Abstract
Formål
Siden matriksmetalloproteinase-2 (MMP-2) er en viktig markør av tumor malignitet, har vi utviklet en original drug design strategi, MMP-2 aktivitet avhengige forankrings prober (MDAP), for bruk i MMP-2 aktivitet avbildning, og evaluert nytten av denne probe i
in vitro
og
in vivo
eksperimenter.
Metoder
Vi designet og syntetiserte MDAP
1000, MDAP
3000, og MDAP
5000, som består av fire uavhengige gruppene: RI enhet (
111In hydrofil chelat), MMP-2-substrat-enhet (kort peptid), forankringsenhet (alkylkjede), og forankring hemming enhet (polyetylenglykol (PEGn, hvor n representerer den omtrentlige molekylvekt, n = 1000, 3000, og 5000). probe spalting ble evaluert ved kromatografi etter at MMP-2-behandling. cellulært opptak av probene ble deretter målt. Radioaktivitet akkumulering i tumor-xenografter ble evaluert etter intravenøs injeksjon av sondene, og sonden spalting ble evaluert i tumor homogenates.
Resultater
MDAP
1000, MDAP
3000, og MDAP
5000 ble spaltet av MMP-2 i en konsentrasjonsavhengig måte. MDAP
3000 forbehandlet med MMP-2 viste høyere akkumulering i tumorceller, og ble fullstendig blokkert ved ytterligere behandling med en MMP-inhibitor. MDAP
3000 viste hurtig blodclearance og høy tumor akkumulering etter intravenøs injeksjon i en gnager modell. Videre farmakokinetisk analyse viste at MDAP
3000 viste en betydelig langsom utvasking rate fra svulster til blod. En viss andel av spaltet MDAP
3000 eksisterte i tumorxenotransplantater
in vivo
.
Konklusjoner
Resultatene indikerer mulige nytten av vår MDAP strategi for svulst bildebehandling.
Citation: Temma T, Hanaoka H, Yonezawa A, Kondo N, Sano K, Sakamoto T, et al. (2014) Undersøkelse av en MMP-2 Activity-Dependent Forankring Probe for Nuclear Imaging of Cancer. PLoS ONE 9 (7): e102180. doi: 10,1371 /journal.pone.0102180
Redaktør: Dominique Heymann, Faculté de Médecine de Nantes, Frankrike
mottatt: 21 februar 2014; Godkjent: 16 juni 2014; Publisert: 10. juli 2014
Copyright: © 2014 Temma et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet delvis av JSP KAKENHI Grant Antall 22791189. en del av denne studien ble støttet av New Energy and Industrial Technology Development Organization (NEDO), Japan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tumormetastase finner sted når en undergruppe av tumorceller erverver evnen til å bryte gjennom basalmembran og invaderer gjennom tett nettverk av interstitiell ekstracellulære matriks (ECM) proteiner [1]. Matriksmetalloproteinaser (MMP) utgjør den største familien av enzymer som er ansvarlige for nedverdigende disse ulike ECM-komponenter. Siden MMP-2 er i dag anerkjent som den subtype som har best etablerte samarbeid med tumor malignitet [2],
in vivo
avbildning av sin aktivitet bør være nyttig for svulst diagnose. Derfor ønsket vi å utvikle en ny kjernefysisk avbildnings sonde i stand til å estimere
in vivo
MMP-2 aktivitet med SPECT (SPECT).
Vi opprinnelig utviklet en ny sonde designstrategi som bruker en MMP-2 aktivitet avhengige forankrings probe (MDAP) (fig. 1) for å detektere MMP-2 aktivitet effektivt. Etter dette MDAP strategien ble proben forventet å bli spaltet av MMP-2-enzymatisk aktivitet i nærheten av tumoren, og effektivt fanget i proksimale tumorceller. Således kunne det radioaktivitetsnivå påvises ved SPECT være korrelert med MMP-2 aktivitet i tumorer. I denne studien vi spesielt designet og syntetisert MDAP
1000, MDAP
3000, og MDAP
5000, som består av en RI enhet (
111In DTPA), en MMP-2-substrat-enhet (kort peptid ) [3], en forankringsenhet (alkylkjeder) [4], og en forankrings inhibering enhet (polyetylenglykol (PEGn; hvor n indikerer den omtrentlige molekylvekt, n = 1000, 3000, og 5000). (tabell 1) MDAP
CV, som mangler PEG-enheten, fungerte som kontrollgruppe. Vi vurderte muligheten for dette stoffet designstrategi og nytten av sondene
in vitro Hotell og
in vivo
.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
dyreforsøk ble gjennomført i samsvar med institusjonens retningslinjer og godkjent av Universitetet i Kyoto Animal Care komité (Permit Number .: 2012-49, 2013-33) alle operasjoner ble utført under isoflurananestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse
Generelt
aminosyre derivater ble kjøpt fra Watanabe Chemical Industries (. Hiroshima, Japan) og Iris Biotech GmbH (Marktredwitz, Tyskland). Matrix pasning Laser desorpsjon /ionisering-massespektrometri (MALDI-MS) ble utført med en AXIMA-CFR Plus apparat (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan). Revers fase High Performance Liquid Chromatography (RP-HPLC) ble utført ved å bruke et Shimadzu HPLC-system-gradient (LC-20AD, Shimadzu Corporation) er utstyrt med en Cosmosil 5C18-AR-II-kolonne (10 x 250 mm, Nacalai Tesque, Inc. , Kyoto, Japan). Produktene ble eluert med en lineær gradient som startet ved 50% løsningsmiddel B som økte til 80% i løpet av 15 min (oppløsningsmiddel A: 0,1% trifluoreddiksyre i vann [volum /volum]; løsningsmiddel B: 0,1% trifluoreddiksyre i acetonitril [vol /vol ]) ved en strømningshastighet på 4,0 ml /min. For tumor metabolitt-analyse, ble produktene eluert med en lineær gradient som startet ved 50% løsningsmiddel B som økte til 80% i løpet av 30 minutter ved en strømningshastighet på 2,0 ml /min.
Fremstilling av prober (tabell 1)
Fmoc-Dap (Boc) -10-Adc-Gly-Pro-Leu-Gly-wang-harpiks (Dap: 2,3-diamino-propionsyre, 10-Adc: 10-amino-decansyre) var syntetisert av en Fmoc-fast-fase peptidsyntese prosedyren ved hjelp av et peptid synthesizer (PSSM-8; Shimadzu Corporation) med
N
,
N «
diisopropylkarbodiimid (1,2 ekvivalenter),
N
,
N
diisopropyletylamin (1,0 ekvivalenter), og en-hydroxylbenzotriazole (1,0 ekvivalenter) som reagenser [5]. Etter Fmoc-gruppen fjernet med 20% piperidin i
N
,
N
-dimetylformamid, palmitinsyre ble omsatt på en lignende måte ovenfor under dannelse av palmitoyl-Dap (Boc) -10-Adc-Gly -Pro-Leu-Gly-wang-harpiks. Palmitoyl-Dap (Boc) -10-Adc-Gly-Pro-Leu-Gly-Val-Arg (Pbf) -Gly-Lys (ivDde) -PEG
n-amidharpiks (n = 1000, 3000, eller 5000 ) ble levert av Scrum Inc. (Tokyo, Japan). Peptide avbeskyttelse og spalting fra harpiksen ble samtidig utført ved anvendelse av trifluoreddiksyre /etanditiol /vann /triisopropylsilan (95 /2,5 /2,5 /1, v /v). De rå peptider ble renset ved RP-HPLC, etterfulgt av frysetørking. Den rensede forbindelse ble reagert med
p
-SCN-Bn-DTPA (2 ekv) i
N
,
N
dimetylformamid (1 ml) og
N
,
N
-diisopropyletylamin (20-100 ul) for å justere pH i en løsning (pH 6), og inkubert ved romtemperatur over natten. Radiomerkings forløpere ble renset ved RP-HPLC og karakterisert ved hjelp av massespektrometri. [
111In] inkl
3 (5,55 MBq i 100 ul HCl-oppløsning, Nihon Medi-Physics Co., Ltd., Japan) ble tilsatt til hver rensede forløper (2 nmol) i 0,1 M acetatbuffer (pH 6,0, 50 ul), og blandingen ble inkubert ved romtemperatur i 30 min. Radiokjemisk renhet ble estimert ved RP-HPLC utstyrt med en radioaktivitet detektor.
Måling av fordelingskoeffisienter
Den eksperimentelle fastsettelse av probe partisjon koeffisientene (log P-verdier) ble utført i en-oktanol og 0,02 M fosfatbuffer pH 7,4, hvor de to fasene ble forhåndsmettet med hverandre. 1-Octanol (200 mL) og fosfatbuffer (200 ul) ble pipettert inn i LoBind Eppendorf-rør inneholdende 0,37 MBq av prober. Røret ble vortex-blandet i 10 sekunder og sentrifugert (5 minutter, 4000 x
g
). Porsjoner (50 mL) fra en-oktanol og buffer faser ble overført til to reagensrør for radioaktivitet telling med en NaI brønntypen scintillasjonsteller (1470 VEIVISEREN, Perkin Elmer, Kanagawa, Japan). Fordelingskoeffisienten ble beregnet ved hjelp av ligningen P = (tellinger /mikroliter i en-oktanol) /(tellinger /mikroliter i buffer).
Cleavage analysen
Human-rekombinant MMP-2 protein ( 902-MP-010, R 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Utarbeidelse av sonder
MDAP
1000, MDAP
3000, MDAP
5000 og MDAP
CV ble oppnådd med mer enn 95%, 97%, 95% og 98% radiokjemisk renhet, henholdsvis (fig. 2). Den spesifikke radioaktivitet av sondene ble anslått å være 2,8 MBq /nmol, som var avhengig av radioaktiviteten av [
111In] inkl
3 anvendes for radiomerkingsprosedyren. Loggen P-verdiene av MDAP
1000, MDAP
3000, MDAP
5000 og MDAP
CV var -0,56 ± 0,13, -0,95 ± 0,12, henholdsvis -1,04 ± 0,16 og 0,29 ± 0,07,.
RI diagrammer av (a) MDAP
1000, (b) MDAP
3000, (c) MDAP vises
5000, og (d) MDAP
CV med UV-diagrammer av tilsvarende ikke-radioaktive forbindelser.
in vitro studie
Som vist i fig. 3a, MDAP
1000 viste høy radioaktivitet akkumulering i tumorceller og nivåer som var lik MDAP
CV, mens MDAP
3000 og MDAP
5000 viste signifikant lavere radioaktivitet. MMP-2 spaltet MDAP
1000, MDAP
3000 og MDAP
5000 på en konsentrasjonsavhengig måte (fig. 3b). MDAP
3000 forbehandlet med MMP-2 akkumuleres i cellene til høyere nivåer, mens ytterligere behandling med en MMP inhibitor fullstendig blokkert dette økt opptak (Fig. 3c).
(a) Cellular opphopning av MDAP
1000, MDAP
3000, MDAP
5000 og MDAP
CV anslått av radioaktivitet telling. (B) Spalting (%) av MDAP
1000, MDAP
3000, og MDAP
5000 som følge av MMP-2-behandling. -Verdier ble beregnet ved hjelp av reversfase-HPLC. (C) Cellular opphopning av MDAP
3000 med eller uten MMP-2 protein og MMP inhibitor (GM6001).
In vivo studie
Radioaktivitet distribusjons profiler etter intravenøs administrasjon av MDAP
1000, MDAP
3000 og MDAP
CV er vist i tabellene 2, 3 og 4, henholdsvis. For å sammenligne probe farmakokinetikk, endringer i radioaktivitet i blod og tumor plottet som en funksjon av tid etter administrering (fig. 4a, b), og som tumor til blodforhold (fig. 4C). MDAP
3000 viste hurtig blodclearance (Fig. 4a) og høy tumor akkumulering (Fig. 4b). Dermed blant sondene MDAP
3000 oppnådd betydelig høyere svulsten til blodforhold (2,74 ± 0,89 på 24 timer, tabell 3 og fig. 4c). MDAP
1000 også viste hurtig blodclearance (Fig. 4a), men viste liten svulst akkumulering (Fig. 4b). I mellomtiden, MDAP
CV viste en langsom blod klaring (Fig. 4a) og lavest svulsten til blodforhold over forsøksperioden (0,30 ± 0,02 på 24 timer, tabell 4 og 4c Fig.). Analyser på hele kroppen (tabell 5) og tumorer (tabell 6) viste de ovennevnte punkter indikert av biofordelingen data mer tydelig. Som vist i tabell 5, MDAP
3000 og MDAP
CV vises tilsvarende distribusjonsvolum mens MDAP
CV viste lavere total clearance samt lengre halveringstider og mener oppholdstid enn MDAP
3000. Tabell 6 viser en ca syv ganger saktere utvasking rate på MDAP
3000 fra svulsten (k2 = 1,2 × 10
-3 min
-1) sammenlignet med MDAP
CV (k2 = 8,6 × 10
-3 min
1). I tillegg HPLC-analyse av tumorer skåret ut 3, 6 og 24 timer etter intravenøs injeksjon av MDAP
3000 viste en viss brøkdel av MDAP
CV eksisterte i tumoren (fig. 5, hvit pil). Den intakte form av MDAP
3000 indikert ved den svarte pilen forsvant med tiden som vist ved HPLC-diagrammet. En viss fraksjon av MDAP
CV var også til stede inne i svulsten etter intratumoral injeksjon av MDAP
3000, som kan bli blokkert av inhibitor behandling (Fig. 6). Andre topper observert omkring 5-10 min kunne representere ytterligere metabolitter som produseres inne i cellene. MMP-2 enzymatiske aktiviteten til tumoren homogenatet ble bekreftet ved zymografi (Fig. 7). Den effektive dose av MDAP
3000 estimert fra biodistribusjon data var 5,08 × 10
-2 mSv /MBq.
(a) Tid radioaktivitet kurver i blodet. (B) Tid radioaktivitet kurver i svulster. (C) Tumor til blod radioaktivitet forholdstall.
Svart og hvitt Pilene viser intakte og spaltede topper, henholdsvis.
Diskusjoner
i denne studien har vi testet gjennomførbarhet og nytten av vår romanen drug design strategi hvor MMP-2 aktivitet avhengig forankring sonde MDAP brukes for MMP-2 aktivitet bildebehandling i kreft. Begge
in vitro Hotell og
in vivo
eksperimenter viste at MDAP
3000 vises cellemembranen forankring eiendommer følgende underlaget spalting av MMP-2 i tumorer, noe som førte til en noe svakere utvasking av radioaktivitet fra svulster. Som sådan, vi demonstrert mulig anvendelse av våre MDAP strategi for svulst bildebehandling.
I løpet av den innledende fasen av probe design, vi valgte en dobbel alkylkjede som forankringsenhet basert på en tidligere rapport som viser at dobbelt alkyl kjedene var overlegne til enkelt alkylkjeder for cellemembranen forankring. Lengden av den doble alkylkjeden (palmitoyl gruppe, og 10-amino-decansyre i probe-konstruksjoner) ble valgt på grunnlag av resultatene fra en innledende celle binding eksperiment. Vi deretter kombinert andre delene for å oppfylle kravene til MDAP. Nærmere bestemt,
111In ble valgt for radiomerking på grunn av sin enkle og raske radiosynthesis med et hydrofilt chelaterende middel (DTPA) -konjugert forløper under milde betingelser [9]. Blant tidligere rapportert MMP-2 substrat peptider, Pro-Leu-Gly-Val-Arg-Gly ble valgt slik at aminoenden rester (Pro-Leu-Gly) ville beholde sin radioaktivitet etter spaltning og ikke hemme forankrings egenskap av dobbelt alkylkjede [10]. PEG ble valgt på grunn av hydrofilisitet og sterisk hindring som ville tillate den å fungere som en inhibitor av MDAP prober og tre PEG-molekyl typer (MW: 1000, 3000, og 5000) ble testet for å bestemme den optimale molekylvekt både i form av inhiberende kapasitet på forankrings og motstand mot MMP-2 spalting. Som et resultat, vi får innhentet radiomerkede MDAP prober med høy radiokjemisk utbytte og renhet som tillot deres bruk i
in vitro Hotell og
in vivo
eksperimenter uten ytterligere rensing.
PEG blir ofte brukt for å endre molekylære prober for å endre deres hydrofilisitet og farmakokinetikk [11], [12]. Derfor forventet vi både hydrofilitet og sterisk hindring av PEG for å endre egenskapene til MDAP. Cellular akkumulering resultater tydelig delt sondene i en høy opphopning gruppe (MDAP
1000 og MDAP
CV) og lav akkumulering gruppe (MDAP
3000 og MDAP
5000) hvor sonden hydrophilicity gradvis økt med molekyl~~POS=TRUNC vekten~~POS=HEADCOMP av PEG som er vist i de oppnådde log P-verdier. Som sådan, den steriske hindring i stedet for hydrofilisitet formidles av PEG fungerte som en inhibitor av forankrings sonde del. Mens MDAP
1000, MDAP
3000, og MDAP
5000 ble spaltet av MMP-2 som forventet, spaltbarheten av MDAP
5000 var ganske lav, noe som indikerte at PEG plassert rundt sonden hemmet sin interaksjoner med andre molekyler, inkludert MMP-2-proteinet. Dermed blir
in vitro
eksperimenter viste at MDAP
3000 ble anerkjent som en mulig egnet probe for videre
in vivo
evaluering.
in vivo
biodistribusjon studie viste en rask blodklaring og høy tumoropptak av MDAP
3000 etter intravenøs injeksjon, mens MDAP
CV viste høy radioaktivitet i både blod og svulster. Dermed vil en betydelig høyere svulst til blod radioaktivitet ratio (T /B ratio), en avbildning indeks [9], ble innhentet for MDAP
3000 gruppe, noe som indikerer de overlegne egenskapene til MDAP
3000 som en avbildningsmiddel
in vivo
. Den effektive dose av MDAP
3000 anslått fra biofordelingen data var akseptabelt for bruk av MDAP
3000 som et avbildningsmiddel [13]. På den annen side, MDAP
CV viste høy radioaktivitet som er igjen i blodet, noe som innebar ikke-spesifikk binding til serumproteiner og /eller blodceller. Dette resultatet antydet at intravenøst MDAP
CV kan binde med serumproteiner og eksisterer i mellomrommet av svulster som kompleks form. Denne mulighet ble også indikert ved MDAP
CV har de svak T /B-forhold (mindre enn 0,3) i løpet av forsøksperioden. De MDAP
CV biofordelingsstudier Resultatene indikerte at MDAP
CV generert i andre vev etter systemisk MDAP administrasjon ville bli sjeldnere omfordeles til svulster. Dermed svulst opphopning av MDAP
3000 ble ikke stammer fra omfordeling av spaltet MDAP
CV siden MDAP
3000 viste rask blodclearance og økning i T /B-forholdet med tid etter intravenøs administrasjon. Ikke desto mindre var det en målbar andel av MDAP
CV eksisterer i tumorer etter intravenøs og intratumorale injeksjoner av MDAP
3000, og MDAP
CV følge av intratumoral injeksjon av MDAP
3000 ble noe redusert med MMP inhibitor. MDAP
CV kan bli generert i tumoren som et resultat av MDAP
3000 spalting av MMP-2. HPLC-analyser på skåret svulster også indikere opphopning og oppbevaring av MDAP
3000 etterfulgt av gradvis nedbrytning til hydrofile metabolitter i svulster. Det er ganske rimelig fra MDAP strategi som farmakokinetisk analyse gitt en betydelig tregere utvasking rate (k2 verdi) for MDAP
3000 sammenlignet med MDAP
CV, fordi tregere utvasking sats for MDAP
3000 indikerer MDAP
3000 radioaktivitet fangst i svulster. Når det gjelder begrensninger i denne studien, ble direkte bevis for at MDAP
3000 ble forankret i cellemembranen etter MMP-2 aktiverings i tumorvev ikke oppnådd. For å evaluere hvorvidt MDAP sonden er forankret i cellemembranen etter MMP-2 aktiverings mer presist, videre studier for eksempel HPLC-analyse av membranfraksjoner fra tumorcellene alene eller konfokal mikroskopi nærmer ved hjelp av et passende fluorofor som innføres i MDAP
3000 finnes behov for. Men
in vitro Hotell og
in vivo
studier viste MMP-2 avhengig sonde cleavage, oppbevaring av radioaktivitet i tumorvev og langsom utvasking fra tumorvev, noe som indikerer en mulig anvendelse av MDAP . strategi
Selv fluorescens aktiverbare onder har blitt rapportert for MMP bildebehandling [14] – [17], har kjernefysiske medisinsk bildebehandling stort potensial for
in vivo
applikasjoner fordi det kan kvantitativt oppdage signaler fra vev dypt i kroppen, men også kan anvendes for bruk i kreftterapier som involverer a, g, eller auger elektronemittere [18], [19]. Siden MDAP
3000 kan tillate selektiv utlesning av den aktiverte MMP-2 subpopulasjon på grunn av signalforsterkning i forhold til MMP-bindende sonder, MDAP
3000 kan være en potensiell blyforbindelse for bruk i fremtidige applikasjoner. Videre studier for å sammenligne MDAP
3000 med andre radiomerkede MMP bildebehandlings sonder er dermed garantert [20], [21].
