Abstract
Ikke-små-celle lungekreft (NSCLC) er en av de mest ledende årsakene til kreftrelaterte dødsfall på verdensbasis. Paclitaxel basert kombinasjonsterapier har lenge vært brukt som en standard behandling i aggressive NSCLCs. Men paclitaxel motstand har dukket opp som et stort klinisk problem i bekjempelsen av ikke-småcellet lungekreft og autofagi er en av de viktigste mekanismene som er involvert i dette fenomenet. I denne studien brukte vi mikroRNA (miRNA) arrays for å skjerme forskjellig uttrykt mirnas mellom paclitaxel sensitive lungekreft celler A549 og dens paclitaxel-resistente celle variant (A549-T24). Vi identifiserte MIR-17-5p var en av de fleste betydelig nedregulert mirnas i paclitaxel-resistente lungekreftceller sammenlignet med paclitaxel sensitive foreldre celler. Vi fant at overekspresjon av MIR-17-5p sensibilisert paclitaxel motstandsdyktig lungekreftceller til paclitaxel indusert apoptotisk celledød. Videre, i denne rapporten demonstrerte vi at MIR-17-5p bindes direkte til det 3′-UTR av beclin 1-genet, en av de viktigste autophagy modulator. Overekspresjon av MIR-17-5p inn paclitaxel motstandsdyktig lungekreftceller redusert beclin1 uttrykk og en konkordant bort i mobilnettet autofagi. Vi har også observert lignende resultater i en annen paclitaxel resistent lunge adenosquamous carcinoma celler (H596-TXR). Våre resultater indikerer at paclitaxel motstand av lungekreft er assosiert med nedregulering av MIR-17-5p uttrykk som kan forårsake oppregulering av BECN1 uttrykk
Citation. Chatterjee A, Chattopadhyay D, Chakrabarti G (2014) MIR-17 -5p Nedregulering Bidrar til Paclitaxel Resistance av lungekreftceller gjennom å endre Beclin1 Expression. PLoS ONE 9 (4): e95716. doi: 10,1371 /journal.pone.0095716
Redaktør: Bernard Mari, IPMC, CNRS UMR 7275 UNS, Frankrike
mottatt: 02.12.2013; Godkjent: 29 mars 2014; Publisert: 22 april 2014
Copyright: © 2014 Chatterjee et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet ble støttet av et stipend fra Institutt for bioteknologi, Govt. av India (No. BT /PR12889 /AGR /36/624/2009) til GC. AC ble støttet av et fellesskap fra samme bevilgning, og senere, et fellesskap fra DST- PURSE program, Universitetet i Calcutta. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er en av de vanligste kreftformen, og en av de viktigste årsakene til kreft dødsfall i denne verden. Nesten 85% av lungekreft tilfellene hører til ikke-små-celle lungekreft (NSCLC) [1]. Paclitaxel basert kombinasjon kjemoterapi er nå blitt betraktet som standardbehandling for nesten alle pasienter diagnostisert med NSCLC [2]. Paclitaxel binder til β- subenheten av α- β tubulin heterodimer, stabiliserer mikrotubuli, reduserer sin dynamicity i mitotisk spindel, fører G
2 /M cellesyklus arrest og driver kreftceller til å apoptotisk død, aktivere spindle- mitotisk sjekk punkt [3]. Dessverre er den kliniske affekt av paclitaxel begrenset fordi noen svulster viser motstand eller blir resistente mot det etter gjentatte sykluser av paclitaxel kjemoterapi som til slutt fører til tilbakefall og dårlig prognose. De rapporterte mekanismene for paclitaxel motstand involverer oppregulering av P-glykoprotein og beslektede medikament efflukspumper [4], [5], utilstrekkelig interaksjon med spindel mikrotubuli på grunn av posttranslasjonell modifikasjon eller endret ekspresjon av tubulin isotyper og mikrotubul-assosiert protein [6] – [8] eller funksjonell forandring i cellesignalisering og celleoverlevelsesreaksjonsveier [9] – [12]. Nyere studier viser at autophagic induksjon av paclitaxel spiller en viktig rolle i utviklingen av paclitaxel motstand i tumorceller [13] – [15] Hotell
microRNAs, en høyt konservert familie av små, ikke-kodende RNA som nylig. dukket opp som ny klasse av genuttrykk modulatorer på posttranskripsjonelt nivå [16] – [18]. Dette skjer gjennom perfekt eller imperfekt baseparing på miRNA gjenkjenningselementer (mres) i det 3′-ikke-translaterte region (UTR) av mål-mRNA, noe som resulterer i mRNA destabilisering og translasjonelle undertrykkelse [16], [19], [20]. Avvikende miRNA uttrykket har blitt hyppig observert i ulike menneskelige kreftformer inkludert NSCLC [21], [22]. I de senere år har gjort forsøk på å korrelere feilregulering av spesiell miRNA uttrykk med tumor respons på kjemoterapi, inkludert paclitaxel [13], [23] -. [26]
I denne studien var vi interessert i å undersøke rolle mirnas i utviklingen av paclitaxel motstand i lungecancerceller knyttet til autophagy. Vi utførte miRNA arrays for å skjerme forskjellig uttrykt mirnas mellom paclitaxel- sensitive (A549) og paclitaxel- resistente lungekreftceller (A549-T24). Vi identifiserte at Mir-17-5p ble nedregulert i paclitaxel resistente lungekreftceller (A549-T24 og H596-TXR) og dens overekspresjon fremme paclitaxel indusert cytotoksisitet og apoptose. Videre våre data viste at beclin1, en av de viktigste regulatorer av celle autofagi, var et direkte mål på MIR-17-5p i lunge kreftceller.
Til sammen alle funnene vi konkludert med at MIR-17 -5p spilte en avgjørende rolle i utviklingen av paclitaxel motstand ved å regulere mobil autofagi. Undertrykkelse av uttrykk for MIR-17-5p ble knyttet til oppregulering av beclin1 uttrykk og konkordant autofagi som spilte en CYTO-beskyttende rolle og beskyttet cellene fra paclitaxel indusert apoptose og celledød.
Materialer og metoder
Material
Nutrient blanding Dulbeccos modifiserte Eagles medium (supplementert med 1 mM L-glutamin), føtalt bovint serum, penicillin-streptomycin, amfotericin B og 0,25% Trypsin-EDTA ble innkjøpt fra GIBCO (Invitrogen) . Paclitaxel ble kjøpt fra Sigma, USA. AnnexinV-FITC apoptose kit var fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA, USA). JC-1 og H2-DCFDA ble kjøpt fra Sigma, USA. Bradford protein estimering kit ble kjøpt fra Genei, India. Alle andre kjemikalier og reagenser var av analytisk kvalitet og ble kjøpt fra Sisco Research Laboratories, India.
Cell Line og Cell Culture
Menneskelig ikke-liten lunge epithelial adenokarsinom cellelinje Type II, A549, ble hentet fra cellen omplasserer av Nasjonalt senter for Cell Science (NCCer), Pune, India. Human lunge adenosquamous carcinoma cellelinje NCI-H596 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC). Begge cellene ble preget av mt-rDNA sekvensering for artsbestemmelse, kort tandem repeat profilering og isoenzym analyse for cellelinje autentisering og ble bekreftet å være negative for mycoplasma forurensning av depotet. Både A549 og H596-celler ble valgt for resistens til paclitaxel (Sigma, USA) på en trinnvis måte i det vesentlige som beskrevet [27], [28]. I korthet, A549-celler ble først utsatt for to nM av paclitaxel og en gang normal vekst ble oppnådd medikamentdosen ble øket i multipler av to inntil en sluttkonsentrasjon på 24 nM paclitaxel (A549-T24) ble nådd. For NCI-H596-celler som var litt tolerant overfor paclitaxel, ble først utsatt 5 nM av paclitaxel og holdes ved denne konsentrasjon inntil normal vekst ble nådd. Deretter ble medikamentdosen ble forbedret i multipler av tre inntil en endelig dose på 15 nM paclitaxel (H596-TXR) ble oppnådd. Begge cellene ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) supplementert med 1 mM L-glutamin, 10% fatalt bovint serum, 3,7 g /l NaHCOs
3, 100 ug /ml hver av penicillin og streptomycin og 2,5 ug /ml amfotericin B. Celler ble holdt ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2. Cellene ble dyrket opp 70-80% konfluens i vevskulturflasker, deretter trypsinert med 0,25% trypsin EDTA og delt inn i etterfølgende kultur plater som kreves.
miRNA Micro Array Expression Analysis
miRNA profilering av A549 og A549-T24 celler ble gjort fra Exiqon (Vedbæk, Danmark). Total RNA inkludert miRNA ble hentet fra A549 og A549-T24 celler ved hjelp av Qiagen miRNeasy mini kit følger produsentens protokoll. De totale RNA prøver med tilstrekkelig kvalitet for analyse av miRCURY LNA miRNA microarray plattform ble merket med miRCURY LNA mikroRNA Hi-Power Merking Kit, Hy3 /Hy5 og par av prøven ble hybridisert på miRCURY LNA mikroRNA Array (sjette gen – HSA, MMU RNO) og rekken ble lest i Agilent G2505B Micro radarantenne systemet i en ozon fritt miljø. Bare de mirnas som ble feilregulert med minst to ganger (ΔLMR ≥2) ble tatt i betraktning.
Pre- miRNA Transfeksjon
Mirvana miRNA 17 ligne forløpere (pre-MIR-17-5p ) og Mirvana miRNA etterligne negativ kontroll # 1 (pre-MIR-negativ kontroll) ble kjøpt fra Ambion. Forhånds mirnas ble transfektert inn i cellelinjer på -50% konfluens på 100 nM konsentrasjon med Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) transfeksjon reagens. Førti-åtte timer etter transfeksjon, ble uttrykket av MIR-17-5p oppdaget av real-time PCR og uttrykk for BECN1 ble testet ved QRT-PCR og /eller Western blotting.
Kvantitativ Real-time PCR (QRT-PCR)
For miRNA uttrykket analyse, ble QRT-PCR gjøres ved hjelp av TaqMan mikroRNA revers transkripsjon kit (Applied Biosystems) og TaqMan mikroRNA analyser kit (Applied Biosystems) etter produsentens protokoller. U6 snRNA fungerte som den interne kontrollen.
For å analysere uttrykk for BECN1, Bax, BCL-2, LC3-II og glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) og caspase-3 (tabell 1), cDNA ble syntetisert fra 1 pg av total RNA ved hjelp av Superscript VILO cDNA Synthesis kit (Invitrogen). CDNA ble blandet med 2 x dynamo ColorFlash SYBR grønn qPCR Master Mix (Thermo Scientific) og ulike sett av genspesifikke primere, og deretter underkastet QRT-PCR kvantifisering ved hjelp av StepOne- Plus sanntids-PCR-system (Applied Biosystems). Genekspresjon ble beregnet i forhold til GAPDH (for BECN1, BCL-2, Bax, LC3-II, caspase-3 etc) eller U6 snRNA (for MIR-17-5p) ved hjelp av sammenlignende syklus tid (Ct) metode (2
-ΔΔCt metode) [29], [30].
Cell Proliferation hemningsmetoden (MTT-analyse)
A549-T24 og H596-TXR celler, enten transfektert med 100 nM pre-MIR-17-5p (henholdsvis T24-MIR-17-5p og TXR-MIR-17-5p) eller med 100 nM pre-MIR-negativ kontroll RNA (T24-MIR-NC og TXR-MIR-NC henholdsvis) ble sådd ut i 96-brønners kulturplater (1 x 10
4 celler per brønn). Etter 24 timers inkubering ble mediet erstattet med friskt medium og cellene ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av paclitaxel i ytterligere 24 timer. MTT (5 mg /ml) oppløst i PBS og filtersterilisert, deretter 20 ul av den fremstilte løsning ble tilsatt til hver brønn. Dette ble inkubert inntil fiolett bunnfall var synlig. Deretter ble 100 ul av Triton-X100 ble tilsatt til hver brønn og inkubert i mørke i 2 timer ved romtemperatur. Absorbansen ble målt på en ELISA-leser (MultiskanEX, Lab systemer, Helsinki, Finland) ved en test bølgelengde på 570 nm og en referanse bølgelengde på 650 nm. Data ble beregnet som den prosentvise inhibering ved den følgende formel:. (1)
A
t og A
s indikerte absorbans av teststoffer og oppløsningsmiddel-kontroll, henholdsvis [31]
trypanblått utelukkelse assay for celleviabilitet
trypanblått eksklusjon analyse [32] ble brukt til å bestemme antall levedyktige og døde celler etter pre-MIR-17-5p transfeksjon og påfølgende paclitaxel behandling. Kort fortalt ble T24-MIR-17-5p eller T24-MIR-NC celler sådd ut i 6-brønners kulturplater (5 × 10
4 celler per brønn). Da celler ble behandlet med 24 nM og 50 nM paclitaxel i ytterligere 24 timer. Etter 24 timer ble cellene høstet ved trypsinering, vasket to ganger med 1 x PBS og så farget med 0,4% trypanblått i PBS. Cellene ble deretter utarbeidet for analyse av flowcytometri.
Bygging av luciferaserapportørplasmid konstruerer og Luciferase aktivitetsanalyse
3’UTR-luciferaserapportørplasmid konstruksjoner som inneholder 3’UTR av BECN1 med eller uten MIR -17-5p bindingssetet ble PCR amplifisert fra total cDNA fremstilt fra total RNA hentet fra A549-T24 celler. PCR-produktene ble klonet inn
PCI neo-RL-luc
reporter vektor (En sjenerøs gave fra Dr. SN Bhattacharyya, IICB, Kolkata, India.) Mellom
Xba
jeg og
Ikke
i restriksjonsseter, umiddelbart nedstrøms Renilla luciferase genet. Alle luciferasepreparater konstruksjonene ble sekvensen verifisert. Cellene ble transient gitt samtidig transfektert med Renilla luciferase reporter plasmider (
PCI neo-RL-Bec-3
«
UTR-wt
eller
PCI neo-RL-Bec-3
«
UTR-mut
), ildflue luciferase plasmid (
pGL3-FF
) og pre-MIR-17-5p forløper og /eller anti-MIR-17-5p eller pre -miR-negativ kontroll forløper RNA bruker lipofectamine2000 transfeksjon reagens følge produsentens protokoll. Etter 48 timer med transfeksjon ble cellene høstet og lysert med passiv lyseringsbuffer (Promega). Luciferase aktiviteter i cellulære ekstrakter ble bestemt ved å bruke Promega dual luciferase reporter analysen kit på en VICTOR X3 Plate Reader system (PerkinElmer). De relative luciferase-aktivitet ble beregnet ved forholdet mellom Renilla luc /Firefly luc aktivitet og normalisert til den for kontrollcellene og brett undertrykkelse ble beregnet. pGL3-FF vektor ble brukt som intern kontroll.
Påvisning av Surt Vesicula organeller (AVOS)
For å observere reduksjonen i AVOS formasjon, T24-MIR-17-5p og T24-MIR -NC celler ble sådd på dekkglass. Etter 48 timer med transfeksjon, ble cellene farget med acridin orange (AO) (1 pg /ml) ved 37 ° C i mørke i 15 minutter, deretter vasket to ganger med PBS. Bilder av AO flekker ble visualisert umiddelbart med fluorescens mikroskop (Olympus IX70, Japan). Cytoplasma og cellekjernen av fargede celler fluorescerte lys grønn, mens de sure autophagic vakuoler fluorescerte lys rød. Lignende forsøk ble også utført med A549 celler.
For å kvantifisere endringen i antall sure vesikler (AVOS) i A549, T24-MIR-NC og T24-MIR-17-5p celler, ble de farget med AO (1 pg /ml) i PBS ved 37 ° C i 15 minutter, ble cellene høstet, vasket to ganger i PBS og resuspendert i 500 ul PBS, og deretter analysert umiddelbart ved strømningscytometri-analyse. Den flowcytometrisk data ble analysert med Cellquest analyse programvare (Becton Dickinson) [33].
Merking av autophagic vakuoler med Monodansylcadaverine
A549-T24 celler ble transfektert med enten pre-MIR-17- 5p (100 nM) eller med pre-speil negativ kontroll RNA (100 nM), sådd ut på dekkglass og holdt for en annen 48 timer. Celler ble inkubert med 50 pM monodansylcadaverine i 10 minutter ved 37 ° C i PBS, og bilder ble tatt av fluorescens mikroskop (Olympus IX70, Japan). Videre, for kvantitativ analyse av autophagosome formasjons samme prøvene ble trypsinert og analysert ved flowcytometri analyse [34].
flowcytometrisk analyse for apoptotiske celler
T24-MIR-NC og T24-speil 17-5p-celler ble behandlet med 24 nM og 50 nM paclitaxel i 24 timer. Omtrent 1 x 10
5 Cellene ble deretter farget i 15 minutter ved romtemperatur i mørke med FITC-konjugert annexinV (1 pg /ml) og propidiumjodid (PI) (0,5 ug /ml) i et Ca
2 + -anriket bindingsbuffer og analysert ved hjelp av en to-farge strømningscytometrisk analyse. AnnexinV og PI-utslippene ble oppdaget i FL1 og FL2 kanaler med en FACSCalibur flowcytometer hhv (Becton Dickinson, USA) [31]. Dataene ble analysert ved hjelp av Cellquest program fra Becton-Dickinson.
Fastsettelse av mitokondriemembranen potensial (ΔΨ)
For å evaluere mitokondriemembranen potensial (ΔΨ), 5,5 «, 6,6 «tetraklor-1,1′, 3,3»-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine jodid (JC-1), en følsom fluorescerende probe for ΔΨ ble anvendt [35]. T24-MIR-NC og T24-MIR-17-5p celler ble behandlet med 24 nM og 50 nM paclitaxel i 24 timer. Cellene ble deretter høstet, vasket to ganger med PBS, farget med 5 uM JC-1 i 30 minutter ved 37 ° C i mørket. Cellene ble skylt to ganger med PBS, resuspendert i 500 ul PBS og umiddelbart bedømt for rød fluorescens (JC-1) med FACSCalibur strømningscytometer (Becton-Dickinson, USA).
Måling av reaktive oksygen arter (ROS)
ROS-nivåer ble bestemt ved bruk av fluoriserende fargestoff 2 «, 7»- dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-dA) [36]. Kort sagt ble T24-MIR-NC og T24-MIR-17-5p-celler ble behandlet med 24 nM og 50 nM paclitaxel i 24 timer. Cellene ble trypsinert, vasket med PBS og inkubert med 10 mM DCFH-DA i 30 minutter i mørke ved romtemperatur og forskyvning i den grønne fluorescensintensitet, som detektert i FL1 kanal, etterfulgt av et FACSCalibur strømningscytometer (Becton-Dickinson, USA) og dataene ble analysert med Cellquest analyse programvare (Becton Dickinson, USA).
Statistical Analysis
QRT-PCR reaksjoner ble kjørt i tre eksemplarer for hver prøve og gjentatt minst 3 ganger og dataene ble statistisk analysert med Student «t-test «eller Wilcoxon rank sum test. IC
50 data fra MTT-analysen ble analysert med Wilcoxon rank sum test. Alle data ble vist som gjennomsnitt ± S.E. (Standard feil). To målinger var statistisk signifikant hvis den tilsvarende p-verdien var. 0,05
Resultater
Profiler av mirnas i Paclitaxel- sensitive og resistente lungekreft celler
Vi utarbeidet paclitaxel- ikke-liten celle kreft motstandsdyktig lunge (A549-T24) fra paclitaxel-sensitive celler ved kontinuerlig eksponering av A549-celler til paclitaxel (fig. S1A). For å søke etter de kritiske mirnas involvert i utviklingen av paclitaxel motstand, total RNA, hentet fra lungekreftceller (A549) og deres paclitaxel motstandsdyktig variant (A549-T24), ble sendt til Exiqon, Danmark for miRNA rekke profilering. Fra tabellen resultatene ble det funnet at 23 mirnas ble uttrykt forskjellig på A549-celler enn T24 A549-celler (Fig. 1).
miRNA array-profiler av paclitaxel sensitive (C1 og C2) og resistente (Tx1 og Tx2 ) lungekreftcellelinjer ble vist. Overvåket hierarkisk clustering av cellelinjer basert på deres differensial mirnas uttrykk med ΔLMR≥2 mellom de to gruppene ble utstilt. Hver kolonne representerer en cellelinje, og hver rad en sonde sett. Varmen kartet indikerer høy (rød) eller lav (blå) nivå av uttrykk i forhold til gjennomsnittet i henhold til skalaen vist i figuren.
For å identifisere målgener av disse forskjellig uttrykt miRNAs, vi søkte miRNA mål prediksjon databaser miRBase, microRNA.org og TargetScanHuman 6.2 og vi identifisert MIR-17-5p trolig kunne ha en rolle i autofagi ved å målrette autofagi relatert protein beclin 1 (BECN1) ved å binde seg direkte til sin 3 «UTR region mellom posisjon 135 til 141. det er allerede rapportert at induksjon av autophagy av paclitaxel behandling spiller en viktig rolle i utviklingen av paclitaxel motstand i tumorceller med oppregulering av BECN1 [13] – [15]. Vi har observert øket nivå av autophagy som angitt ved oppregulering av BECN1 og økt LC3-I til LC3-II omdannelse og nedregulering av p62-ekspresjon i A549-T24-celler i forhold til A549-celler (Fig. 2A). Vi målte relative mRNA-nivåer av BECN1 og LC3-II (Fig. 2B og 2C) og funnet begge disse mRNA ble oppregulert i A549-T24-celler i forhold til A549-celler. For å utvide våre funn har vi utarbeidet en annen paclitaxel resistent lungekreft cellelinje H596-TXR fra paclitaxel sensitive NCI- H596 celler
in vitro plakater (Fig. S1B) og undersøkt status for BECN1 og LC3 i denne resistent lungekreft celle linjen (H596-TXR). Vi fant lik oppregulering av BECN1 og økt LC3-I til LC3-II konvertering i paclitaxel resistente H596 celler (H596-TXR) i forhold til foreldre H596 celler (Fig. S2A). Videre analyse av relative mRNA nivåer av BECN1 og LC3-II (Fig. S2B og S2C fig.) Også bekreftet betydelig oppregulering av mobilnettet autophagy i H596-TXR celler i forhold til H596 celler.
(A) Expression status av visse autophagic markørproteiner BECN1, MAP-LC3, p62 og GAPDH (lasting kontroll) ble målt ved Western blotting. (B-C) Relativ BECN1 og LC3-II mRNA uttrykk nivåer ble kvantifisert ved QRT-PCR-analyse i A549 og A549-T24 celler,
barer
representerer gjennomsnitt ± S.E. (
*
p 0,03 vs kontroll, hvor n = 3) (D) nedregulering av MIR-17-5p ekspresjon i paclitaxel-resistente lungekreftceller (A549-T24) i forhold til A549-celler. Taqman QRT-PCR ble utført for å oppdage de relative nivåer av MIR-17-5p i A549 og A549-T24 celler. Resultatene ble normalisert til snU6 ekspresjonsnivået og stilles som gjennomsnitt ± S.E. fra tre uavhengige replikater.
(** p 0,001
vs kontroll, n = 3)
miRNA-17-5p er nedregulert i Paclitaxel- Resistente lungekreft celler
. ytterligere validert tabelldata for Mir-17-5p av Taqman QRT-PCR. Ved hjelp av Taqman sonde basert qRT- PCR-analyse, sammenlignet vi ekspresjonsnivået av MIR-17-5p i paclitaxel sensitive og resistente A549 celler. Fig. 2D viser et ~7.2 fold nedregulering i forhold MIR-17-5p uttrykk nivå i A549-T24 celler sammenlignet med A549 celler, validere mikromatrise resultater. Vi har også beregnet uttrykket nivået av MIR-17-5p i H596-TXR celler og sammenlignet det med at av H596 celler. Vi fant at H596-celler TXR oppviste nesten ~2.62 gangers nedregulering av relativ MIR-17-5p ekspresjon sammenlignet med paclitaxel-sensitive H596-celler (fig. S2D) som angir sammenhengen mellom MIR-17-5p og paclitaxel motstand var ikke-cellelinje spesifikk .
Følsomhet for paclitaxel moduleres av overuttrykte MIR-17-5p
in vitro
for å undersøke om MIR-17-5p overekspresjon sensibilisert A549-T24 celler til paclitaxel transfektert vi A549-T24 celler med 100 nM pre-MIR-17-5p (T24-MIR-17-5p) eller 100 nM pre-speil negativ kontroll RNA (T24-MIR-NC) og 24 h etter transfeksjon ble cellene behandlet med forskjellige doser av paclitaxel (0-200 nM). Det ble observert at sammenlignet med negativ kontroll (T24-MIR-NC), overekspresjon av MIR-17-5p betydelig sensitivisert de A549- T24 celler til paclitaxel (figur 3A,
p. 0,05 Hotell og
p 0,03
). For eksempel, T24-MIR-17-5p celler oppviste nesten 86%, 51%, 31% og 6% celleviabilitet når cellene ble behandlet med 12 nM, 50 nM, 100 nM og 200 nM paclitaxel i 24 timer henholdsvis. Under like forhold T24-MIR-NC celler viste nesten 99%, 89%, 78% og 58% levedyktighet. Lignende resultater ble oppnådd når vi overexpresed 100 nM forhånds MIR-17-5p inn i H596-celler TXR (TXR-MIR-17-5p) og behandles cellene med tilsvarende doser av paclitaxel (0-200 nM) i 24 timer. Det ble observert at sammenlignet med den negative kontroll (TXR-MIR-NC), TXR-MIR-17-5p celler oppviste mye lavere cellelevedyktighet når de ble behandlet med økende konsentrasjoner av paclitaxel. Kompdoseresponskurver er vist i fig. S3A.
(A) A549-T24 celler ble enten transfektert med 100 nM pre-MIR-negativ kontroll (T24-MIR-NC) eller pre-MIR-17-5p (T24-MIR-17-5p ) forløper RNA og ble sådd på 96 brønners plater i en tetthet på 1 x 10
4 celler per brønn. Etter 24 timer ble cellene behandlet med 0, 12, 24, 50, 100, 200 nM paclitaxel i ytterligere 24 timer. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved MTT-analyse. Data er presentert som% av celle-levedyktighet målt i celler behandlet med paclitaxel.
Kolonner
, mener tre uavhengige eksperimenter;
barer
, mener ± bred singlett. (* P 0,05 vs negativ kontroll, p 0,03 vs kontroll A549, hvor n = 4). (B-C) celler (T24-MIR-NC og T24-MIR-17-5p) ble deretter behandlet med 24 nM og 50 nM paclitaxel i 24 timer og underkastet FACS-analyse etter å ha blitt farget ved trypan blå. Histogram representerer den røde fluorescens intensitet (FL3-H) vs. teller tomten der doseavhengig økning av celledød inntreffer. Resultatene representerer det beste av data samlet inn fra tre eksperimenter med lignende resultater.
Dette tapet av celle levedyktighet av MIR-17-5p overekspresjon og påfølgende paclitaxel behandling ble videre undersøkt ved trypan blått fargestoff utelukkelse analysen bruker strømningscytometer (fig. 3B og 3C,
p 0,01
) med A549-T24 celler. Levende celler har intakte cellemembraner som ekskluderer trypan blå, men trenger ikke døde celler og til slutt ta opp trypanblått. Fig. 3B og 3C viser at med MIR-17-5p overekspresjon og påfølgende paclitaxel behandling (24 og 50 nM) i 24 timer, rest celleviabilitet av T24-MIR-17-5p celler ble redusert i forhold til de respektive negative kontroller. For eksempel, mens MIR-17-5p overekspresjon og påfølgende behandling med 24 nM og 50 nM paclitaxel i 24 timer forårsaket nesten 25% og 46% celledød, svarende negative kontroller oppviste bare 4% og 6% celledød, respektivt. Resultatene indikerte at Mir-17-5p overekspresjon spiller en nøkkelrolle i sensibiliserende paclitaxel resistente A549-T24 celler til paclitaxel.
Beclin 1 er et direkte mål av MIR-17-5p i lungekreftceller
for å finne ut om MIR-17-5p direkte binder seg til 3′-UTR regionen BECN1 mRNA, vi bygget 3′- UTR journalister fra BECN1 inneholder antatte MIR-17-5p bindingssetet og tilsvarende mutant konstruere, mangler speil 17-5p bindingssete, nedstrøms for luciferase reporter-genet (fig. 4A). Co-transfeksjon av pre-MIR-17-5p med BECN1 villtype-reporter-konstruksjonen i A549-T24-celler sterkt undertrykt Renilla luciferase-aktivitet (Fig. 4B), mens ko-transfeksjon med mutant reporter-konstruksjonen viste ingen signifikant endring i relativ luciferaseaktivitet med den til kontroll (fig. 4B). Dessuten, når A549-T24-celler ble samtidig transfektert med anti-MIR-17-5p (100 nM) og 3′- UTR meldere av BECN1, med eller uten formodede MIR-17-5p bindingssete, ingen betydelig reduksjon i relativ luciferaseaktivitet Det ble ikke observert (fig. 4B). Disse resultatene kollektivt bekreftet at BECN1 var et direkte mål på MIR-17-5p i lungekreftceller.
(A) Skjematisk fremstilling av 3′-UTR av menneskelig BECN1 karakterutskrift. Forut MIR-17-5p bindingssetet ble avbildet. Tallene (+ 135-141) representerte nukleotider som ble spådd å basepar med MIR-17-5p frø sekvens. (B) MIR-17-5p bindes direkte til 3′-UTR av BECN1 genet i A549-T24-celler. A549-T24 celler ble gitt samtidig transfektert med Renilla luciferase reporter plasmider (
PCI neo-RL-Bec-3
«
UTR-wt
eller
PCI neo-RL-Bec -3
«
UTR-mut
), ildflue luciferase plasmider (pGL3-FF) og pre-MIR-17-5p forløper eller anti-MIR-17-5p eller pre-MIR-negativ kontroll forløper RNA bruker lipofectamine2000 transfeksjon reagens. Etter 48 timer ble cellene høstet og lysert med passiv lyseringsbuffer. Luciferase-aktivitet ble målt ved å bruke Promega dual luciferase reporter assay kit. Resultatene var representert som relativ fold undertrykkelse (Renilla Luc /Firefly luc aktivitet) sammenlignet med kontrollceller. (* P 0,05, ** p 0,03 vs kontroll, n = 4)
Overuttrykte MIR-17-5p i Paclitaxel Resistente lungekreft celler fører til Beclin en Nedregulering
for å eksperimentelt validere mål prediksjon, vi vurdert de proteinnivåer BECN1 følgende MIR-17-5p overekspresjon inn både A549-T24 og H596-TXR celler. Fig. 5A viser, overekspresjon av MIR-17-5p betydelig redusert BECN1 uttrykk i forhold til den negative kontrollen (T24-speil NC). Dette ble ytterligere bekreftet ved vurderingen av mRNA-nivåer av BECN1 ved QRT-PCR. Vi fant, MIR-17-5p overekspresjon redusert BECN1 mRNA nivå ved ~5.6 ganger (
p 0,01
) i A549-T24 celler i forhold til negativ kontroll. Vi testet uttrykket nivåer av to andre autophagic markører, LC3-II og p62 som er nedstrøms BECN1 ved Western blotting. Overekspresjon av MIR-17-5p i A549-T24 celler redusert konvertering av LC3-I til LC3-II (Fig. 5A, andre blot og 5C fig.) Og økt nivå av p62 (fig. 5A, tredje blot). Ved H596-TXR celler, fant vi også at overekspresjon av MIR-17-5p resulterte i konkordant nedregulering av BECN1 og LC3-II i H596-TXR celler (Fig. S3b-D). Alle disse dataene samlet bevist at overekspresjon av MIR-17-5p inn paclitaxel motstandsdyktig lungekreftceller forårsaket reduksjon i celle autofagi av direkte rettet mot autofagi relatert protein BECN1.
(A) A549-T24 celler ble transfektert med enten 100 nM pre-MIR-negativ kontroll (T24-MIR-NC) eller pre-MIR-17-5p (T24-MIR-17-5p) forløper RNA. Etter 24 timer, ble cellelysater fremstilt for Western blotting med antistoff mot BECN1, MAP-LC3, p62 og GAPDH ble anvendt som kontroll lasting. (B-C) Relativ BECN1 og LC3-II mRNA uttrykk nivåer ble kvantifisert ved QRT-PCR-analyse i T24-MIR-NC og T24-MIR-17-5p celler,
barer
representerer gjennomsnitt ± S.E. fra tre uavhengige forsøk (** p 0,01 vs kontroll, hvor n = 3)
Overuttrykte MIR-17-5p Hemmer Autophagy i Paclitaxel Resistant A549-T24 celler
. paclitaxel induserer autophagy i kreftceller [13] – [15]. Svulstceller bruker denne cytoprotective autofagi som et forsvar fra apoptotisk celledød som i sin tur bidrar til utvikling av paclitaxel motstand. Under authophagy, autophagosomes sikring med lysosomer å danne autophagolysosomes som er sure vakuoler (AVO) som binder acridine-oransje gir rød fluorescens og kan lett vurderes av fluorescens mikroskopi og strømningscytometer. Fig. 6A-B viste mens paclitaxel sensitive A549 celler viste nesten ingen røde blemmer (Fig. 6A), ble observert stort antall røde fluorescerende vesikler i cytoplasma av T24-MIR-NC celler (Fig. 6B). Men når A549-T24 celler ble transfektert med MIR-17-5p (T24-MIR-17-5p celler), utseendet på rød AVO er redusert betydelig (Fig. 6C). Disse resultatene ble bekreftet ved flowcytometrisk analyse (fig. 6D-G). Vi observerte at T24-MIR-NC-celler viste høyere autophagic flussmiddel i forhold til A549-celler (fig. 6D i forhold til fig. 6E). Men når A549-T24 celler ble overexpressed med MIR-17-5p, dannelse av AVO er betydelig redusert sammenlignet med T24-MIR-NC celler (Fig. 6F forhold til fig. 6E). Fig. 6G viser kvantitativ representasjon av AVOS i celler som ble beregnet ut fra strømningscytometer resultater.
T24-MIR-NC og T24-MIR-17-5p celler ble farget med AO for AVO observasjon under fluorescens mikroskop (B og C ). AO farging av A549 tjente som kontroll (A). (D-F) For å kvantifisere endring i% av cellene utviklings AVO følgende MIR-17-5p overekspresjon i A549-T24 celler, flyt cytometri estimering av AVOS ble gjort i A549, T24-MIR-NC og T24-MIR-17- 5p celler henholdsvis. (G) Kvantitering av midlere AVO-positive celler i alle tre cellelinjer. Dataene presentert er gjennomsnittet ± S.E. (* P 0,05 vs kontroll, hvor n = 3). Fig. Som vist på fig. Fig. GAPDH tjente som lasting kontroll. Fig. Som vist på fig.
