Abstract
Bakgrunn
bioenergetisk status av ikke-småcellet lungekreft korrelerer med tumor aggressivitet. Spenningen som er avhengig anionet kanal type 1 (VDAC1) er en komponent av den mitokondrielle permeabiliteten overgang pore, regulerer mitokondriell ATP /ADP utveksling som tyder på at dens over-ekspresjon kan være forbundet med energiavhengige prosesser, inkludert økt proliferasjon og invasivitet. For å teste denne hypotesen, gjennomførte vi en in vivo gen-uttrykk meta-analyse av kirurgisk reseksjon ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) med 602 individuelle uttrykk profiler, for å undersøke virkningen av VDAC1 på overlevelse.
Methodology /hovedfunnene
Høy VDAC1 uttrykk var assosiert med kortere total overlevelse med hazard ratio (HR) = 0,6639 (95% konfidensintervall (KI) 0,4528 til 0,9721), p = 0,035352 tilsvarende 52 versus 101 måneder. VDAC1 spådd kortere tid til tilbakefall og ble vist å være en uavhengig prognostisk faktor sammenlignet med histologi, kjønn, alder, nodal scenen og tumorstadium i en Cox multivariat analyse. Overvåket analyse av alle datasettene identifisert en 6-gen signatur bestående HNRNPC, HSPA4, HSPA9, UBE2D2, CSNK1A1 og G3BP1 med overlappende funksjoner som involverer regulering av protein omsetning, RAS-RAF-MEK sti og transkripsjon. VDAC1 spådd overlevelse i brystkreft og myelom og en unsupervised analyse avslørte berikelse av VDAC1 signatur i bestemte undergrupper.
Konklusjoner
I sammendraget, identifiserer genekspresjonsanalyser VDAC1 genuttrykk som en prediktor for dårlig utfallet i NSCLC og andre kreftformer og er forbundet med feilregulering av en konservert sett av biologiske mekanismer, som kan ha en årsakssammenheng med aggressiv svulst atferd
Citation. Griller C, Jithesh PV, Blayney J, Zhang SD, Fennell dA (2011) Gene Expression Meta-Analysis Identifiserer VDAC1 som en prediktor for dårlig resultat i Early Stage ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 6 (1): e14635. doi: 10,1371 /journal.pone.0014635
Redaktør: Rory Edward Morty, University of Giessen Lung Center, Tyskland
mottatt: 5 juli 2010; Godkjent: 23 november 2010; Publisert: 31 januar 2011
Copyright: © 2011 Griller et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. CG er finansiert av Department of Employment og læring. DAF er finansiert av Cancer Research Storbritannia på en Lege Scientist Fellowship. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er en vanlig, stor grad uhelbredelig kreft. På begynnelsen av sykdommen innstillingen, er kirurgisk reseksjon standarden på omsorg og nytte av adjuvant kjemoterapi er begrenset til 5-15% forbedring i overlevelse i stadium II, men ikke iscenesette jeg sykdom [1]. Men tilbakefall er vanlig i stadium I kreft med 37% av pasientene som dør innen fem år, derfor er det behov for å identifisere pålitelige biomarkører for dårlig utfall for å målrette enkeltpersoner for hvem adjuvant eller roman målrettet terapi kan forbedre overlevelse. Endring i tumor metabolisme er et kjennetegn på kreft og høye nivåer av heksokinaseløsning avhengig glukose fangst i NSCLC dokumentert av standardiserte opptak verdier på positronemisjonstomografi, er assosiert med kortere overlevelse [2]. Dette er sett i både tidlig og avansert NSCLC [3], [4].
Spenning Dependent Anion Kanal 1 (VDAC1) er en ytre mitokondriemembran protein som er involvert i reguleringen av ATP /ADP utveksling og luftkontroll [5]. VDAC1 samhandler med proapoptotiske BCL-2 familie proteiner [6], [7]. Imidlertid har sin rolle i regulering av mitokondriell ytre membran depolarisering vært kontroversielt [8], [9], [10]. Likevel fremstår data har identifisert en mulig rolle for dette proteinet i regulering av celleoverlevelse og av denne grunn har vi funnet det verdig videre studier. Permeabiliteten overgangen pore, som består VDAC1, er direkte regulert av BH3-only proapoptotiske BCL-2 familiemedlem BAD [10] og regulerer celle overlevelse. I motsetning til dette, har den type II isoform (VDAC2) blitt identifisert som en antiapoptotic, negativ regulator av BAK [9], [11], [12]. Den adenin-nukleotid Translocator (ANT) som ligger i den indre mitokondrielle er også ansett for å være en viktig del av permeabiliteten overgangen pore [13], og sammen med VDAC det antas å kontrollere mitokondrielle remodeling prosesser, enten direkte eller indirekte [14] . Nylig har det bakterielle protein FILA [15] er blitt vist å regulere et kompleks av VDAC1 med heksokinase II [16] som inhiberer apoptose. En økende mengde data antyder at heksokinaseløsning-VDAC interaksjon er anti-apoptotiske [17], og forstyrrelse av dette samspillet kan være en strategi for å indusere celledød [18], [19]. VDAC-heksokinase komplekset har blitt rapportert å være regulert av glykogen syntase kinase 3p [19] og AKT [20].
Kreftceller med lav VDAC1 indusert av RNA-interferens oppviser en defekt i cellevekst in vivo [21 ]. Motsatt kan høye nivåer av VDAC1 uttrykk nivåer konferere tumorcelle utvalg fordel ved å tilrettelegge energiavhengige prosesser som spredning og invasivitet [22]. Selv heksokinaseløsning II uttrykk har blitt knyttet til dårligere prognose [23], til dags dato har det ikke vært noen studier som undersøker potensialet prognostisk effekt av VDAC1 hos pasienter med kreft. Det ble derfor antatt at VDAC1 uttrykk kan påvirke overlevelse etter NSCLC reseksjon. Her viser vi ved hjelp av genuttrykk meta-analyse som VDAC1 overekspresjon er en sterk, uavhengig, dårlig prognostisk faktor i tidlig stadium ikke-småcellet lungekreft basert på kombinert analyse av flere genuttrykk datasett. VDAC1 overekspresjon er konsekvent forbundet med overekspresjon av 6 flere gener involvert i overlevelse signalering, protein ubiquitinering og ATP bindende. Denne foreningen opprettholdes på tvers av flere uavhengige datasett og på tvers av ulike kreftformer som tyder på en mulig rolle for disse biologiske prosesser i regulering tumor atferd og derfor klinisk utfall i NSCLC.
Resultater
VDAC1 overekspresjon spår kortere overlevelse i NSCLC
i alt ble 8 uavhengige NSCLC datasett kuratert fra Gene Expression Omnibus (GEO), med totalt 602 mikromatriser. I alle datasett høy ekspresjon av VDAC1 (øvre tertile) var forbundet med betydelig kortere overlevelse sammenlignet med den i den nedre tertile for VDAC1 ekspresjon, p = 0,0353, HR = 0,6639 (0,4528 til 0,9721) (figur 1A). Den gjennomsnittlige total overlevelse var 101,6 måneder hos pasienter med lavest VDAC1 tertile og 52 måneder hos pasienter med høyest VDAC1 tertile
Figur 1A. Viser Kaplan Meier plott som viser pasientens overlevelse avhengig av høy og lav VDAC1 uttrykk. Den tydelig forskjell i overlevelse er synlig tydelig med median overlevelse av høy VDAC1 uttrykker pasienter blir bare halvparten av lave uttrykker pasienter. Kurvene er vesentlig forskjellige med p = 0,0353 ved logrank test. Figur 1B: Overlevelse tomt for stadium I pasienter. Igjen forskjellen i høye og lave uttrykker prøvene er klare med lave VDAC1 pasienter som har bedre overlevelse. Den logrank test viser kurvene er vesentlig forskjellige med p = 0,0455. Stage I prøvene følger samme mønster som alle de kombinerte data fra alle ledd.
VDAC1 uttrykk er en uavhengig prognostisk faktor
For ytterligere å undersøke virkningen av VDAC1 på overlevelse, vi gjennomført ut korrelasjon og Cox regresjonsanalyse samt multivariate tester ved hjelp PASW Statistikk v.18 (SPSS: En IBM-selskap). Høy VDAC1 uttrykk viste seg å være en uavhengig prognostisk variabel for kortere overlevelse p 0,001 nivå. Trinn (p = 0,013) og Pt, (primær tumor), (p = 0,022) viste seg også å være uavhengige variabler korrelerte med overlevelse, mens multivariat analyse viste at kombinasjonen av trinn og histologi påvirker pasientens overlevelse (p = 0,027) i betydelig grad. Resultatene fra Cox regresjonsanalyse kan sees i tabell 1, hvor VDAC1 har mest betydelig innvirkning på overlevelse fulgt av PT og scene.
VDAC1 overekspresjon spår kortere tid til tilbakefall etter NSCLC reseksjon
påvirkningen av VDAC1 uttrykk på tid til tilbakefall etter kirurgisk reseksjon var av interesse som denne kliniske variable ikke er forvirret av behandling etter tilbakefall. Det er derfor en mer nøyaktig måling av prognostisk betydning. Så vi analyserte bare de tilbakefall data og univariat analyse viste VDAC1 betydelig forutsi tid til tilbakefall (p 0,001). Informasjon på histologisk subtype, kjønn og alder var tilgjengelig for alle prøver, og de ble funnet å være ikke signifikant med p-verdier av 0,35, 0,82 og 0,73 henholdsvis. Et sammendrag av denne analysen kan finnes i tabell 2. Tilsvar multivariat analyse rangert disse variablene i samme rekkefølge, med VDAC1 å være den eneste uavhengige faktoren (p 0,001).
VDAC1 overekspresjon i fase I prøvene fører til dårlig overlevelse
Informasjon på scenen var ikke tilgjengelige for alle datasettene, men vi analysert hva vi hadde tilgang til. Vi hadde 89 trinn I prøver og Kaplan-Meier plott for disse pasientene er vist i figur 1B; p = 0,0455, med en tilhørende hasardratio på 0,52 (0,1492 til 0,7653). Vi fant sammenhengen mellom VDAC1 uttrykk og overlevelse å være veldig sterk med p 0,001. Cox regresjonsanalyse i trinn 1 NSCLC, hvor adjuvant kjemoterapi ikke har vist seg å forbedre pasientens resultater [24], [25], [26], avslørte ingen variabler for å være statistisk signifikant, men, på samme måte som analysen av alle data, VDAC1 var den mest innflytelsesrike prediktor for overlevelse (p = 0,241), og ble rangert over histologi (p = 0,344), alder (p = 0,465), PT (p = 0,970), PN (nodal scenen), (p = 0,975) og kjønn (p = 0,999). Regresjonskoeffisienten for VDAC1 var 29,18 indikerer en svært dårlig prognose for pasienter med høye nivåer av VDAC1.The prøvenummer ble lav for trinn II og III med 68 prøver å være Stage II og bare 16 prøvene blir Stage III, dette gjorde det vanskelig å få tak statistisk signifikante resultater. Korrelasjonen mellom VDAC1 uttrykk og overlevelse i fase II-prøver og Stage III prøvene var ubetydelig med henholdsvis p = 0,853 og p = 0,701. Vi hadde et utilstrekkelig antall hendelser i begge trinn for å lage en nøyaktig Kaplan Meier tomt med mindre enn 10 tilfeller av dødsfall per kategori. Mangelen på høyere sceneprøver førte oss til å fokusere på resultatet fra trinn I prøver og fra de kombinerte data.
VDAC1 overekspresjon korrelerer med en konservert 6-genet signatur
For å få en innsikt i biologien som ligger under den dårlig prognose av VDAC1 overekspresjon NSCLC in vivo, ble en analyse gjennomført for å identifisere hvilke gener og nettverk er konsekvent forbundet med høy VDAC1 uttrykk. En undergruppe av 6-gener ble identifisert i VDAC1 overekspresjon NSCLC-datasett er forbundet med betydelige differensial-ekspresjon i 50% eller mer av datasettene. Disse genene var CSNK1A1, G3BP1, HNRNPC, HSPA4, HSPA9 og UBE2D2; se figur 2, hvor forskjellen i gjennomsnittlig ekspresjon av disse genene når VDAC1 er lav og høy er vist. Som definert av Gene Ontologi Consortium [27] HNRNPC, HSPA4, HSPA9 og UBE2D2 er involvert i protein ubiquitinering trasé, og CSNK1A1 regulerer EIF2 funksjon. HSPA9 er også involvert i anti-apoptose trasé mens G3BP1 er knyttet til Ras protein signaloverføring og ATP avhengig DNA og RNA helikaseaktivitet. CSNK1A1, HSPA4 og HSPA9 er knyttet til ATP bindende mens HNRNPC er involvert i RNA og nukleotid bindende. En oppsummering av GO vilkårene for disse genene kan finnes i tabell 3. HNRNPC, ble HSPA9, G3BP1 og UBE2D2 bestemmes som prognostisk individuelt når en univariat analyse ble utført på deres uttrykk nivåer og overlevelse, tilhørende p-verdier var 0,027 , 0,002, 0,02 og 0,003 kroner.
Denne figuren viser variasjonen i genuttrykk av våre differensielt uttrykte gener i prøvene hvor VDAC1 uttrykk er lav, og når det er høy. Alle de genene som samlet består vår signatur er oppregulert og så øke når VDAC1 øker.
Unsupervised analyse identifiserer VDAC1 som prognostisk og forbundet med en 6-gen signatur
Vi analyserte også dataene uten filtrering for VDAC1 uttrykk for å bekrefte VDAC1 ville bli vesentlig forskjellig uttrykt når uttrykk nivåer av levende og døde pasienter sammenlignes. Ved hjelp av denne unsupervised metoden og rangering genuttrykk i henhold til total overlevelse tid, ble VDAC1 funnet å være nedregulert i pasienter med lengre overlevelse. Tilsvarende 6-genene som er regulert ved siden VDAC1 oppførte seg på samme måte, hver av dem ble nedregulert i prøver fra pasienter som overlevde i et langt tidsrom.
6-genet signatur assosiasjon med VDAC1 overekspresjon er uavhengig av krefttype
for å bekrefte gyldigheten og potensielle biologiske relevansen av 6-genet signatur covariant med VDAC1 vi testet sin diskriminerende effekt på selvstendig brystkreft datasett. En t-test ble utført sammenligne høye og lave VDAC1 uttrykke prøver. Vi fant alle 6 gener ble oppregulert når VDAC1 var sterkt uttrykt. Tilsvarende uttrykk var lav da VDAC1 uttrykk var lav og så vår signatur av gener covariant med VDAC1 hos NSCLC data utstilt de samme uttrykk mønstre hos brystkreft data. Vi har også utført den samme testen ved hjelp av en uavhengig myelom kreft datasett, å utføre en t-test på de data som ble delt basert på VDAC1 høy og lav ekspresjon. Vi igjen fant alle de 6 gener i vår meta-signatur returnert som å være statistisk signifikant på et p 0,001 nivå. Ytterligere validering ble funnet gjennom analyse av NCI60 cellelinjer som finnes i GSE2003. Vi igjen sammenlignet prøvene basert på VDAC1 uttrykk og fant 6-genet signaturen ble konservert i åtte av disse cellelinjer, nemlig UACC62 og SK_MEL2 (melanom), SF295 og SF539 (CNS), A498 og SNC12C (nedsatt), H23 og HOP62 (NSCLC). Analyse av NCI60 data for lav VDAC1 med lav ekspresjon av 6-genet signatur identifiserte 5 cellelinjer, CCRF-CEM, RPMI-8226-og K562B (leukemi), IGROV1 (ovarie) og H522 (NSCLC).
Validering av 6-gen signatur ved hjelp av Principal Components Analysis (PCA)
PCA bidrar til å forklare variasjonen i data og er en vanlig teknikk for dimensionality reduksjon i høye dimensjonale data. Vi utførte PCA på NSCLC datasett GSE3141 og funnet ut at selv om det var noen uteliggere som bruker den første hovedkomponent, som sto for så mye av variasjonen som mulig, alle 6 av genene i vår meta-signatur var i toppen 1% basert på PC1 komponent belastninger. HNRNPC og G3BP1 utført spesielt godt blir plassert fjerde og femte på listen med henholdsvis.
Protein-Protein Interaction (PPI) Networks
Innenfor VDAC1 PPI nettverk, ved hjelp av Yu et al s [28] kategorisering , kodede proteiner ble klassifisert som enten huber (noder med høy grad verdier som utgjør sårbare områder av nettverket) og /eller flaskehalser (de med høy betweenness sentralitetsnivåer score tilsvarende nøkkel kryssende noder). VDAC1 og fire av genene, ble CSNK1A1, HSPA4, HNRNPC og UBE2D2 betraktes som både hub-flaskehalser.
Clustering identifisert mulige grupper av gener som opererer i de samme baner, prosesser eller molekylære komplekser. Fem av genene, G3BP1, UBE2D2, VDAC1, CSNK1A1 og HSPA4 tilhørte fire høy-scoring klynger, den høyest rangerte av disse inneholder både UBE2D2 og G3BP1. Funksjonell analyse viste denne gruppen til å bli mest signifikant assosiert med den SH2 domene, ATP-bindingsseter, protein og protein-tyrosin-kinase-aktivitet, autofosforylering, DNA-bindende og transkripsjonsfaktor-aktivitet. Den nest mest betydnings VDAC1 relaterte klynge inkludert HSPA4 som ble beriket i atom lumen og nukleoplasma komponenter og RNA-binding og mRNA spleise prosesser. VDAC1 selv var assosiert med en topp-scoring klynge funksjonelt beriket i reguleringen av programmert celledød, apoptose, anti-apoptose, nukleoplasma, intracellulære organelle lumen, transkripsjon faktor bindende og repressor aktiviteter. Klyngen som CSNK1A1 var medlem var forbundet med betydelig funksjonalitet i belagt pit, endomembransystemet, endocytose, endosom, innbinding og transportvirksomhet.
Korteste vei analyse avdekket en sub-nettverk av 14 gener, bestående av VDAC1 signatur gener og viktige tilknytnings partnere som TP53, RASA1, GRB2, CBL, CSK, RAF1 og KPNA2, se figur 3. Bare to av genene HNRNPC og CSNK1A1 var direkte interactors; HNRNPC er bindende evne blir modulert av CSNK1A1-mediert fosforylering.
Disse vises med mest hyppig forekommende tilgrensende gener. Korteste vei analyse avdekket en sub-nettverk av 14 gener, bestående VDAC1 og de 6 differensielt uttrykte gener assosiert med VDAC1 uttrykk. De viktigste tilgrensende partnere inkludert TP53, RASA1, GRB2, CBL, CSK, RAF1 og KPNA2. Bare HNRNPC og CSNK1A1 samhandlet direkte.
Funksjonell analyse viste beriket prosesser først og fremst knyttet til de VDAC1 målgener inkludert ATP-binding og nukleotid bindende. Både VDAC1-målet og interne korteste-bane gener i fellesskap deltatt i en rekke betydelig beriket prosesser og veier. Disse inkluderte signale prosesser (intracellulære signalkaskade, RAS protein signaltransduksjon, liten GTPase mediert signaltransduksjon), transport (nucleocytoplasmic transport, kjernekraft transport, intracellulær protein transport) og anti-apoptose.
De genene som gir interne koblinger den korteste-vei-nettverket ble betydelig anriket i signalveier, f.eks Neurotrofin, IGF-1, insulin, TPO, PDGF, EGF, Inte, T-celle-reseptor, MAPK og ERKB. Videre veier er identifisert som følger med: signalisering av hepatocytt-vekstfaktor-reseptor, transmembrane reseptor-protein-tyrosin-kinase-signalreaksjonsveien, enzymbundet reseptor-protein-signalreaksjonsveien, sprouty regulering av tyrosin-kinase-signaler og IL-2-reseptor-betakjede i T-celleaktivering
hoved~~POS=TRUNC aktivitetene til VDAC1 gener (CSNK1A1, G3BP1, HSPA4, HSPA9 og UBE2D2) ble fokusert på ATP og nucleotide bindende. Bestemt person beriket funksjonalitet også forekommet, f.eks protein kinase aktivitet og vert-virus interaksjon (assosiert med gener CSNK1A1 og VDAC1, henholdsvis).
Interessant, men mindre fremtredende innenfor PPI nettverket, to ikke-hub-ikke-flaskehals gener, HSPA9 og G3BP1, ble beriket i forskjellige sett med funksjoner. I tilfelle av G3BP1, ble signaltransduksjon markert (både små GTPase og RAS protein) i forbindelse med forbindelses gener, RAF1 og GRB2. HSPA9, i særdeleshet, var assosiert med to grupper av funksjoner: protein målretting og transport (intracellulært protein, kjernekraft og nucleocytoplasmic) i forbindelse med TP53 og KPNA2; og negativ regulering av celledød, apoptose og programmert celledød (sammen med TP53 og RASA1).
Diskusjoner
VDAC1 overekspresjon spår kortere tid til tilbakefall og total overlevelse for NSCLC som dokumentert fra samle genet uttrykk analyse. Det er en uavhengig prognostisk faktor som dokumentert fra Cox regresjonsanalyse og spår overlevelse i fase en sykdom, hvor subgruppe analyse av randomiserte kontrollerte kliniske studier av adjuvant kjemoterapi har ikke klart å vise klinisk nytte [24], [25], [26]. En kombinert genuttrykk dataanalyse tilnærming har blitt ansatt for å undersøke effekten av VDAC1 uttrykk på overlevelse, som var statistisk signifikant i alle enkelt datasett undersøkt.
Flere nyere studier som analyserer microarray data for prognostiske markører i NSCLC har produsert inkonsekvent resultatene [29]. Den tydelig mangel på overlapp forbundet mellom disse signaturene gjenspeiler ustabilitet og er knyttet til små utvalgsstørrelser med mindre enn 200 prøver som brukes per undersøkelse. Analyse av flere datasett, for eksempel kombinert analyse av microarray gene expression datasett adressering lignende biologiske spørsmål gjennomført på et fortolkningsnivå ved meta-analyse, kan aktivere mer nøyaktige resultater. Mange studier foreslår metoder for meta-analyse av microarray data med sikte på å identifisere vesentlig forskjellig uttrykte gener på tvers av studier ved hjelp av statistiske teknikker som unngår den direkte sammenligning av genuttrykk verdier [30]. Evalueringen av flere datasett som anvendes i dette studium har vist seg å gi mer pålitelige og gyldige resultater, fordi de er basert på store prøvenumrene og den individuelle skjevhet som skyldes hver studie er svekket [30].
Det er ikke kjent hvorfor VDAC1 korrelerer med dårlig overlevelse utfall. For å forstå de mest relevante genetiske trekk VDAC1 overekspresjon NSCLC, gjennomførte vi en genekspresjon meta-analyse [31], [32] for å identifisere en undergruppe av gener (signatur) som var betydelig beriket. Vi anvendte strenge statistiske kriterier, kombinert med en stor prøvestørrelse for å støtte identifikasjon av disse VDAC1-covariant gener. VDAC1 og seks genet signatur ble deretter validert på tvers av bryst, myelom og NCI-60 datasett [33], som tyder på anrikning av gener som var uavhengig av hvilken type kreft.
Interessant nok av de 6 genene er identifisert som å være konservert og betydelig forskjellig regulert i høy VDAC1 uttrykker gruppe, de fleste var funksjonelt knyttet til regulering av protein omsetning. Disse genene inkludert heat shock 70kDa protein 4 (HSPA4), ubiquitin-konjugering enzym E2D 2 (UBE2D2), og heat shock 70kDa protein 9 (mortalin /HSPA9), som koder for en glukose regulert 75 kDa protein tidligere rapportert som korrelerer med dårlig overlevelse i kolorektal kreft [34]. HSPA9 også binder og inaktiverer villtype p53 [35], og regulerer RAS RAF MEK vei [36]. Tilsvarende p53 og RAS er mål for GTPase aktivere protein (SH3 domene) bindende protein 1 (G3BP1) [37], og vist å forutsi kortere overlevelse i spiserørskreft [38]. Kasein kinase 1, alfa 1 (CSNK1A1) regulerer protein omsetning via initiering av oversettelse via EIF2 og deltar i Wnt signal; en homolog CSKNK2A1 tidligere er blitt identifisert som en uavhengig prediktor for overlevelse i squamous celle lungekreft [39]. Som G3BP1 er heterogene kjernefysiske ribonucleoprotein C (C1 /C2) eller HNRNPC involvert i RNA bindende og transkripsjon [40].
PPI nettverk identifisert som de viktigste samlede virksomheten til de VDAC1 gener (CSNK1A1, G3BP1, HSPA4 , HSPA9 og UBE2D2) ble fokusert på ATP og nucleotide bindende. Bestemt person beriket funksjonalitet også forekommet, f.eks protein-kinase-aktivitet og vert-virus interaksjon (assosiert med gener CSNK1A1 og VDAC1, henholdsvis). Interessant, men mindre fremtredende innenfor PPI nettverket, to ikke-hub-ikke-flaskehals gener, HSPA9 og G3BP1, ble beriket i forskjellige sett med funksjoner. I tilfelle av G3BP1, ble signaltransduksjon markert (både små GTPase og RAS protein) i forbindelse med forbindelses gener, RAF1 og GRB2. HSPA9, i særdeleshet, var assosiert med to grupper av funksjoner: protein målretting og transport (intracellulært protein, kjernekraft og nucleocytoplasmic) i forbindelse med TP53 og KPNA2; og negativ regulering apoptose (sammen med TP53 og RASA1).
Konklusjoner
I sammendraget, basert på dårlig prognose forbundet med overekspresjon av VDAC1 og tilhørende 6-genet signatur, metoder for å målrette dette molekylær underklasse av NSCLC kan være effektive i å forbedre overlevelse utfall etter operasjonen. Vi har identifisert cellelinjer som har oppregulering av 6-genet signatur som finnes i VDAC1 overekspresjon NSCLC. Pågående arbeid tar sikte på å målrette denne signaturen for å bestemme effekter på celle levedyktighet utnytte kartet tilkobling. Vi foreslår at regulerer uttrykket av VDAC1 og /eller gener med den 6-genet signatur, kan gi en ny terapeutisk strategi for målretting fattige pasienter risiko med NSCLC.
Materialer og metoder
Gene uttrykk datasett
for å gjennomføre genekspresjon meta-analyse, et bibliotek av 8 NSCLC genuttrykk datasett ble kuratert fra NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) [41]: GSE8894, GSE3141 (matrise Type: HG-U133 Plus2.0 ), GSE6253, GSE4573 (matrise Type: HG-U133A), GSE6253 (matrise Type: HG-U133B), GSE6253 (matrise Type: HG-U95Av2), GSE4716 (matrise Type: GeneFilter Menneskelig Microarray Slipp II) og GSE5123 (matrise typen : PC Menneskelig Operon v 2 21k). De hadde 602 prøver i total og inneholdt genuttrykk informasjon om primært resected tumorprøver som hadde fått noen tidligere behandling. De ble pre-behandlet ved hjelp av R [42] og Bioconductor [43]. Normalisering ble utført ved hjelp av RMA algoritme [44] som gjennomføres i Bioconductor. Data ble grunn to log-transformerte der det er aktuelt. Sammen med genuttrykk målinger, var det også opptak av pasientinformasjon, inkludert alder, kjønn, histologi og total overlevelse tid, og i noen tilfeller scene, gjentakelse overlevelsestid, tumorstadium (PT) og nodal scenen (PN) ble også registrert . Genene som ble funnet å være signifikant forskjellig uttrykt i NSCLC datasett ble deretter validert i uavhengige brystkreft datasett hentet fra GEO: GSE6434 inneholder HG-U95Av2 array-data fra 24 pasienter som hadde fått kjemoterapi og GSE2034 med HG-U133A tabellens data fra 286 prøver. Vi testet også meta-signatur i en myelom datasett (GSE2658) med HG-U133 Plus2.0 tabellens data fra 559 pasienter som hadde fått kjemoterapi. Ytterligere validering ble funnet gjennom analyse av NCI60 cellelinje panel (GSE2003) var vi sjekket genuttrykk matchet hva vi fant i vår undergruppe av betydelige gener. I tillegg sjekket vi våre resultater ved å gjennomføre hovedkomponentanalyse på dataene i GSE3141.
Univariat og multivariat overlevelsesanalyse
Fordelingen av VDAC1 uttrykk ble delt inn tertiles for hvert datasett, tilsvarende lav, middels og høy. Kaplan-Meier-kurver ble plottet ved hjelp av Prism (GraphPad Software, San Diego California USA, www.graphpad.com) basert på overlevelsesdata, sammenligner den høyeste versus laveste tertile for VDAC1, først disse tomter ble produsert for alle data, og da bare for scenen I. Hazard ratio sammenligne lave og høye VDAC1 uttrykke prøvene ble beregnet. Vi har gjennomført korrelasjonsanalyse mellom VDAC1 uttrykk og overlevelse tid ved hjelp av Spearman Rank korrelasjonskoeffisient. Vi har også utført univariat og multivariat analyse ved hjelp av PASW (SPSS: En IBM-selskap), ble tilbakefall og total overlevelse brukt som kliniske endepunkter å vurdere prognostiske betydningen av VDAC1; den logrank forholdet ble ansett som vesentlig dersom p 0,05. Cox multivariat analyse ble anvendt for å bestemme hvorvidt VDAC1 er en uavhengig prognostisk variabel i forhold til 7 kliniske variabler:. Alder, kjønn, scene, histologi, tumorstørrelsen (PT), nodal trinn (pn) og overlevelse
tilsyn microarray meta-analyse
Vi vedtok metoden kalles metaanalyse av mikromatriser å finne ut hva gener ble regulert sammen VDAC1 [45]. Hvert datasett ble inndelt etter VDAC1 uttrykk i tertiles; vi sammenlignet de øverste og nederste VDAC1 tertiles prøver, ved hjelp TMeV [46]. Hvert gen ble vurdert for ulik uttrykk ved hjelp av en to klasse t-test for hvert datasett med klasse 1 er lav VDAC1 uttrykk og klasse 2, høy VDAC1 uttrykk. Bonferroni korreksjon ble også brukt, og denne analysen ble utført på alle de 8 datasett. Bonferroni korreksjon bidrar til å redusere sannsynligheten for å generere falske positiver. Antallet prober er enormt med noen datasett som inneholder mer enn 54 000, så for å redusere våre betydelige genene til en overkommelig liste per datasett vi brukte en strengere cut off kriterier hvor et gen ble merket som signifikant forskjellig uttrykt hvis t-test returnert ap verdi på mindre enn 0,001. De samme hypoteser ble testet i hvert datasett NSCLC uavhengig av hverandre, f.eks gener uttrykt forskjellig basert på VDAC1 uttrykk. For å aktivere flere hypotesetesting, vi brukte en metode som sammen statistiske mål og Q-verdier (beregnet falske funnrate) beregnes uavhengig av hverandre datasett [32], [47], hvor
Hvor p er sannsynligheten, n er det totale antall gener og i er den sorterte rang av den p-verdi. Den strenge p-verdi cut-off vi brukt ble overført da Q-verdier ble beregnet. Etter rangering av vesentlig forskjellig uttrykte gener basert på deres Q verdi en retning og betydning terskelen til Q 0,10 ble satt til å definere differensial uttrykk signaturer fra den allerede beregnet differensial uttrykk analyse. Etter å ha fått en ordnet liste med forskjellig uttrykt gener for hvert datasett gener ble deretter filtreres basert på antall datasett der de ble forskjellig uttrykt .. Genene som ble definert som å være vesentlig forskjellig uttrykt ble deretter validert i uavhengige brystkreft datasett (GSE6434 og GSE2034) hentet fra GEO med 24 og 286 prøver hhv. Vi testet også meta-signatur i en myelom datasett (GSE2658) med 559 prøver. T-tester ble utført på denne ekstra data; Vi sammenlignet med høy og lav VDAC1 uttrykker prøver for å bestemme om genene fra vårt signatur ble identifisert nok en gang. Den samme fremgangsmåte ble brukt på NCI60 cellelinjer for å identifisere cellelinjer som ekspresjonsnivåer passet vår signatur.
Protein-protein interaksjon nettverksanalyse
Ved hjelp av VDAC1 og de seks tilhørende SDE gener som frø sammen med deres samspill funnet i human Protein Referanse Database (HPRD) [48], ble en forelder PPI nettverket (inkludert rekursive interaksjoner) laget ved hjelp av en in-house Java-basert program. Ved hjelp av disse frø proteiner som den første dybde (nivå 0), ble senere dybder oppnådd ved bruk av snøball prøvetaking. Den resulterende forelder PPI nettverk (9,266 genet noder, 38800) ble så så, manipulert og analysert i Cytoscape [49]. Bruke Network Analyzer plug-in [50] genet noder ble deretter identifisert som enten huber eller flaskehalser ved hjelp av klassifiseringen av Yu et al [28];
