bindes til det samme mål, viste forskjellige signalstyrker binding til målet. Disse inkluderer KDED2 /KDED15; KDED1 /KDED5; KDED9 /KDED10, KDED3 /KDED19 og KDED7 /KDED18.
Celler ble skilt med ikke-enzymatisk dissosiasjon løsning. Cellene ble vasket og inkubert med forskjellige aptamer kandidater (blå histogram). Fluorescens-signalet ble detektert ved streptavidin-PE-cy5.5. Den uselektert Biblioteket ble brukt som bakgrunn fluorescens signal (svart histogram). Alle aptamerer A (KDED2), B (KDED5), C (KDED7), D (KDED15), E (KDED19), F (KDED20).
co-current valg, ved hjelp av DLD -1 (uten negativ seleksjon) og HCT 116 som mål, også generert følgende aptamerer: KC2D3, KC2D4, og KC2D8 for DLD-en. KCHA10 og KCHB10 for HCT 116 (figur 3)
A (KC2D3 ), B (KC2D4), C (KC2D8). D (KCHA10), E (KCHB10).
Alle de utviklede aptamerer ble testet videre med alle kolorektal kreft cellelinjer brukt i denne studien. Følgende aptamerer viste anerkjennelse bare til cellelinje som brukes for valg: KDED2 /KDED15, KDED7 /KDED18, KDED9 /KDED10 og KC2D3 (DLD-1) og KCHB10 (HCT 116). Figur 4 viser billedlig fremstilling av samspillet mellom de enkelte aptamerer og de tre forskjellige kolorektal kreft cellelinjer. Høyden av kjeglen representerer prosentandelen av celler som hadde fluorescens intensitet over kontroll bibliotek med terskelen satt til 5% fluorescens signalintensiteten.
Bindingsanalyser ble utført med DLD-1, HCT 116 og HT-29 . Bakgrunnen fluorescensintensitet av biblioteket ble satt under 5% og fluorescenssignalet av de individuelle aptamerer ble deretter bestemt og anvendt i avbildning som vist.
Vi deretter bestemmes de tilsynelatende dissosiasjonskonstanter (Kd) for de valgte aptamerer, som varierte mellom 0,68 nM og 302 nM (tabell 2 og figur 5). For å øke effektiviteten syntese og også øke fleksibiliteten i kjemisk manipulering, ble noen av de aptamerer avkortet, og bindingsstyrken og tilsynelatende KdS av de avkortede sekvenser ble også vurdert. Før hver trunkering, ble de mulige strukturer av hver aptamer sekvens beregnet med Integrerte DNA Technologies oligoanalyzer under valget forhold. Det mest gunstige hårnålstrukturer ble valgt og henge over baser i 3′- og /eller 5′-ende fjernet, hver på en gang. Serie av trunkeringer ble gjort, og hver av disse ble til slutt testet med positive celler for å vurdere binding. Den avkutting av KCHA10 (KCHA10a) ikke endre egenskapene til aptamer. Men betydelig forbedring av bindende affinitet ble observert med KDED7 trunkering (KDED7a) og ulike former for KDED2 (KDED2a, KDED2a-en og KDED2a-3), som vist i de forbedrede slektskap til den avkortede versjoner (tabell 2). For eksempel, den Kd på KDED7 forbedret fra 157,3 nM til 46,8 nM, omtrent tre gangers forbedring, mens KDED2 forbedret fra 191,9 nM til 29,9 nM, en 6-gangers forbedring. Resten viste ingen observerbar binding til målet. I nesten alle analysene rapportert, har vi benyttet alle de individuelle sekvensene (avkuttet og full- lengde) av KDED2, siden forskjellen i bindingsaffinitet kan påvirke sensitiviteten til en spesiell assay.
Celler ble inkubert med varierende konsentrasjoner av biotin-merket aptamer i duplikat. Den florescence signal ble påvist med streptavidin-PE-cy5.5. Den midlere fluorescensintensitet av umerket biblioteket (bakgrunnsbinding) ved hver konsentrasjon ble trukket fra den midlere fluorescensintensitet av den tilsvarende aptamer. Selve fluorescensintensitet ble innpasset i Sigmaplot for å bestemme den tilsynelatende Kd.
Vi undersøkte selektiviteten ytterligere ved å teste interaksjonen mellom aptamerer og dyrkede normale cellelinjer, så vel som cellelinjer fra tidligere kreft, inkludert leukemi, lunge, eggstokk, hjerne og livmorhalskreft. Som vist i tabell 3, av de testede aptamerer, KDED19 og KC2D8 viste signifikant signalintensitet over kontroll biblioteket til noen av cellelinjene. For eksempel var det betydelig anerkjennelse (≥ +++) av KDED19 til CAOV3, TOV21G, CEM og H661, mens Hela og U87MG viste redusert signal (tabell 3). KC2D8 viste en trend gjenkjennelse sammenlignes med KDED19 med cellelinjene som ble testet (tabell 3). Det var ingen observerbar signal fra de andre aptamerer med noen av cellelinjene som ble testet, inkludert de normale tykktarm cellelinjer (CCD18Co og FHC) og friske humane tykktarmceller (Text S1, figur S3). Dette innebærer at de fleste av de utviklede aptamerer er spesifikke for kolorektal kreft (Tabell 3). Denne observasjonen er viktig som det gir mange mulige alternativer for videre utvikling av disse aptamerer for kolorektal kreft studier. På grunn av den tilsvarende binding mønsteret observert med KDED19 og KC2D8, spesielt signalet med CEM, bestemte vi oss for å bruke Sgc8 mot disse aptamerer i de påfølgende konkurranseanalyser foreløpige bekrefte målet molekylet.
Generelt celle-SELEX strategi produserer forskjellige typer aptamerer for forskjellige mål og /eller de samme mål som er tilstede på den ekstracellulære overflaten av cellene. Vi utførte derfor kompetitive analyser for å vurdere om noen av disse aptamerer, særlig de fra forskjellige familier, vil kunne påvirke bindingen av den andre. Selvfølgelig, det var rimelig å anta at sekvenser syntetisert fra samme familie vil konkurrere; også, vil sekvenser som binder ulike celler ikke konkurrere seg imellom. For eksempel er det mulig for KDED2 å konkurrere med KDED15, men det er lite sannsynlig at den vil konkurrere med KDED5 eller KCHA10. På bakgrunn av dette utførte vi konkurranse fra KDED2 (FITC) mot KDED7, KDED10, KDED18, og KC2D3 (umerkede), og KCHA10 (FITC) mot KDED5, KDED20, KC2D4, KDED19 og KC2D8 (umerket), slutter med KC2D4, KC2D8 og KDED19 mot CEM aptamer Sgc8 (umerkede). Ti-gangers overskudd av umerket konkurrent ble først inkubert med DLD-en før innføringen av FITC-merket aptamer. Dette sikret konkurransefortrinn og potensialet for å mette og blokkere bindingen av den andre aptamer hvis de begge er bundet til samme mål, eller dersom binding av en påvirket bindingen av den sekundære aptamer. Umerket KDED2 og KCHA10 ble anvendt i disse analysene som positiv kontroll. KDED2 bindende ble ikke påvirket av noen av de aptamerer testet mot den. Likeledes kan vi ikke observere noen konkurranse mellom KCHA10 og eventuelle konkurrerende aptamerer. Det var imidlertid betydelig innflytelse på bindingen av KDED19, KC2D4, og KC2D8 i nærvær av 10-gangers overskudd av umerket Sgc8 (Text S1, figur S4). Dette resultatet tyder på at disse kan være aptamerer binding til det samme mål som Sgc8. Dette tyder videre på at KDED19, KC2D4 og KC2D8 vil konkurrere seg imellom, selv om vi ikke utfører slik konkurranse analyse. Disse aptamerer ble utviklet ved hjelp av DLD-en, som ikke har den opprinnelige blokkering ved hjelp Sgc8. Dette støtter ideen om at det er praktisk mulig å blokkere en kjent markør for å tillate utvikling av prober for mål av interesse.
Immunohistologisk bildebehandling og fluorescens mikroskopi har vært mye brukt i studiet av solide svulster, og i spesielt kolorektal kreft. Derfor har vi også vurdert om disse aptamerer kan brukes for tumoravbildning med positiv cellelinje. I denne foreløpige studien brukte vi dyrkede cellelinjer. Her utførte vi bmdingsanalyser i kultur retter lignende til valg protokollen, men med celle samløpet av over 60%. Etter vask ble signal oppdaget med PE-streptavidin konjugert eller streptavidin-Alexa Fluor 633. Figur 6 viser confocal bilder av KDED2, KDED3, KDED5 og KDED7 oppdaget med PE-streptavidin. Det var signifikant signalstyrken av de testede aptamerer sammenlignet med umerket biblioteket. Signalet mønsteret viser at aptamerer bindes til overflaten av cellene som er festet til kulturskålen.
Celler ble inkubert med aptamer konjugert med biotin og bindings arrangementet ble observert med PE-konjugert streptavidin. A (uselektert bibliotek viser bakgrunnen bindende); B (KDED2); C (KDED3); D (KDED5) og E (KDED7).
På samme måte ble betydelig fluorescens signal observert fra streptavidin-Alexa Fluor 633 konjugater når DLD-en ble brukt mot de andre aptamerer, inkludert KCHA10, KC2D8, KDED18 , KDED19, og KDED20 (figur 7), så vel som HCT 116 celler med KCHA10 og KC2D8. Som forventet, hadde KDED2 ikke binde HCT 116. Intensiteten av fluoroforen signal fulgte det samme mønster som strømningscytometri. Interessant, KC2D8 viste en sterkere signal med HCT 116 enn med DLD-en.
Celler ble inkubert med aptamer konjugert med biotin og forpliktende hendelsen ble observert med AlexaFluor 633 konjugert streptavidin. Uselektert bibliotek viser bakgrunnen bindende. Aptamerer viser signifikant binding over bakgrunnssignalet. For DLD-1 celler, A = umarkert bibliotek; B = KCHA10; C = KDED19; D = KC2D8; E = KDED18; F = KDED20 og for HCT 116 celler, G = umarkert bibliotek; H = KCHA10; I = KC2D8 og J = KDED2a-3.
Det er vanlig å anta at aptamerer utvalgte mot tumorcellelinjer binde seg til overflaten proteiner. Dette er blitt vist i de fleste av SELEX Protokoller som innbefatter tumorcellelinjer [44], [45]. For ikke å oversette helt ethvert av SELEX data til den andre, utførte vi analyser for å bestemme en preliminær molekyler på celleoverflaten til hvilken de valgte aptamerer ville binde. I denne analysen ble DLDL-1-celler ble behandlet med trypsin og /eller proteinase K i 15 minutter ved 37 ° C. Etter inkuberingsperioden, ble proteaseaktiviteten stoppet ved tilsetning av iskald kulturmedium inneholdende FBS. Cellene ble raskt vasket to ganger ved sentrifugering og deretter inkubert med aptamerer. De ubehandlede celler ble anvendt som positiv kontroll. Figur 8 viser responsen av den aptamer bindingen etter proteaseaktivitet. Bortsett KDED5 og KCHA10, alle de andre aptamerer tapt anerkjennelse i både trypsin og proteinase K-behandlede celler. De fluorescenssignaler redusert til bakgrunnen, som indikerer at behandling av celler med proteasene som skyldes nedbrytning av målproteinet. For KDED5, var det betydelig reduksjon i signalintensitet, men det KCHA10 signalet redusert kun marginalt, noe som indikerer at målene ikke ble helt påvirket av behandlingen.
Celler ble behandlet med trypsin og proteinase K i 15 minutter og deretter inkubert med aptamer. Den ubehandlede cellen inkuberes med aptamer ble anvendt som positiv kontroll. Svart histogram, (umarkert bibliotek med ubehandlede celler); rød (aptamer med ubehandlede celler); blå (uselektert bibliotek med trypsin behandlede celler); lilla (aptamer med trypsin behandlede celler) og kalk (aptamer med proteinase K behandlet). Følgende aptamerer ble vurdert; A (KDED2); B (KDED5); C (KDED10); D (KDED18); E (KDED20); F (KCHA10); G (KC2D3); H (KC2D4), I (KC2D8). Med unntak av KDED5 og KCHA10 som reduserte bare minimalt, signalet av alle andre reduseres betraktelig
Vi forutsett to mulige årsaker:. 1) for kort tid av protease behandling og /eller 2) målmolekyler ha vesentlige deler andre enn proteiner, så som karbohydrat eller tungt glykosylert protein ikke i sin helhet utsettes for proteasenedbrytning. Som svar, utførte vi lang tid (30 min og 1 time) protease behandling med høye konsentrasjoner av proteinase K, samt glykosidase behandling. Økningen i protease-konsentrasjon, samt lang inkubasjonstid, ikke påvirke bindingen av disse to aptamerer. I tillegg hadde ikke inkubering av cellene med O-bundne og N-bundne glykosidaser, etterfulgt av protease-behandling ikke i betydelig grad påvirke bindingen av disse to aptamerer. Vi mener at de glykosidase analyser ikke kan være avgjørende siden vi ikke finne litteratur som støtter effektiviteten av denne analysen bruker dyrkede cellelinjer i stedet for ren glykoprotein.
Utviklingen av aptamerer som vil binde seg til målet ved varierende forhold , spesielt ved fysiologisk temperatur og i dyrkningsmediet, er viktig. Dette vil øke fleksibiliteten som disse aptamerer kan bli vedtatt og implementert i mange analyseplattformer. Vi har derfor beregnet bindingen av aptamerer ved 37 ° C, i dyrkningsmediet, og under begge betingelser samtidig. Som vist i figur S5 (Text S1), KDED2, KDED2a, KDED2a-1 (samme aptamer, men forskjellig sekvens lengder) og KCHA10 opprettholdt signifikant binding til DLD-1-celler. De signalstyrker var ikke signifikant forskjellig fra assayene ved 4 ° C. På den annen side hadde de andre aptamerer redusert signalintensiteten til DLD-1. Signalet forskjellen kan være et resultat av differensiell affiniteten av individuelle aptamerer. For eksempel, KDED2 (bedre affinitet) og KDED15 tilhører den samme familie, men KDED15 viste ikke signifikant binding ved 37 ° C. I de RPMI-1640 eksperimenter, KEDE2, KDED2a og KDED2a-1 utviste like bindingsstyrke, selv når inkuberingen ble utført ved 37 ° C. KDED5 og KCHA10 viste redusert, men signifikant binding, i motsetning til de gjenværende aptamerer (Text S1, figur S6), og noen av disse viste nesten ingen binding. Denne observasjonen er viktig i den videre utviklingen av aptamer baserte analyser, for eksempel målrettet terapi, apoptotiske og levedyktighet analyser på fysiologiske forhold.
Diskusjoner
Systematisk utvikling av nukleinsyreprobene for molekylær anerkjennelse har genereres et stort antall nyttige aptamerer for ulike applikasjoner i ulike områder, inkludert bioteknologi, biomedisin, farmakologi, mikrobiologi og kjemi. Vi har brukt celle-SELEX å generere et panel av DNA aptamerer som har faglig godkjenning til kolorektal kreft. I denne rapporten har vi brukt DLD-en og HCT 116 som target cellelinjer, og utvalget ble utført i kulturen fatet. Vi tror at dette systemet er en nøyaktig gjengivelse av den opprinnelige tilstand av overflatemarkører. I ett av valgene med DLD-en, introduserte vi negativ seleksjon med HCT 116 cellelinje med sikte på å velge et panel av aptamerer med ulike anerkjennelse mønstre til kolorektal kreft. Tradisjonelt, for å sikre effektiviteten av negativ seleksjon, er kontrollcellelinje ofte i 5- til 10-gangers overskudd av mål-cellelinje. Men i disse ordningene, fordi utvalget ble gjort i kulturen fatet, ruge volumer begrenset størrelsen på kultur parabolen vi kunne bruke. Følgelig ble bare omtrent 2-ganger overskudd av kontrollcellelinje som brukes. Vi har derfor antatt at forholdet mellom den positive og den negative cellelinjer var utilstrekkelig til potensielt eliminere en betydelig del av de sekvenser som binder til de vanlige markører. Vi tror imidlertid at det ga mulighet for oss til å berike for aptamerer som kan ha differensial bindende mønstre til kolorektal kreft cellelinjer.
Sekvensiell bindende og eluering av DNA bibliotek basseng med positive og negative celler til slutt produserte DNA
