Abstract
Til tross for nylige fremskritt i målrettet terapi, pasienter med bukspyttkjertel adenokarsinom fortsette å ha dårlig overlevelse fremhever viktigheten av å identifisere nye terapeutiske mål. Våre tidligere undersøkelser har innblandet chemokin reseptor CXCR4 og dens selektiv ligand CXCL12 i patogenesen og progresjon av bukspyttkjertelen intraepitelial neoplasi og invasiv kreft i bukspyttkjertelen; dermed er CXCR4 et lovende mål for undertrykkelse av kreft i bukspyttkjertelen vekst. Her har vi samlet
i silico
strukturell modellering av CXCR4 å screene for kandidat anti-CXCR4 forbindelser med
in vitro
cellelinje analyser og identifisert NSC56612 fra National Cancer Institute (NCI) Åpne Kjemisk Repository samlingen som en inhibitor av aktivert CXCR4. Deretter identifiserte vi at NSC56612 er strukturelt lik den etablerte anti-malaria medisiner klorokin og hydroksyklorokin. Vi evaluerte disse forbindelsene i kreft i bukspyttkjertelen celler
in vitro Hotell og observert spesifikk antagonisme av CXCR4-mediert signalering og celledeling. Nylige
in vivo
terapeutiske anvendelser av klorokin i bukspyttkjertelen kreft musemodeller har vist redusert tumorvekst og bedret overlevelse. Våre resultater gir dermed en molekylære mål og grunnlag for videre evaluering av klorokin og hydroksyklorokin i bukspyttkjertelkreft. Historisk trygg hos mennesker, klorokin og hydroksyklorokin synes å være lovende agenter for å trygt og effektivt målrette CXCR4 hos pasienter med kreft i bukspyttkjertelen
Citation. Kim J, Yip MLR, Shen X, Li H, Hsin L-YC, LaBarge S, et al. (2012) Identifisering av malaria Forbindelser som Novel antagonister til kjemokinreseptor CXCR4 i kreft i bukspyttkjertelen celler. PLoS ONE 7 (2): e31004. doi: 10,1371 /journal.pone.0031004
Redaktør: Jingwu Xie, Indiana University School of Medicine, USA
mottatt: 29 juni 2011; Godkjent: 30 desember 2011; Publisert: 03.02.2012
Copyright: © 2012 Kim et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis med tilskudd fra National Cancer Institute [P30 CA33572 til JK, MLRY, og NV]; National Institutes of Health (NIH) [NIH CA134637 til JK]; og American Cancer Society (ACS) [RSG-11-070-01-TBE til JK]. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuscript.The innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke de offisielle visningene av National Cancer Institute, NIH eller ACS.
konkurrerende interesser: forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
pankreasgang kreft er en ensartet dødelig sykdom som ofte diagnostisert med fjernmetastaser på den tiden. innledende klinisk presentasjon. Ukjent tidlig sykdom og en svært invasiv fenotype er primære faktorer for dårlig prognose assosiert med kreft i bukspyttkjertelen og markere at det haster å identifisere molekylære mål for utviklingen av sykdommen. Nylig har interaksjonen mellom kjemokiner og deres tilsvarende reseptorer blitt undersøkt i patogenesen, progresjon, og metastase av kreft i bukspyttkjertelen [1], [2], [3]. Disse studier har antydet at antagonister til kjemokinreseptor CXCR4 kan oppheve den invasive fenotype av kreft i bukspyttkjertelen [4], [5], [6]. Til tross for økende bevis på viktigheten av CXCR4 i bukspyttkjertelkreft og andre kreftformer, antagonister til CXCR4 som er trygge og effektive for klinisk bruk forbli mangler.
chemokin CXCL12 (også kjent som stromal-avledet faktor-1α, SDF- 1α) aktiverer flere nedstrøms effektor trasé ved binding sin reseptor CXCR4 [7]. Den CXCL12-CXCR4 interaksjon regulerer chemotaxis, heft og utskillelse av vekstfaktorer blant mange av sine kjente funksjoner [8]. Kort tid etter at CXCR4 ble identifisert som en co-reseptor for HIV-1 og HIV-2 [9], [10], den lille bicyclam molekylet AMD3100 ble identifisert som et spesifikt CXCR4-antagonist [5]. AMD3100 har nå blitt mye brukt til å etterforske og avhøre CXCL12-CXCR4 interaksjoner [7]. Selv AMD3100 forblir i klinisk bruk for stamcellemobilisering, har sin kronisk administrasjon vært assosiert med betydelig kardio [11]. Interessant, har nyere studier vist at i tillegg til sin rolle som en antagonist til CXCR4 signalering, AMD3100 paradoksalt binder og aktiverer kjemokinreseptor CXCR7 [12], [13].
Siden nåværende data tyder på at AMD3100 ikke kan være trygt eller effektivt som et anti-CXCR4-antagonist for terapeutiske anvendelser i kreft i bukspyttkjertelen, spesifikke antagonister gjenstår å bli identifisert for dette formål. I dette tverrfaglige undersøkelsen, vi kombinert
i silico
modellering av CXCR4 struktur med høy gjennomstrømming screening og
in vitro
analyser i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer for å identifisere nye antagonister til CXCR4-mediert celleproliferasjon i kreft i bukspyttkjertelen celler. Vår studie viser at sikker og effektiv anti-malaria medisiner klorokin og hydroksyklorokin er effektive CXCR4 antagonister som hemmer kreft i bukspyttkjertelen celleproliferasjon.
Resultater
Computational Modellering av CXCR4
strukturelle ensemble av villtype CXCR4 reseptoren ble spådd med
ab initio
struktur prediksjon metode (MembStruk4.3) [14], [15]. Vi sammenlignet bindingen av mono og bicyclam forbindelser til våre spådd strukturer med mutagenese data for å validere våre beregnings spådommer [16]. Våre spådommer ble sendt til proteinstruktur vurderingen konkurranse (GPCRDOCK2010) før karakterisering av krystallstrukturen av CXCR4 [17]. En detaljert sammenligning av den forutsagte struktur med krystallstrukturen har bekreftet riktigheten av vår modellering, og har blitt publisert andre steder (figur 1) [18].
lite molekyl betegnet «1T» er plassert i den forutsagte bindings nettstedet. Root mean square avvik av de forutsagte og krystallstrukturer er 2,5 Å, noe som demonstrerer nær innretting av vår predikert modell med den etablerte krystallstruktur. Følgelig er den forutsagte plassering av bindingssetet av den lille molekyl «1T» matchet med krystallstruktur. Den lille molekyl «1t» er avbildet som små kuler.
Vi utførte virtuell ligand screening (VLS) av National Cancer Institute (NCI) Åpne Kjemisk Repository Collection i 3 forskjellige spådd konformasjoner av CXCR4. Deretter kandidat små molekyler ble filtreres basert på deres nærhet til rester som spiller en viktig rolle i antagonist bindende, nemlig: D92 (TM2), H121 (TM3), D171 (TM4), E262 (TM6) og E288 (TM7) [ ,,,0],19], [20]. Omtrent 90% av små molekyler ble ekskludert på dette trinnet.
Bindende energier av små molekyler ble deretter beregnet og topp 10% av små molekyler med lavest bindende energier ble beholdt. De kjemiske strukturer i topp 10% av hits varierte fra multi-aromatiske ringstrukturer til konstruksjoner med lengre alkylkjeder. Det primære kriteriet for videre valg var samspillet av kandidatmolekyler med rester som er kjent for å være viktig for antagonist binding [16]. Disse molekylene ble deretter undersøkt for protein-ligand kontakter og 50 kandidat små molekyler ble valgt ut fra ca 350 000 molekyler for eksperimentell testing.
NSC56612 og relaterte forbindelser Hemme CXCR4-mediert signale
Av de 50 kandidat forbindelser fra VLS, var vi i stand til å skaffe 32 fra NCI for eksperimentell testing. Screening av de 32 forbindelsene ble utført ved anvendelse av tango assay som tester inhibisjon av CXCL12-mediert rekruttering av β-arrestin til karboksyterminalen av CXCR4. Denne analyse identifiserte en hit forbindelse som undertrykket β-arrestin rekruttering og de kjemiske strukturer av denne forbindelsen NSC56612 er vist i figur 2. Vi utførte et register av direkte ligandbindende, sekundær budbringer kalsium-fluks ytterligere, og nedstrøms kjemotaksis analyser mediert av CXCR4 /CXCL12 aksen for å kontrollere at disse forbindelsene er direkte rettet mot CXCR4. NSC56612 ble brukt som en mal for å identifisere forbindelser med lignende kjemiske strukturer. Dette fører til identifisering av tre andre forbindelser som er anti-malaria midler:. Klorokin, hydroksyklorokin, og quinacrine (figur 2)
(A) NCI forbindelse NSC56612, (B) klorokin, (C) hydroxychloroquine, og (D) quinacrine.
Figur 3A viser konsentrasjonen avhengighet kurven av direkte hemming av fluorescensmerkede CXCL12 binding av NSC56612, klorokin, hydroksyklorokin, og quinacrine. Konkurrerende bindingseksperimenter viste at disse forbindelser direkte inhibere binding av CXCL12 til CXCR4 med lav mikro molar affinitet. Den målemetode hvor β-arrestin-2 rekruttering mediert ved CXCL12 bedømmes viste også hemming av disse tre forbindelser med lav mikro molar effekt (figur 3B). Figur 3B viser også hemming av AMD3100, en CXCR4-antagonist.
(A) konsentrasjonsavhengig hemming av fluorescensmerkede CXCL12 (60 nM) binding til SNAP-merket CXCR4 reseptoren i HEK293 celler ved NSC56612, klorokin og hydroksyklorokin. Den halve maksimale effektive konsentrasjon (EC
50), av verdiene på hvilken maksimal CXCL12-CXCR4 binding inhiberes med 50%, for AMD3100, NSC56612, klorokin, og hydroksyklorokin er 60,0 nM, 5,5 pM, 6,1 pM og 9,8 pM hhv. Disse kurvene er representative data fra 3 eksperimenter utført i duplikat. (B) Doseavhengig inhibering av CXCL12-indusert β-arrestin-2-mediert beta-laktamase-aktivitet in konstruert tango assay ved forbehandling med AMD 3100, NSC56612, klorokin, hydroksyklorokin og. Utslippsdata på 460/530 ble definert som den responsforhold. Disse kurvene er representative data fra 3 eksperimenter utført i duplikat. (C) Doseavhengig inhibering av CXCL12-indusert intracellulær kalsium-fluks av AMD 3100, NSC56612, klorokin, hydroksyklorokin. CXCR4-mediert kalsiuminnstrømningen ble målt ved 1 uM av AMD3100 og to forskjellige konsentrasjoner (100 uM og 200 uM) av de tre forbindelsene i Molt-4-celler. AMD 3100, NSC56612, klorokin og hydroksyklorokin viste 50-60% hemming av CXCL12-indusert kalsium tilstrømningen. Disse kurvene er representative data fra 3 eksperimenter utført i duplikat. (D) Inhibering av CXCL12-indusert Jurkat-cellemigrering gjennom AMD3100 (100 nM), NSC56612 (100 uM), klorokin (100 uM), og hydroksyklorokin (100 uM). Alle fire forbindelser som viste 40% til 50% reduksjon i CXCL12-indusert cellemigrering. Figuren viser data fra 4 eksperimenter utført i duplikat. Feilfelt representerer ± en SD. Student t-test:. * 0,05 og ** 0,01
Kalsium fluks, en sekundær budbringer til CXCL12-mediert aktivering av CXCR4, måler aktivering av CXCR4. Den CXCL12-mediert kalsiumflukssignal ble målt ved to forskjellige konsentrasjoner av de fire forbindelser, nemlig 100 uM og 200 uM. Som vist i figur 3C, NSC56612 viste klorokin, hydroksyklorokin og 50% til 60% inhibering av CXCL12-indusert kalsium-fluks, mens kinakrin viste mindre enn 10% inhibering (data ikke vist). Vi målte nivået av inhibering av disse forbindelser til chemotaxis, en nedstrøms effekt i CXCR4-uttrykkende celler. Figur 3D viser effekten av forbindelsene i kjemotaksis-analyser, karakterisert ved at hemmingen av CXCL12-indusert cellemigrering måles. For å bedømme konsentrasjonen av forbindelser som er nødvendige for kjemotaksi inhibering, utførte vi en doseavhengig inhibering av kjemotaksen av blyet forbindelsen NSC56612 som vist i figur 4. Samtlige fire forbindelser som viste 40% til 50% reduksjon i CXCL12-indusert cellemigrering. Quinacrine viste betydelig effekt mot inhibering av kjemotakse (data ikke vist), mens det hadde liten eller ingen virkning på kalsium-fluks analysen. Siden quinacrine ikke undertrykke CXCL12-mediert kalsium forandring, ble det utelatt fra videre analyse i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer. Resultatene av disse analyser viser at klorokin og hydroksyklorokin direkte inhibere CXCR4-signalering.
Cellene ble sådd ut på kulturplater som er utstyrt med åtte-um pore membraner for å opprette øvre og nedre cellekulturkamre. Celler ble sådd ut i det øvre kammer og CXCL12 (30 nM) alene eller med tilsetning av NSC56612, klorokin, hydroksyklorokin, eller ble plassert i bunnkammeret. Antallet celler som migrerte gjennom membranen i 5 timer ble tellet. Dataene som vises er fra 4 eksperimenter utført i duplikat. Relative endringer i cellemigrering er vist med kontroll tilstand tjener som 100% overføring. Feilfelt representerer ± en SD.
Chloroquine og Hydroksyklorokin Hemme CXCL12-mediert ERK Fosforylering
I en tidligere undersøkelse, oppdaget vi at CXCL12 induserte en økning i ERK-fosforylering [21]. Selv om eksponering for CXCL12 også aktivert PI-3K /AKT svei, den grad som AKT-fosforylering ble forandret var mye lavere enn ERK-fosforylering. Derfor fokuserte vi vår etterforskning i denne studien på ERK-aktivering. Først, bekreftet vi at CXCL12 induserer en økning i fosfor-ERK i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer (figur 5A). Deretter, demonstrerte vi at klorokin og hydroksyklorokin utøve doseavhengige inhiberende effekt på CXCL12-mediert ERK-fosforylering i PANC-1 og ASPC-1-celler (Figur 5B). Til slutt viser vi kvantitativ analyse av hemmingen i fosfo-ERK i figur 5C.
(A) immunofarging for fosfo-ERK ble utført for PANC-1, Hs 766T-, ASPC-1, og MIAPaCa- 2 cellelysater. Celler ble forbehandlet med klorokin eller hydroksyklorokin (0,1 pM) i 30 minutter, hvoretter cellene ble eksponert for CXCL12 (200 ng /ml) i 20 minutter. Et antistoff til total ERK1 /2 ble anvendt som en kontroll lasting. De CXCL12-mediert økning i fosfor-ERK ble effektivt opphevet med enten klorokin eller hydroksyklorokin. (B) Forbehandling av PANC-1 og ASPC-1 celler med klorokin og hydroksyklorokin (0,1-10 uM) i 5 minutter etterfulgt av eksponering til CXCL12 (200 ng /ml) demonstrere doseavhengige effekt av behandling på CXCL12-mediert ERK fosforylering. (C) Western blot ble skannet og kvantifisert ved hjelp av AlphaImager Tm3400 (Alpha Innotech). Brett endringer for fosfo-ERK i forhold til ubehandlede kontroller ble beregnet som relative uttrykk, som var normalisert til proteinbåndintensitetene for total ERK. Dataene viser gjennomsnittet av tredoble eksperimenter, med
p
-verdier. 0,05 anses statistisk signifikant
Chloroquine og Hydroksyklorokin Trigger apoptose og Hemme CXCL12-mediert spredning og Anti-apoptose
Chloroquine og hydroksyklorokin cytotoksisitet i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer ble vurdert og IC50s ble bestemt (figur 6). Ved å bruke disse verdiene, evaluert vi CXCR4 signalering i en celle proliferasjonsanalyse. Vi har tidligere observert CXCR4-medierte økninger i celle spredning i kreft i bukspyttkjertelen celler [21]. Derfor klorokin og hydroksyklorokin ble vurdert for antagonisme av CXCR4-mediert celleproliferasjon; og vi har observert at begge midlene effektivt antagoniserte CXCR4-mediert celle proliferasjon i PANC-1, Hs 766T-, og MIAPaCa-2-celler (figur 7). Siden øket proliferasjon ikke ble observert i ASPC-1 celler etter eksponering for CXCL12, ble disse cellene ikke vurderes med klorokin og hydroksyklorokin i denne analysen. Våre resultater er konsistente med publiserte rapporter som viser at ikke alle bukspyttkjertelkreft cellelinjer svare på CXCL12 med økt spredning [2]; den mekanismen som er ansvarlig for dette har ennå ikke blitt belyst. Både klorokin og hydroksyklorokin viste reduksjon i fosfo-ERK i nærvær av CXCL12, med den totale ERK-konsentrasjonen å være upåvirket. Disse resultater viser at klorokin og hydroksyklorokin spesifikt inhiberer CXCR4-mediert signalisering for å undertrykke proliferasjonen av kreft i bukspyttkjertelen celler.
ASPC-1, Hs 766T-, MIAPaCa-2, og PANC-1-cellene ble behandlet med en dose utvalget av klorokin eller hydroksyklorokin (0,01-10 uM) i 72 timer for å bestemme den halv maksimal hemmende konsentrasjon (IC50-verdiene) av disse forbindelser. ASPC-en og Hs-766T celler hadde lignende IC50 verdier for klorokin og hydroksyklorokin, mens MIAPaCa-2 og PANC-1 celler hadde høyere IC50 verdier for hydroksyklorokin enn klorokin.
(A) PANC-en , (B) Hs-766T, og (C) MIAPaCa-2-celler ble forbehandlet med klorokin eller hydroksyklorokin (0,1 pM) i 30 minutter, hvoretter cellene ble eksponert for CXCL12 (200 ng /ml) i 72 timer. (D) Forbehandling med klorokin og hydroksyklorokin også utløses apoptose og redusert CXCL12-mediert apoptose i PANC-1-celler. Dataene viser gjennomsnittet av triplikate eksperimenter.
P
-verdier. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Siden mekanismen for endringer i celleproliferasjon var ikke klart, vi også vurdert apoptose etter eksponering for klorokin og hydroksyklorokin. Først våre resultater tyder på at CXCL12 fremmer anti-apoptose i kreft i bukspyttkjertelen celler. Disse resultatene er i samsvar med tidligere publiserte rapporter for de CXCL12 /CXCR4 akse [22], [23]. Sekund, våre resultater tyder på at klorokin og hydroksyklorokin oppheve CXCL12-mediert anti-apoptose (figur 7D), hvor forbehandling med klorokin eller hydroksyklorokin økt apoptose i PANC-1 celler.
Diskusjoner
Ved hjelp av en tverrfaglig tilnærming starter med beregningsorientert modellering av CXCR4 reseptoren strukturen til
in vitro
analyse av CXCR4 signalering, vår studie har fastslått at klorokin og hydroksyklorokin fungere som nye CXCR4-hemmere i kreft i bukspyttkjertelen celler. Vi har vist at disse klinisk trygge og effektive malariamidler spesielt hemme binding av CXCL12 til CXCR4 og hemme CXCL12-CXCR4 nedstrøms effektor trasé som formidler kalsium flux, rekruttering av ß-arrestin-2 og cellemigrasjon. I bukspyttkjertelkreft cellelinjer fant vi ut at klorokin og hydroksyklorokin blokk CXCL12-mediert signalering gjennom ERK vei med nedstrøms effekter på både apoptose og celledeling. Siden CXCR4 synes å ha en viktig rolle i patogenesen og progresjon av kreft i bukspyttkjertelen [1], [2], [3], har arbeidet viktige kliniske implikasjoner i identifikasjon av en ny terapeutisk anvendelse av disse etablerte anti-malariamidler.
Våre innledende studier kreves det nøyaktig karakterisering av strukturen av CXCR4. Ved hjelp av beregningsmetoder tidligere er utviklet av oss, spådd vi den tredimensjonale struktur av CXCR4 og bindingssetene på kjente lavmolekylære antagonister slik som cyklam forbindelsene [16], [24], [25]. Våre strukturelle spådommer ble utført før offentliggjøring av krystallstrukturen av CXCR4 [17]. Følgende sammenligning av de forutsagte konstruksjoner til krystallen viste en meget god overensstemmelse med den kvadratisk middelavvik i koordinatene til liganden av 2,2 Å. Disse resultatene var oppmuntrende å videreutvikle vår studie ser for lite molekyl CXCR4 antagonister i kreft i bukspyttkjertelen celler. Med den anslåtte conformations av CXCR4, brukte vi etablert biblioteker av forbindelser for å identifisere kandidat antagonist treff. Begrense treff på de 32 beste kandidatene, utførte vi high-throughput screening-analyser, noe som ytterligere smalere vår kandidatlisten til 3 forbindelser. Disse innledende studier førte oss til NCI sammensatte NSC56612. Utforskning av den kjemiske strukturen av NSC56612 for lignende forbindelser via offentlige og kommersielle databaser avslørte at NSC56612 felles strukturell homologi med klorokin, hydroksyklorokin, og kinakrin; men bare klorokin og hydroksyklorokin bestått alle våre utvelgelsesassays. Den uensartede Effekten av kinakrin kan være sekundære til heterogeniteten av nedstrøms effektorer (
f.eks.
, Fosfolipase C eller G-proteiner) for forskjellige cellefunksjoner, noe som kan resultere i variabel respons mellom cellene. Andre studier har tidligere vist differensial effekt av diskrete G-protein koblet reseptor-ligander for forskjellige analyser [26], [27]. For å identifisere de antatte bindingsseter av disse forbindelser vi forankret klorokin og hydroksyklorokin til krystallstrukturen av CXCR4 (figur 8), og som er identifisert som de tertiære amingrupper i slike forbindelser gjør hydrogenbindinger med D97 på TM2 og E32 i aminoenden av reseptoren ; og aromatiske rester Y45, W94, H113 og Y255 viser gunstig van der Waals interaksjoner med det aromatiske ringsystemet i disse forbindelser.
Grønne helikser, TM1, 2, 3, 5, 6, og 7 er vist. Ved binding, både klorokin og hydroksyklorokin samhandle positivt med de angitte rester (E32, N37, Y45, W94, D97, H113, I185, D187, Y255, E288) vist i pinner. Disse rester er innenfor 5 Å av den bundne forbindelse. Imidlertid er aminosyrerestene ved CXCR4-bindingssetet orientert litt forskjellig avhengig av om klorokin eller hydroksyklorokin bind. De relative orienteringer av CXCR4 aminosyrerester som interagerer med klorokin og hydroksyklorokin er vist som grønne og cyan pinner, henholdsvis.
Siden den invasive fenotype forbundet med CXCR4 er en manifestasjon av CXCL12-drevet signalveier , testet vi klorokin og hydroksyklorokin
in vitro
. Vi valgte å evaluere MAPK signalveien, fordi vi tidligere har demonstrert sin rolle som formidler vekst og spredning i bukspyttkjertelen intraepitelial neoplasi og kreft i bukspyttkjertelen celler [21]. I våre nåværende studier observerte vi effektiv hemming av CXCL12 drevet ERK-fosforylering og hemming av CXCL12-mediert spredning
in vitro
.
Det er klinisk dokumentasjon for de anti-kreft effekt av klorokin og hydroksyklorokin . I en klinisk studie for glioblastoma multiforme, ble klorokin administrert sammen med konvensjonell kjemoterapi som adjuvant behandling hos pasienter som gjennomgikk kirurgisk reseksjon for glioblastoma multiforme. Pasientene som fikk klorokin erfaring bedret overlevelse sammenlignet med pasienter som fikk kjemoterapi alene [28]. Selv om de ikke identifiserer CXCR4 som et potensielt mål, Rubin
et al.
, Hadde tidligere vist at CXCR4 antagonisme hemmet glioblastom multi vekst, noe som tyder på at CXCR4 var et passende mål for glioblastom terapi [29]. I tillegg har en klinisk studie for metastatisk kolorektalcancer innlemmet hydroxychloroquine sammen med standard cytotoksisk kjemoterapi [30]. Vår gruppe og andre har undersøkt CXCR4 uttrykk i kolorektal kreft og observert en mulig rolle for CXCR4 i kolorektal kreft progresjon [4], [31], [32]. Vår studie viser at klorokin og hydroksyklorokin er antagonister til CXCR4 og dermed gir en molekylære grunnlaget for bruk av klorokin hos pasienter med metastatisk kolorektalcancer. Siden denne kliniske studien er pågående, resultatene har ennå til å modnes. Klorokin har også nylig blitt testet
in vivo
i en murine bukspyttkjertelkreft modell demonstrerer tumorici-dal effekter med bedret overlevelse [33]. Men disse etterforskerne brukt klorokin uten en forståelse av dens virkninger på CXCR4.
Selv om klorokin og hydroksyklorokin har nylig blitt brukt for anti-kreft-applikasjoner, de ble opprinnelig formulert som malariamidler. Disse stoffene ble formulert fordi Atabrine, den første syntetiske anti-malaria-forbindelse, hadde uønskede bivirkninger av flekker på huden og øynene [34]. Både klorokin og hydroksyklorokin er svake baser som er rettet mot blodceller som er infisert av malaria [35]. Disse stoffene virker ved selektivt å spre til parasittens vakuole der hemoglobin er brutt ned [36]. I det sure vakuole, de blir protonert og fanget [36]. Innenfor vakuolen, de hemmer nedbrytningen av heme, biprodukt av parasittiske nedbrytning av hemoglobin [36]. Oppbyggingen av heme blir giftig og fører til cellelyse og død av parasitten [36]. Bortsett fra disse anti-malaria indikasjoner, har mekanismen for antineoplastiske virkninger av klorokin og hydroksyklorokin blitt undersøkt [37]. Klorokin ser ut til å hemme autofagi og indusere p53-avhengig apoptose [38]; og kan også forsterke effekten av cellegift eller strålebehandling [39].
I konklusjonen, ved hjelp av en tverrfaglig tilnærming vi identifisert nye CXCR4 antagonister og har vist at klorokin og hydroksyklorokin hemme CXCL12-CXCR4 signalering. Gitt at effektive antagonister til CXCR4 mangler og at nye behandlingsformer har ennå å bedre overlevelse utover ett år for pasienter med metastatisk kreft i bukspyttkjertelen [25], [40], [41], våre resultater har viktige kliniske implikasjoner. Våre studere resultatene gi et vitenskapelig grunnlag for å bruke klorokin eller hydroksyklorokin i en bukspyttkjertelkreft rettssak; og siden sikkerhetsprofilene er godt etablert for disse stoffene, en klinisk studie kan massedrap gjennomføres for pasienter med kreft i bukspyttkjertelen.
Materialer og metoder
Tippe av CXCR4 Struktur
MembStruk4.3,
ab initio
struktur prediksjon metode, ble anvendt for å generere et ensemble av vill-type human CXCR4 strukturer [14], [15]. De trans-membran (TM) regioner av CXCR4 ble forutsagt ved hjelp av Tm2ndS metoden med multippel sekvenssammenstilling av humant, rotte, mus og CXC og CC familie av kjemokinreseptorer (tabell 1) [14]. Vi optimalisert relativ rotasjon og oversettelse av de syv TM helikser og spiralformede Kinks begynner fra en samlet pakke av kanoniske helikser bygget fra TM spådommer. Kanoniske høyrehendte a-helikser ble bygget for hver helix og deres spiralformede akser ble orientert i rommet i henhold til elektrontettheten kartet til 7,5 en lav oppløsning av frosk rhodopsin [42].
Dette 7.5 Å elektrontettheten kart tilgjengelig posisjoner og relative orienteringer av de spiralformede akser som tjente til å optimalisere den spiralformede bunten. De relative translasjonsforskning orienteringer av 7 spiralene ble optimalisert ved å justere den hydrofobe maksimal bestemmes for hver helix til et fly. Den rotasjonsmessig orientering ble optimalisert ved anvendelse av en kombinasjon av hydrofobe øyeblikk og molekylære dynamiske teknikker. Data fra krystallstrukturen av CXCR4 [17], som ble nylig preget, ble ikke brukt for disse spådommene.
Vi hentet et ensemble av lavenergi TM fat conformations for CXCR4 og dens konstitutivt aktive mutanter [43] . Reseptor konformasjoner ble valgt til å ha maksimalt antall innbyrdes skrueformede hydrogenbindinger, og det høyeste totale energien av proteinet konformasjon i et lipid bilag. Tre potensielle lavenergi conformations ble valgt for CXCR4 som hadde forskjellige orienteringer av TM3, TM5, og TM7. TM5 hadde 3 forskjellige konformasjoner: 2 hadde forskjellige orienteringer av residuet Y219
5,58, som svarer til de 2 forskjellige orienteringer av Y223
5,58 i Rhodopsin og opsin krystallstrukturer [44], [45]. TM7 hadde 2 forskjellige spiral orientering, der plasseringen av E288
7.39 var annerledes.
Docking av AMD3100 og Virtual Ligand Screening
spådd bindingssetet av mono og bicyclam derivater av AMD3100 på CXCR4 ble validert ved hjelp av etablerte seterettet mutagenese data [19], [20]. Dette spådd bindingssetet ble så brukt til å utføre virtuell ligand screening (VLS) for å identifisere nye antagonist treff for CXCR4. The National Cancer Institute (NCI) Åpne Kjemisk Repository Collection [46], som består av ca 300.000 forbindelser, ble forespurt å bruke Maestro LigPrep modul (Schrödinger, San Diego, California). Flere conformations av kandidat ligander ble så forankret i den anslåtte bindingssetet av CXCR4 bruker Glide SP (Schrödinger) skalering av van der Waals radier til 0,5 og delvis kostnad cutoff til 0,15. De kombinerte Coulombic og van der Waals energi-konsentrasjon ble deretter hevet til 100 kcal /mol. De ladede molekyler ble avskaffet, og de nøytrale molekyler som ble vurdert bedre kandidater ble valgt for videre undersøkelser. Forankret ligand conformations for nøytrale molekyler ble deretter filtrert basert på den begravde areal, hvor ligander som var 80% begravet og basert på deres avstander til den sure rester D171, D262 og E288 ble valgt. Disse 3 rester har vist seg å være viktig i å binde CXCR4-antagonister [19], [20].
Ved å bruke Prime modul i Maestro, side-kjeder innen 5 en radius av liganden var nytt. Etter en sidekjede omdisponering, bindingsenergier (BE) for hver forankret konformasjon ble beregnet ved hjelp BE = PE (ligand i fast protein) – PE (ligand i oppløsnings), hvor PE (ligand i fast protein) er den potensielle energien i liganden beregnet med protein atomene faste og PE (ligand i samle) er den potensielle energien av liganden beregnet med Surface Generalized Born kontinuum samle metoden [47]. De 200 beste conformations i hvert sett ble så visuelt inspisert for å maksimere gunstige reseptor interaksjoner. Vi har valgt de 50 beste forbindelser fra hver CXCR4 reseptoren konformasjon for senere testing.
fluorescens merkede Konkurranse ligandbindende analysen
Konkurrerende bindingsstudier for å vurdere kandidatens CXCR4 antagonister ble utført ved hjelp av chemokin CXCR4 ligand bindingsanalyse kit i henhold til produsentens instruksjoner (Tag-lite, Cisbio, Bedford, MA) [48], [49]. I korthet, ble HEK-293-celler inkubert ved romtemperatur i 2 timer med det fluorescerende-merkede CXCL12 ligand med eller uten CXCR4 antagonister. Etter inkubasjon ble cellene spent på 620 nm og registrert på dual-utslipp (620 nm og 665 nm) ved hjelp PHERAstar (BMG LABTECH Inc .; Cary, NC). De relative forholdstall på CXCL12-CXCR4 binding ble oppnådd ved å dele akseptor signal (665 nm) av giveren signal (620 nm) og multiplisere denne verdien med 10.000.
CXCR4 Rekruttering av β-arrestin
Aktivering av CXCL12-CXCR4 aksen resultater i rekrutteringen av β-arrestin-2 til karboksyenden av CXCR4 [50]. For å verifisere hemming av β-arrestin-2 rekruttering av kandidat CXCR4 antagonister, brukte vi en kommersiell CXCR4 analyse (Tango, Invitrogen, Carlsbad, California) [51], [52]. I korthet, den modifiserte cellene (3 x 10
4) ble sådd ut i 96-brønners plater og inkubert over natten. DMSO eller antagonister ble tilsatt til cellene i 30 minutter. Deretter CXCL12 (60 nM) ble tilsatt og cellene ble inkubert i 5 timer.
