Abstract
Som den sentrale protein av dobbelttrådbrudd (DSB) indusert DNA reparasjon vei,
NBS1
deltar i detektere DSB sin og spiller en viktig rolle i å opprettholde genomisk stabilitet. Enkeltnukleotidpolymorfi (SNPs) i
NBS1
genet ble oftest testet som er knyttet til mottakelighet for flere kreftformer, men resultatene forble kontroversielt. Derfor gjennomførte vi to uavhengige sykehusbaserte case-control studier som omfatter 1072 pasienter med kolorektal kreft og 1,263 kontroller for å vurdere sammenhengen mellom fire
NBS1
SNPs og tykktarmskreft. Resultatet viste at rs2735383C /G polymorfisme i 3′-utranslaterte område (UTR) av
NBS1
var signifikant assosiert med risiko for tykktarmskreft ved hjelp av logistisk regresjon (
P
10
-4). Videre observerte vi at rs2735383CC genotype var forbundet med betydelig økt risiko for tykktarmskreft (odds ratio = 1,55, 95% konfidensintervall = 1,27 til 1,94), sammenlignet med de rs2735383GC + GG genotyper. Videre funksjonelle eksperimenter viste at rs2735383C allel i
NBS1
forstyrret bindende affinitet har-MIR-509-5p til
NBS1
3′-UTR i kolorektal kreftceller, påvirker
NBS1
transkripsjonen aktivitet og uttrykk nivå. Som konklusjon, viser nåværende bevis for at rs2735383C /G polymorfisme kan bidra til risikoen for kolorektal kreft
relasjon:. Li J-T, Zhong B-Y, Xu H-H, Qiao S-Y, Wang G, Huang J, et al. (2015) Sammenhenger mellom
NBS1
Polymorfisme og tykktarmskreft i kinesiske befolkningen. PLoS ONE 10 (7): e0132332. doi: 10,1371 /journal.pone.0132332
Redaktør: Yifeng Zhou, Medical College of Suzhouuniversitetet, KINA
mottatt: 5 mai 2015; Godkjent: 14 juni 2015; Publisert: 17.07.2015
Copyright: © 2015 Li et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dr. Hong-Chuan Zhao mottatt midler fra National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2014AA020801), International Science Technology Cooperation Program of China (No.2013DFA31510) og Forskningsfondet av Beijing Municipal Science Technology Commission (nr Z111107067311021); Dr. Hui-Zhen Fan ble støttet av Natural Science Foundation National of China (nr 81360606). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er en av de vanligste kreftformer ledende årsak til kreft dødsfall over hele verden [1]. I det siste tiåret, har store anstrengelser vært fokusert på utvikling av nye behandlingsmetoder og diagnostiske teknologier, derimot, er forekomsten og dødeligheten betydelig heving i en asiatisk befolkning [2, 3]. I tillegg til miljørisikofaktorer og livsstil vaner [4, 5], genetiske forandringer inkludert enkeltnukleotidpolymorfi (SNPs) i kandidatgener som er involvert i DNA reparasjon vei har vært innblandet i kolorektal kreftutvikling [6-9].
DNA reparasjon pathways spille en nøkkelrolle i å opprettholde genomisk integritet og hindre cellene mot kreft [10]. I motsetning til dette, er det blitt klart at mangler av DNA-dobbeltstrengbrudd (DSB) reparasjon av kreftfremkallende, kan føre til genomiske ustabilitet, og følgelig er korrelert med utviklingen av kreft [11]. To DNA reparasjon trasé omfatter homolog rekombinasjon reparasjon (HR) og ikke-homologe end-sammenføyning (NHEJ) involvert i menneskeceller føre til skade reparasjon ved å rekruttere spesifikke DNA reparasjon molekyler til området for skade [12-14]. Rekrutteringen av kjernefysisk protein kinase ataksi telangiectasia mutert (ATM) til DNA DSB sin regnes som den kritiske trinn i begge baner i sin aktivering og funksjon. Men det har blitt anerkjent som ATM rekrutteringen til områder av DSB sin nødvendige og ble tilrettelagt av spesifikke partnerproteiner meiotisk rekombinasjon 11 homolog (MRE11), menneskelig RAD50 homologe (RAD50) og Nijmegen brudd syndrom 1 (NBS1) [15]. Som en sentral aktør i MRN komplekse, NBS1 samhandler direkte med H2AX å danne atom foci i områder av DNA-skader og utløser de påfølgende trinnene i DNA skader tidlig respons [15, 16]. I tillegg
NBS1
spiller viktige roller i monteringen av MRN komplekser og dirigerer MRN komplekser koordinere DSB sin til behandling og reparere [17, 18]. Derfor genetiske varianter i
NBS1
genet kan modulere DNA-reparasjon kapasitet, og påvirke tilbøyelighet til å forårsake kreft. Samler studier har undersøkt sammenhengen mellom vanlige polymorfismer i
NBS1 Hotell og kreft hos mennesker risikerer [19-22]. For eksempel, en av de mest studerte polymorfismer rs1805794G /C er blitt undersøkt i forbindelse med den følsomhet for flere krefttyper [22-24]. Videre SNP’er rs2735383C /G i det 3′-UTR av
NBS1
kan påvirke bindingsevnen av microRNAs, og dermed kan påvirke genets ekspresjon [22, 23]. Imidlertid har begrenset informasjon er rapportert om sammenhenger mellom disse vanlige
NBS1
polymorfismer og risiko for CRC i kinesiske befolkningen. Derfor har vi en hypotese om at vanlige polymorfismer av
NBS1
genet kan assosiere med risiko for CRC.
Basert på disse hypotesene, utførte vi to sykehusbaserte case-control studier for å vurdere mulige innflytelse over vanlige polymorfismer (rs1805794G /C, 31129G /A, 924T /C og rs2735383C /G) på CRC risiko i kinesiske befolkningen.
Materialer og metoder
forsøkspersonene
Alle personene var genetisk urelaterte etnisk homogene Han-kinesere, og kvalifiserte deltakerne var 21-90 år ved rekruttering i løpet av studieperioden. For oppdagelsen sett, totalt 763 pasienter diagnostisert CRC og 892 kontroller frekvens tilpasset de tilfeller med hensyn til alder (± 5 år), kjønn og boligområde ble fortløpende rekruttert fra Folkets sykehus i Yichun City (Yichun, Kina) og Kina-Japan Friendship Hospital (Beijing, Kina). For validering, 313 CRC pasienter og 371 kontroller frekvens tilpasset de tilfeller med hensyn til alder (± 2 år), kjønn og boligområde ble fortløpende registrert fra Kina-Japan Friendship Hospital (Beijing, Kina). Blant kvalifiserte deltakere, rekruttering prisene var ca 95% for pasienter og ca 81% for kontroller. Alle pasientene hadde ikke mottatt kjemoterapi eller strålebehandling, og det var ingen alder, scene, eller histologi restriksjoner. Tumor iscenesettelse og patologisk typen ble evaluert i henhold til 2002 amerikanske Joint Committee on Cancer staging system. Deltakelsen for kontrollene var 89%. De kliniske kjennetegn ved alle pasienter og kontroller av oppdagelsen sett og validering sett er oppført i tabell 1. Ved rekruttering, ble hver deltaker planlagt for et intervju med en epidemiologisk spørreundersøkelse etter å ha gitt et skriftlig informert samtykke og gitt om 5 ml blodprøve for DNA-analyse . Den epidemiologiske Spørreskjemaet inneholdt demografiske data, detaljert informasjon om røyking og alkoholbruk, familiehistorie med kreft og så videre. Denne studien ble godkjent av Medical Ethics Committee of Folkets sykehus i Yichun City og medisinsk etikk-komiteen i Kina-Japan Friendship Hospital i Beijing City.
Genotyping analyse
Basert på muligheten for funksjonell endring av
NBS1
SNPs i genomet sammenheng, fire
NBS1
SNPs (924T /C i 5′-UTR, rs1805794G /C i ekson 5, 31129G /A i ekson 10 og rs2735383C /G i 3′-UTR) som tidligere rapportert i forhold til sykdoms resultater, inkludert kreft ble utvalgt og analysert for [22, 25]. Genomisk DNA ble isolert fra perifere blodprøver for hver studiefaget bruker Blood Genome DNA Extraction Kit (Takara, Dalian, Kina). Disse fire
NBS1
SNPs ble genotypet ved allel-spesifikk MALDI-TOF massespektrometri (Sequenom, San Diego, CA) som beskrevet før [26, 27] uten kunnskap om fagene status. Også for å bekrefte genotyping resultatene fra massespektrometrisk analyse, vi tilfeldig valgt 100 prøver for direkte sekvensering, og resultatet var 100% konkordant.
Byggingen av reporter plasmider
Siden en signifikant sammenheng det ble observert for polymorfisme rs2735383C /G og CRC risiko, ble to plasmider inneholdende reporter rs2735383G eller rs2735383C allelet konstruert for å evaluere effekten av denne polymorfisme på sin genekspresjon
in vitro
. The full-lengde av menneskelig
NBS1
3′-UTR flankerer SNP rs2735383 polymorfisme ble syntetisert ved Genewiz selskapet og ble deretter klonet inn i psi-CHECK2 enkel vektor (fig 1A). De to resulterende konstruksjoner psi-CHECK2-
NBS1
-rs2735383C og psi-CHECK2-
NBS1
-rs2735383G ble alle gjen sekvensert for å bekrefte sekvensen og integriteten til hver konstruere sin innsatser.
luciferase aktiviteten i rs2735383 variant allel på luciferase reporter peiling
NBS1
3′-UTR kotransfektert med eller uten HSA-MIR-509-5p etterligner eller HSA-MIR-509-5p hemmere i HCT116-celler (A) og HT-29-celler (B). Renilla luciferaseaktivitet ble målt og normalisert til ildflueluciferase. Seks replikater ble utført for hver gruppe, og forsøket ble gjentatt minst tre ganger. Dataene er gjennomsnitt ± standardfeil av middelverdien; **
P
0,01. (C)
NBS1
mRNA uttrykk nivå i tumor vevsprøver fra kolorektal kreft personer med forskjellig rs2735383 variant alleler genotype (11 rs2735383GG, 13 rs2735383GC og 5 rs2735383CC); data er gjennomsnitt ± standardfeil av gjennomsnittet, normalisert til
GAPDH
,
P
= 0,027. (D) HSA-MIR-509-5p mRNA uttrykk i 29 kolorektal kreft vev gruppert etter rs2735383 C /G genotyper. HSA-MIR-509-5p mRNA uttrykk ble beregnet i forhold til uttrykk for
U6
mRNA. Data er gjennomsnitts ± standard feil av gjennomsnittet,
P
= 0,345.
Forbigående transfections og luciferase analysene
Fordi avgjørende rolle 3′-UTR i gen, spådde vi rs2735383C /G polymorfisme i 3′-UTR av vår bioinformatikk analyse (https://snpinfo.niehs.nih.gov/). Resultatet viste at konverteringen fra C til G i 3′-UTR rs2735383 polymorfisme forårsake nye bindingssetet av mikroRNA HSA-MIR-629, har-MIR-499-5p, og har-MIR-509-5p. For transient transfeksjon analysen, human kolorektal cellelinjer, nemlig HCT116 og HT-29 ble sådd ut på en 10 x
5 celler pr brønn i 24-brønners plater (BD Biosciences, Bedford, MA). Luciferase-analyser ble utført som tidligere beskrevet [28]. For luciferase aktivitet analyse, 800ng psi-CHECK2-
NBS1
-3′-UTR vektorer ble transfektert med 40pmol mikroRNA ligner (HSA-MIR-629, HSA-MIR-499-5p og HSA-MIR-509 -5p) og med eller uten 40pmol hemmere av Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, California) i henhold til produsentens instruksjoner. Etter transfeksjon i 24 timer, ble cellene samlet og Renilla luciferaseaktivitet ble målt med Dual-luciferase reporter Assay System (Promega, Madison, WI) (Promega). Tre uavhengige forsøk ble gjort for hvert plasmid konstruksjon.
Kvantitativ Real-Time PCR (QRT-PCR)
29 CRC vev med ulike rs2735383 genotyper ble utsatt for å undersøke sammenhengen mellom
NBS1
mRNA nivåer og rs2735383C /G polymorfisme. Totalt RNA ble isolert ved anvendelse av Trizol reagens (Invitrogen Inc., USA) og er speilvendt transkribert til cDNA ved anvendelse av oligo-dT primer. Vi gjennomførte ABI Prism 7500 sekvens deteksjonssystem for å evaluere
NBS1 Hotell og
GAPDH
mRNA nivåer basert på SYBR-grønne metode. Den sistnevnte ble anvendt som en indre kontroll og kvantitativ
NBS1
ekspresjonsnivået ble normalisert til
GAPDH
. Den TaqMan mikroRNA Analyser (Applied Biosystems) ble brukt til å påvise HSA-MIR-509-5p uttrykk i henhold til produsentens protokoll og universelt uttrykt
U6
liten kjernefysiske RNA ble brukt for en intern kontroll.
Statistical Analysis
forskjellene i frekvensfordeling av utvalgte demografiske variabler samt rs2735383C /G-allelet og genotyper mellom saker og kontroller ble vurdert av chi-kvadrat tester. Hardy-Weinberg likevekt (HWE) av de kreftfrie kontroller genotype distribusjoner ble testet av en godhet-of-fit chi-kvadrat test. Styrken i sammenhengen mellom rs2735383C /G polymorfisme og CRC kreftrisiko ble estimert ved odds ratio (ORS) med 95% konfidensintervall (CIS) bruker ubetinget logistisk regresjon og justert for alder og kjønn. Konsernets sammenligning ble analysert av t-test (tosidig). Stratifisert analyse ble også utført av undergrupper av alder, kjønn eller andre kjennetegn (røykestatus, alkohol drikking status, BMI, scene og slektshistorie) for å evaluere stratum variable relaterte ORS blant
NBS1
genotyper. Enveis ANOVA ble brukt for å vurdere forskjellene i luciferaserapportørplasmid aktivitet og effekten av rs2735383C /G på
NBS1
uttrykk blant CRC pasienter. Den statistiske styrken ble beregnet ved å bruke PS-programvaren (https://biostat.mc.vanderbilt.edu/twiki/bin/view/Main/PowerSampleSize). Alle testene var tosidige ved hjelp av SAS (versjon 9.1, SAS Institute, Cary, NC). Statistisk signifikant nivå ble definert som
P
. 0,05
Resultater
genotyper og CRC risiko
I studien genotypet vi fire vanlige polymorfismer ( rs1805794G /C, 31129G /A, 924T /C og rs2735383C /G) av
NBS1
genet i 1076 CRC pasienter og 1263 friske kontroller. Genotypefrekvensene av disse polymorfismene i kontrollene var i samsvar med den HWE (
P
0,05 for alle). Genotypen distribusjoner av
NBS1
polymorfismer av tilfellene og kontrollene i oppdagelsen og validering sett er presentert i tabell 2. Det ble observert en signifikant sammenheng med CRC risiko for rs2735383C /G, men ikke for andre polymorfismer i to populasjoner (
P
10
-4 for rs2735383C /G i oppdagelsen sett og
P
= 0,039 for rs2735383C /G i valideringssettet). Som vist i tabell 2, personer med rs2735383CC genotyper var statistisk signifikant høyere risiko enn de bærere med rs2735383GG + GC genotyper (justert OR = 1,52; 95% CI = 1,20 til 1,99,
P
10
-4 for oppdagelsen satt og justert OR = 1,60; 95% CI = 1,11 til 2,37,
P
= 0,025 for valideringssettet). Videre ble det observert signifikant sammenheng mellom rs2735383 polymorfismer og CRC risiko når kombinert de to populasjoner (
P
10
-4).
Vi videre utført stratifiseringsfaktorer analyser å evaluere effektene av rs2735383C /G genotyper på CRC risiko i henhold til alder, kjønn, røykestatus, alkoholforbruk og familiens historie av kreft i oppdagelsen sett. Som vist i tabell 3, en betydelig økt risiko for CRC forbundet med polymorfisme var mer uttalt blant undergrupper av drikker. Sammenlignet med rs2735383GG og GC genotyper, viste CC genotype en 2,2 ganger høyere risiko for CRC i drinkers (OR = 1,70, 95% CI = 1,51 til 2,88,
P
= 0,004). Men det var ingen statistisk forskjell mellom fordelingene av andre utvalgte variabler og CRC risiko.
Effekt av
NBS1
rs2735383C /G polymorfisme på transkripsjonen aktivitet
Vi konstruerte luciferaserapportørplasmid vektorer ved hjelp av psi-CHECK2 vektor med enten rs2735383C eller rs2735383G allel og transfektere forbigående HCT116 og HT-29 celler med HSA-MIR-629, HSA-MIR-499-5p, og HSA-MIR-509- 5p, respektivt. Vi undersøkte om mikroRNA har et allel-spesifikk effekt på
NBS1
uttrykk i CRC celler. Resultatet viste at CRC celler forbigående kotransfektert HSA-Mir-509 etterligner og vektorer som inneholder rs2735383C allelet betydelig redusert luciferase aktivitet, sammenlignet med celler vektorer som inneholder rs2735383G allelet (
P
0,05 i HCT116-celler og HT-29-celler, fig 1B). Men ingen signifikant forskjell ble funnet mellom denne polymorfisme og transkripsjon aktivitet med HSA-MIR-629 og HSA-MIR-499-5p i CRC celler. Disse data indikerte at rs2735383C /G kan påvirke transkripsjon av
NBS1
ved å påvirke bindingssetet av mikroRNA til
NBS1
3′-UTR.
Association of rs2735383C /G polymorfisme med
NBS1
mRNA uttrykk
Vi videre undersøkt
NBS1
uttrykk i 29 CRC vev med forskjellig rs2735383C /G genotyper av QRT-PCR. Som vist i figur 1C, fant vi at pasienter med rs2735383CC homozygot genotype hadde signifikant lavere
NBS1
mRNA nivåer (gjennomsnitt ± standard feil: 0,161 ± 0,037) enn pasienter med GC (0,363 ± 0,047) eller GG ( 0,400 ± 0,050, ANOVA test:
P
= 0,026) genotyper. I tillegg QRT-PCR ble videre brukt til å undersøke hvorvidt HSA-MIR-509-5p er konstitutivt uttrykt i CRC vevsprøver. Som vist i figur 1D, ble HSA-MIR-509-5p konstitutivt uttrykt i CRC vev; mens det var ingen signifikant sammenheng mellom bakgrunnen uttrykk for HSA-MIR-509-5p og
NBS1
rs2735383C /G genotyper i tumorvev samlet inn fra CRC pasienter (
P
= 0,345).
Diskusjoner
CRC kreftutvikling er multifaktoriell. Ikke bare miljømessige risikofaktorer, men også genetiske faktorer kan spille en viktig rolle i etiologien av CRC. I denne sykehusbasert case-control studie undersøkte vi rollen som fire vanlige
NBS1
SNPs i mottakelighet for CRC i kinesiske populasjoner. Vi fant ut at HSA-MIR-509-5p kunne binde fast til 3′-UTR av
NBS1
inneholder rs2735383C allelet, negativt regulere nivået av
NBS1
. Videre i følgende stratifiserte analyser, det viste seg at en høy risiko effekt av dette polymorphism var spesielt tydelig blant undergrupper av drinkers.
NBS1
er en viktig regulator som deltar i DSB reparasjon ved å dirigere den MRN proteinkomplekset til områder av DNA-skade og stimulere dens DNA-bindende og nukleaseaktivitet. De viktigste funksjonelle domener av
NBS1
i DNA-skader responser som omfatter den konserverte gaffelhode-forbundet (FHA) domene og brystkreft karboksyterminale (BRCT) domene, som er viktig i den anerkjennelse og reparasjon av avvikende DNA [ ,,,0],29-31]. Mange rapporter har fremhevet den potensielt avgjørende rolle
NBS1
, en viktig del av MRN komplekse, opprettholde genomisk stabilitet og hindre tumorigene prosesser ved å rekruttere reparasjon og sjekkpunkt proteiner i løpet av de DNA pauser [32, 33]. Dermed mutasjonene av
NBS1
kan påvirke funksjonen til
NBS1 Hotell og protein-protein interaksjon, og ytterligere trolig øke mottakelighet for kreft. Som en av de mest undersøkte polymorfismer er rs1805794G /C som ligger i BRCT domene og påvirke dannelsen av en BRCA1-assosiert genomet overvåking kompleks (BASC) selv om binding til BRCA1, som er ansvarlig for å detektere og reparasjon av avvikende DNA-konstruksjoner [ ,,,0],29]. Flere linjer av studier har undersøkt assosiasjonen mellom polymorfisme og flere cancere [22, 34-37]. Imidlertid er sammenhengen mellom
NBS1
rs1805794G /C-variant genotyper og kreftrisiko ikke accordant i ulike kreftformer og etnisk gruppe. For eksempel fant P. Widlak at rs1805794 variant genotyper ikke var assosiert med mottakelighet for CRC i en polsk befolkning [37]. Tilsvarende våre nåværende resultatene er i samsvar med ovennevnte studien at polymorfisme rs1805794G /C ikke er forbundet med risiko for CRC i kinesiske befolkningen.
Så vidt vi vet,
NBS1
31129G /A og 924T /C inkludert i vår studie har sjelden blitt undersøkt i humane tumorer [22, 25]. Og vi ikke observere forholdet mellom disse to SNPs og CRC risiko. Som for rs2735383C /G polymorfisme, det ligger i 3′-UTR av
NBS1
genet. Flere studier har undersøkt rs2735383C /G polymorfisme med kreft mottakelighet. En meta-analyse basert på tretten utvalgte studier, inkludert 7561 tilfeller og 8432 kontrollpersoner undersøkt at ingen signifikant sammenheng ble funnet mellom polymorfismer i
NBS1
genet og blærekreft [38, 39], brystkreft [40], lymfoide maligniteter [41]. Nylig er det blitt postulert at de ovennevnte polymorfisme rs2735383C /G kan bidra til utvikling av lungekreft. Mer interessant, en annen kinesisk studie blant 575 lungekreft tilfeller og 575 kontroller rapportert at rs2735383C /G polymorfi ikke var assosiert med mottakelighet for lungekreft [42]. I vår studie ble rs2735383C /G polymorfisme signifikant assosiert med CRC risiko. Ytterligere fordeling analyser viste at den økte risikoen variant allel var mer uttalt hos drikking status. Videre funksjonsanalyse viste at nukleotidsubstitusjoner fra G til C forårsake nye bindingssetet av mikroRNA HSA-MIR-509-5p og dermed påvirke transkripsjonen aktivitet av
NBS1
i
vitro
, som er i samsvar med tidligere funn [24]. Samlet utgjør disse funnene tyder på at dynormal uttrykk for
NBS1
som følge av de genetiske varianter i
NBS1
dermed påvirke NBS1 protein og andre reparert proteiner samhandle i DNA reparasjonsprosesser, og dermed kan modulere CRC mottakelighet.
Dette er den første studien som vi grundig undersøkt sammenhengen mellom
NBS1
SNPs og risiko for CRC. Vi hadde en ganske stor utvalgsstørrelsen for case-control studie. Videre at genotypefrekvensene blant kontrollene passer Hardy-Weinberg disequilibrium lov foreslo tilfeldigheten av faget valg. Og vi har oppnådd en 91% studie kraft (tosidige test, α = 0,05) for å detektere en OR på 1,52 for de rs2735383CC genotyper (som forekom ved en frekvens på 16,14% i kontrollene) sammenlignet med de rs2735383GC + GG genotyper i oppdagelsen, noe som kan ha forbedret nevneverdig av våre funn.
i konklusjonen, antyder studien at polymorfisme rs2735383C /G i
NBS1
genet kan være en genetisk disposisjon faktor for risikoen av CRC i kinesiske befolkningen. Videre vil våre funn krever større case-control studier og veldesignede mekanistiske studier for å bekrefte.
