Abstract
Bakgrunn
LGR5 (leucine-rik gjenta holdig G- proteinkoblet reseptor 5) er den mest etablerte markør for tarm stamceller. Musemodeller viser at LGR5 + celler er celler av opprinnelse tarmkreft, og LGR5 uttrykk er forhøyet i menneskelige kolorektal kreft, men svært lite er kjent om LGR5 funksjon eller dens bidrag til stamcelle fenotype og tykktarmskreft.
hovedfunnene
Vi har modulert uttrykk for LGR5 av RNAi (hemmende RNA) eller overekspresjon i kolorektal kreft cellelinjer. Paradoksalt ablasjon av LGR5 induserer økt invasjon og forankringsuavhengig vekst, og forbedrer tumourigenicity i xenoimplantater eksperimenter. Motsatt, overekspresjon av LGR5 forsterker celle adhesjon, reduserer clonogenicity og demper tumourigenicity. Expression profilering avslørt forbedret wnt signalering og oppregulering av EMT gener på knockdown av LGR5, med motsatte endringer i LGR5 overekspresjon celler. Disse funnene tyder på at LGR5 er viktig i å begrense stamceller til sin nisje, og at tap av LGR5 samtidig med aktivert wnt signale kan bidra til invasiv fenotype av kolorektal karsinom
Citation:. Walker F, Zhang HH, Odorizzi A, Burgess AW (2011) LGR5 er en negativ regulator av Tumourigenicity, fiendskap Wnt Signale og regulerer celle adhesjon i tykktarmskreft cellelinjer. PLoS ONE 6 (7): e22733. doi: 10,1371 /journal.pone.0022733
Redaktør: Pierre-Antoine Defossez, Université Paris-Diderot, Frankrike
mottatt: 03.02.2011; Godkjent: 04.07.2011; Publisert: 28.07.2011
Copyright: © 2011 Walker et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette prosjektet ble delvis finansiert av NHMRC Program Grant nummer 487922. Funding støtte for AO ble også levert av Pezcoller Foundation, Trento, Italia. Dette arbeidet ble også støttet av Operational Infrastructure Support Program levert av viktorianske regjeringen. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
begrepet kreftstamceller (cscs: anmeldt etter [1]) oppstår fra heterogenitet i de fleste solide svulster og deres motstand mot kjemoterapeutiske regimer: i henhold til dette konseptet, etter behandling en rest populasjon av multiresistent cancer stamceller vil overleve og formere seg raskt for å re-etablere de tumorer ([2]). Den relative motstand mot kjemoterapeutisk medikament har blitt tilskrevet til uvirksom eller langsom spredning av cscs, en egenskap som deles med normale stamceller (se for eksempel [3]). Støtte for eksistensen av menneskelig cscs er tilstedeværelsen innen svulstene, av cellulære undergrupper uttrykker proteiner vanligvis bare finnes på stamceller og tapte på differensiering; Disse proteinene har blitt brukt for å anrike for de antatte cscs i ulike tumortyper, og for å bevise at tumorceller anriket for disse markørene gir opphav til svulster med større effektivitet enn den uselektert befolkning [4]. Gitt relevansen av cscs til tumorgenesen og metastase [5], [6], mer effektive kreftterapi krever en bedre kunnskap om hva som kjennetegner denne undergruppe av kreftceller og av de faktorer, ytre og indre, som bidrar til sin «stemness « . Vurdere relevansen og fysiologiske rollen til de «stamcellemarkører» til stamcelle fenotype vil øke vår forståelse av cscs og skal hjelpe til med å utforme selektive behandlinger.
I tilfelle av kolorektal kreft stamceller (CCSC) i dag er den best karakteriserte «stamcelle» markører er overflateantigenene CD133 [4], [7] CD166 [8], CD44 og CD24 ([9], [10] (gjennomgått av [11]). Intracellulær markører CCSCs inkluderer Musashi-en ([12], [13]), Bmi-1 [14] og ALDH [15] (anmeldt i [16]. Men det mest selektive og lovende markør for stamcelleforskningen i tarmepitelet og tarm kreft stamceller er LGR5 [17] (Uniprot Accession # O75473; UNIGENE # Hs.658889; også kalt GPR49) i normal tarmen LGR5 ekspresjon er begrenset til stamcelle sonen ved foten av krypten [18] og enkeltceller fra. tynntarmen uttrykke LGR5 kan generere strukturer som ligner tarm krypter «in vitro «[19], [20]. viktigst, Barker et al. [21] har vist i musemodeller som tarmsvulster oppstår fra LGR5 positive celler, noe som tyder på det merker intestinal kreft stamceller. LGR5 er overuttrykt i menneskelige kolorektal adenomer og karsinomer i forhold til normal slimhinne [22]: dermed LGR5 overekspresjon oppdages fra de tidlige stadiene av tykktarms tumorgenesen. LGR5 er en wnt target gen [23], og Wnt veien aktiveres tidlig i utviklingen av de fleste av kolorektal kreft gjennom trunkeringer av APC (adenomatøs polypose coli) og, sjeldnere, mutasjoner av β-catenin (anmeldt etter [24 ]). Det er imidlertid uklart om LGR5 oppregulering i kolorektal kreft celler bidrar vesentlig til tumorgenesen gjennom vedlikehold av tykktarms CSC, eller bare er en refleksjon av aktivert wnt signalering, uten direkte funksjonell rolle.
Lite er kjent om LGR5 funksjon i utvikling og kreftutvikling. LGR5 er en «foreldreløs» reseptor tilhørighet til G-protein reseptor kombinert (GPCR) familie [25]; sin ligand og modus av intracellulær signalisering er for tiden uklart [26]. Knockout av LGR5 i mus resulterer i neonatal dødelighet assosiert med kraniofaciale defekter (ankyloglossia) [27]. En grundig studie av Garcia et al [28] av prenatal intestinal utvikling i GPR49-LacZ mutant mus (LGR5 null) viser at tap av LGR5 ikke påvirker spredning eller migrering av tarmceller. Imidlertid forfatterne nevnt en sterk induksjon av celledifferensiering i Paneth LGR5 knockout embryo, og en molekyl signatur karakteristisk for oppregulert wnt signalering.
LGR5 synes å være en markør for CCRCs, vi har undersøkt hvilke parametere av cellevekst og differensiering er påvirket av modulering av LGR5 uttrykk i kolorektal kreft cellelinjer. På grunn av den funksjonelle redundans av mange signalmolekyler og de sterke tilbakemeldinger looper som opprettholder homeostase, disse studiene er vanskelige å tolke i dyremodeller, mens lave transfeksjonseffektiviteter og restriksjoner på langsiktig kultur hindre at disse studiene i humane primære tumorprøver. For å omgå disse vanskelighetene vi har brukt to kolorektal karsinom-cellelinjer, LIM1215 [29] og LIM 1899 [30] som et modellsystem. Våre resultater viser at LGR5 lyddemping og overekspresjon har motstridende effekter på celle-fenotype, inkludert forankrings-uavhengig vekst, migrering og tumordannelse som xenotransplantater i mus. Paradoksalt nok, undertrykkelse av LGR5 uttrykk forbedrer tumorgenesen og er knyttet til et mer mesenchymale fenotype. En studie av genuttrykksmønster etter modulering av LGR5 cellulære nivåer av siRNA knockdown eller transgen overekspresjon viser at tapet av LGR5 oppregulerer Wnt responsgener og nøkkel EMT sti gener; omvendt, overekspresjon av LGR5 favoriserer celle-celle adhesjon. Disse resultatene markere betydningen av LGR5, ikke bare som markør for kolorektal kreftceller, men som en regulator av Wnt svar, cellemotilitet og celle-celle adhesjon.
Resultater
LGR5 er uttrykt i kolorektal cellelinjer med β-catenin mutasjoner og oppregulert ved wnt stimulering i celler med APC-mutasjoner
kolorektal svulster er preget av mutasjoner i wnt pathway signaliserer komponenter [31], [32], [33], hovedsakelig APC og β-catenin, som fører til feilregulert eller celle-autonome responser til wnt. LGR5 er overuttrykt i primær kolorektale tumorer [34], [35]: overekspresjon kunne tenkes å være på grunn av anrikning av «stilk-lignende» celler, for oppregulering av Wnt signalveien, og /eller for å Wnt sti-avhengig vedlikehold av «stemness «. Vi utnyttet et panel av tidligere karakteriserte menneskelige tykktarmskreft cellelinjer [33] for å sammenligne LGR5 uttrykk til uttrykk av en annen antatte intestinal stamcelle markør, Musashi-en (Msi-1) [36], [12], [37]. Celler som uttrykker høye nivåer av LGR5 ikke vanligvis uttrykker høye nivåer av Msi-en, og omvendt (fig. 1A). Interessant, vi har oppdaget forhøyede nivåer av mRNA LGR5 bare i cellelinjer som bærer β-catenin mutasjoner (figur 1A). Høyden av LGR5 i p-catenin mutante celler er påfallende, hvilket antyder at mutasjons aktivering av β-catenin er ansvarlig for overekspresjon av LGR5, mens mutasjon av APC er ikke tilstrekkelig til å fremkalle påvisbar LGR5 ekspresjon i disse cellelinjene. For å teste wnt avhengighet av LGR5 uttrykk, stimulert vi cellene med L-celle avledet wnt3a, wnt5a eller kontroll betinget media. LGR5 og Musashi-1 mRNA-nivåer ble testet i parallell med QRT-PCR 12 timer etter stimulering (Fig. 1B). Som forventet, LGR5 uttrykk nivåer er uendret ved wnt3a stimulering i β-catenin mutant cellelinje LIM1899 men selektivt oppregulert ved wnt3a i APC-mutant cellelinjer LIM 2537, LIM 2405 og Lim1863 (Fig. 1B, venstre panel). Wnt stimulering påvirket ikke ekspresjonsnivåene av Msi-1 i noen av cellelinjene som ble testet (fig. 1B, høyre panel). Oppregulering av LGR5 av kanoniske wnt signalisering i responsive cellelinjer ble bekreftet ved farging med en validert antistoff mot LGR5 (fig. S1 A). I disse forsøk ble det observert maksimale nivåer av protein LGR5 48 timer etter stimulering av cellene med wnt3a, mens hverken wnt 5a eller L-celle-kondisjonert medium indusert LGR5 ekspresjon (Fig. S1B og data ikke vist). Dermed forhøyede nivåer av LGR5 i kolorektal kreft celler er sannsynlig å være sekundært til aktivert kanoniske wnt signalering, og mutasjoner i β-catenin bypass kravet for eksogene ligander. Vi har tidligere vist at LIM cellelinjer med heterozygote APC mutasjoner er svakt aktivert wnt signalering som følge av autokrin produksjon av kanoniske wnts [33]: mangel på LGR5 overekspresjon i disse cellene i fravær av eksogent wnt3a foreslå en terskeleffekt for LGR5 induksjon.
A) Expression nivåer for LGR5 og Msi-en ble bestemt ved QRT-PCR som beskrevet i metoder. Resultatene er presentert som genekspresjon i forhold til det endogene styre HPRT innenfor hver cellelinje. Celler er gruppert etter deres β-catenin eller APC-mutasjonsstatus. B) Cellelinjer som frakter β-catenin mutasjon (LIM 1899) eller APC-mutasjoner (LIM2537, LIM2405, LIM1863) ble stimulert i 12 timer med kultur medium (ingen stimulans), med kondisjonert medium fra L-celler uttrykker Wnt 3a eller wnt 5a, eller med utransfekterte L-celle kondisjonert medium (kontroll CM). Ekspresjon av LGR5 (venstre panel) og Musashi-1 (høyre panel) ble bestemt ved QRT-PCR, som beskrevet i Metoder. For hver cellelinje, barer representerer uttrykk nivå stimulert i forhold til ustimulerte celler.
Modulation av LGR5 uttrykk har dyptgripende virkninger på clonogenicity og tumorgenesen
Hvis overekspresjon av LGR5 i kolorektal kreftceller medieres av hyper-aktivert wnt vei, hvilken rolle LGR5 spille i wnt svar, og ikke uttrykk for LGR5 bidra til opprettholdelse av «kreft stemness»? For å møte den funksjonelle relevansen av LGR5 uttrykk i CRC cellelinjer, reduserte vi uttrykk i celler som bærer et β-catenin mutasjon (LIM1215 og LIM1899) med hemmende RNA. Vi først brukt lentiviral transduksjon av shRNA (kort hårnål RNA) til LGR5. Som kontroller brukte vi shRNAs rettet mot tilfeldige sekvenser (utenfor målgruppen, NT) eller til Msi-en. Musashi-1 uttrykkes i umodne tarmceller [12], [37], og er overuttrykt i kolorektale tumorer [35], men er ikke en Wnt-respons-genet (Fig. 1B). Vi brukte fire separate shRNA konstruksjoner for hvert mål gen: alle var effektive, og påfølgende eksperimenter ble utført ved bruk av den mest effektive shRNAs. Transduced celler ble bulk valgt i puromycin i to uker for å berike for shRNA-uttrykkende celler, deretter byttet til antibiotika-frie medier for funksjonell karakterisering. Knockdown Effektiviteten ble registrert QRT-PCR og celleformering ble undersøkt ved hjelp av MTT-analyser og kolonidannelse i myk agar. Lentiviral levering av shRNA til LGR5 eller til Musashi-1 var effektiv i begge cellelinjer og føre til en markert og spesifikk reduksjon i ekspresjon av målgener (Fig. 2 A, B, B). Uttrykket nivåer av de relaterte gener LGR6 og Msi-2 var upåvirket (data ikke vist). Vi har bekreftet tap av LGR5 protein etter knockdown ved hjelp av immunfluorescens (Fig S2.), Som LGR5 antistoffer er ikke egnet for påvisning av endogene nivåer av dette protein ved Western Blot
A) og B):. LIM1215 (A ) og LIM1899 (B) celler ble transdusert med lentiviral partikler inneholdende shRNA til ikke-målsekvenser (NT), for å LGR5 (shLGR5) eller til Musashi-1 (shMsi-1) og bulk valgt i puromycin. Uttrykk for LGR5 (venstre panel) og Musashi-1 (høyre panel) ble vurdert ved QRT-PCR to uker etter transduksjon. Data er presentert som genekspresjon i forhold til foreldrecellelinjer. Disse resultatene er representative for 5 separate eksperimenter. C): Celler som uttrykker shRNAs (shLGR5, shMsi-1 og NT) og parentale celler ble dyrket i antibiotika-fritt medium i tre dager og deretter testet for deres evne til å danne kolonier i bløt agar som beskrevet i Methods .. Data er presentert som koloni forming effektivitet stikkprøver i forhold til kontroll (utransfekterte) foreldre celler og er gjennomsnittet og sd av tre separate eksperimenter. D): Representative bilder av kolonier i soft-agar plater farget med krystallfiolett. Bilder ble kjøpt med et Nikon 90i med DXM 1200C kamera.
knockdown av enten LGR5 eller Msi-1-nivå ikke påvirke veksten av celler som heft monolag (fig. S3A), men tap av LGR5 og Msi-1 hadde slående og motsatte effekter på clonogenicity av cellene i bløt agar (fig. 2C). Knockdown av Musashi-1 fører til en reduksjon i den kolonidannende evne til både LIM1215 og LIM1899 celler, i samsvar med tap av spredning og tumordannende evne kolorektal cellelinje HCT116 etter nedregulering av Msi-en som rapportert av Sureban et al [ ,,,0],1. 3]. I motsetning til tap av LGR5 forårsaket en reproduserbar og dyp
øke
i clonogenicity både LIM1215 og LIM1899 (Fig. 2 C, D). Disse effekter på kolonidannelse ble observert konsekvent i begge cellelinjer og ved hjelp av to separate, LGR5-spesifikke shRNA-konstruksjoner.
Valg av cellene i puromycin kunne ha ført til forandringer i ekspresjonen av andre enn LGR5 gener, bidrar til denne overraskende resultat. Vi gjentok knockdown eksperimenter ved hjelp forbigående uttrykk for Cy3-merket siRNA (small hårnål RNA) til LGR5. -Celler ble transfektert med konstruksjonene og ekspresjon av Cy3-merkede siRNA ble overvåket ved fluorescensmikroskopi. Transfeksjon effektivitet, vurderes av Cy3 uttrykk med fluorescens mikroskopi, var 80% i LIM1899, men 20% i LIM1215; . Følgelig etterfølgende eksperimenter ble utført ved anvendelse LIM1899 celler
knockdown av LGR5 ved siRNA var meget effektiv (mer enn 90%) (Fig. 3A) og spesifikk. Viktigere, shRNA og siRNA knockdown av LGR5 hadde identiske effekter på clonogenicity av LIM1899, bekrefter at dette fenotype er et resultat av LGR5 downregulation og er ikke en gjenstand av utvelgelsesprosessen (fig. 3B).
LIM1899 celler ble transfektert med vektor uttrykker Cy3 (Cy3) eller Cy3-siRNA til LGR5 (Cy3 siLGR5). A) LGR5 uttrykk ved QRT-PCR i utransfekterte celler (foreldre) og celler transfektert med Cy3 eller Cy3-siRNA til LGR5. Tomter representerer LGR5 uttrykk for stikkprøver i forhold til foreldre (utransfekterte) cellelinje. B) LIM 1899-celler ble sådd ut i myk-agar to dager etter transfeksjon ved 5 x 103 celler /ml og dyrket i 10 dager. Colony tall ble vurdert etter farging med krystallfiolett ved hjelp av en dissekere mikroskop. Tomter representerer koloni nummer i testprøver i forhold til foreldre celler. Økningen i koloni tall ved å stanse all LGR5 er ekstremt viktig (*** = p 0,0001 av uparet t-test). For begge paneler data er gjennomsnitt og SD av triplikate prøver, og er representative for minst 3 separate forsøk.
Siden en nedgang i LGR5 nivåer spesielt forbedrer clonogenicity av kolorektal kreft cellelinjer, vi undersøkt om LGR5 overekspresjon ville redusere veksten av disse celler i myk-agar ved å utføre både forbigående og stabilt overekspresjon av LGR5 i kolorektal cellelinjer. Vi valgte å bruke de samme cellelinjer for både stanse og overekspresjon av LGR5 for å minimere ikke-LGR5 spesifikke forandringer i cellulære parametere. Selv om denne strategien risikerer å undervurdere virkningene av LGR5 overekspresjon, gir det en direkte sammenligning mellom transfekterte celler og letter tolkningen av ekspresjonsanalyse.
LIM1899 og LIM1215-celler ble transfektert med pTUNE vektor inneholdende den humane LGR5 sekvens flankert av myc og flagg sekvenser. Effektiviteten av transfeksjon for LIM1899 variert i disse forsøk mellom 30 og 60% som bestemt ved farging av cellene med anti-flag-antistoffer, mens transfeksjon effektivitet var mellom 10-20% for LIM1215 celler: følgelig etterfølgende eksperimenter ble utført i celler LIM1899 . Overekspresjon av flag-tagget LGR5 i transfekterte celler ble bekreftet ved QRT-PCR og ved immunofluorescens ved anvendelse av anti-flag og anti-LGR5-antistoffer (Fig. 4 A, B). Overuttrykt LGR5 var tilstede både i cytosol og i plasmamembranen; med akkumulering i avbryte strukturer (fig. 4A). Denne fordelingen er lik fordeling av endogent LGR5 i kolorektal kreft celler etter stimulering wnt (fig. S2). Den pTune Systemet er designet for IPTG- induserbar ekspresjon av proteiner, men høye nivåer av ekspresjon var til stede i fravær av IPTG, med bare en moderat økning etter induksjon (fig. 4 b). Overekspresjon av LGR5 i LIM1899 resulterte i et signifikant tap av kolonidannende evne i bløt agar (fig. 4C) uten å påvirke proliferasjon i henhold til adherente betingelser (Fig. S3). Parallell transfeksjon av cellene med Cy3-siRNA til LGR5 forårsaket den forventede økning i kolonitall i den samme assay (fig. 4C). Stabile cellelinjer som overuttrykker LGR5 ble samlet ved valg av de transfekterte celler i neomycin: LGR5 uttrykk i disse cellelinjene, som bedømt ved QRT-PCR og immunfluorescens ble økt betraktelig (Fig. S4 A, B), og er omvendt korrelert med clonogenicity i bløt agar (fig. S4 C, D). Dermed LGR5 modulasjon har konsistente og konkrete effekter på clonogenicity av kolorektal kreft cellelinjer.
LIM1899 celler ble transfektert med pTune vektor som inneholder menneskelig LGR5 flankert av et flagg sekvens og analysert 3 dager etter transfeksjon. A) Konfokalmikroskopi: LIM 1899 celler transfektert med pTune /LGR5 ble co-farget med anti-flag (M2) antistofffulgt av Alexa488 anti-mus Ig (grønn), anti-LGR5 antistoff HPA012530 fulgt av Alexa 546 anti-kanin Ig ( rød) og den kjernefysiske flekken DAPI. Vist er et sammenslåtte bildet (alle kanaler) og gråtonebilder av de grønne og røde kanaler, henholdsvis. Konfokal mikroskopi ble utført som beskrevet i Metoder. B) QRT-PCR: ikke-transfekterte celler (paren) og celler transfektert med LGR5 ekspresjonsvektoren ble dyrket i tre dager med eller uten IPTG (100 uM). RNA-ekstraksjon og QRT-PCR ble utført som beskrevet i Metoder. Grafen viser nivået på uttrykk for LGR5 i transfektert i forhold til foreldre celler. Dataene er gjennomsnittet +/- SD av triplikate prøver, og er representative for 3 separate eksperimenter. C) klonogene analyse: utransfekterte celler og celler transfektert med pTune /LGR5 eller med Cy3-siRNA til LGR5 ble sådd i myk-agar plater ved 5 x 103 celler /plate, som beskrevet i Metoder. IPTG (100 uM). ble lagt til triplikate plater for bare foreldre og LGR5-uttrykkende celler. Platene ble inkubert i 10 dager og deretter farget med krystallfiolett og koloniene telles med et disseksjonsmikroskop. Grafen viser middel og standardavvik for tre separate eksperimenter som hver ble normalisert til de koloni tall for parentale celler. Forskjellen mellom foreldre og transfekterte celler er svært signficant (** = p 0,005 og *** = p 0,001 for de to kulturforhold)
Clonogenicity i halvfast media tumorceller. ofte korrelerer med deres evne til å danne svulster i immunsupprimerte mus. Vi brukte en xenograft modell for å teste om modulering av LGR5 påvirker tumourigenicity av LIM1899 celler. LIM1215 ble ikke testet i dette system da det er både dårlig tumorigen som en xenograft og transfects med meget lav effektivitet. LIM1899 celler ble utvidet og transfektert i bulk med Cy3-siRNA til LGR5 eller med pTune-LGR5. Transfekterte og parentale celler ble ekspandert i to dager, deretter høstet for parallell måling av LGR5 ekspresjon ved QRT-PCR, clonogenicity «in vitro» og tumor-dannende kapasitet «in vivo» (fig. 5). Andelen av transfekterte celler, overvåket ved fluorescens mikroskopi for Cy3siRNA ekspresjon og farging med anti-flag-antistoff for LGR5 overekspresjon, var 80% og 60%, respektivt. Cellene som brukes for xenografter hadde den forventede reduksjon eller økning i LGR5mRNA (figur 5B.): Undertrykkelse av LGR5 uttrykk vedvarte i inntil to uker i celler behandlet med siRNA, mens overekspresjon av LGR5 var kommet tilbake til basislinjen etter 14 dager (fig. 5C). Den clonogenicity av cellene anvendt i transplantater var omvendt proporsjonal med nivået av ekspresjon av LGR5 (fig. 5D). Celler som uttrykker siRNA til LGR5 viste forbedret svulstdannelse; omvendt, celler som overuttrykker LGR5 var mindre tumorigen (Fig. 5A, B). Forskjellen i tumorstørrelse mellom LGR5 knockdown og foreldrecellene var svært signifikant (p 0,0001) ved alle tidspunkter, men veksten av tumorer som overuttrykker LGR5 var signifikant forskjellig fra parentale celler bare for de første 10 dagene av xenotransplantater eksperiment (Fig . 5A). Forskjellen i stabiliteten uttrykk for siRNA til LGR5 den LGR5 konstruere vs. (Fig. 5C) er i tråd med de langsiktige virkningene av LGR5 downregulation og mer forbigående effekter av LGR5 oppregulering på xenografter. Vi har observert meget god korrelasjon (r = 0,996) mellom clonogenicity i myk agar og tumourigenicity (fig. 5D), noe som bekrefter gyldigheten av den tidligere som en erstatning analyse.
LIM1899-celler ble narretransfekterte (ingen vektor), transfektert med Cy3LGR5 eller med pTune /LGR5. Celler ble utvidet for to doblinger (48 timer) etter transfeksjon, deretter samles for inokulering i nakne mus, bestemmelse av vekst i myk agar og måling av LGR5 uttrykk ved QRT-PCR som beskrevet i metoder. A) Venstre panel: xenografter tumorvekstkurver, panel høyre: tumormassen på day18. Veksten av subkutane tumorer ble målt tre ganger ukentlig ved hjelp av krumpassere, og volumet bestemt av formelen V = 1/2 (lengde x bredde
2). Ved slutten av eksperimentet (dag 18) tumorer ble dissekert og veiet. Dataene er gjennomsnitt og standardavvik for hver gruppe (16 svulster /gruppe). Det var ingen statistisk forskjell mellom foreldrenes og pTune Lgr5 tumormasse, men forskjellen mellom foreldre og siLGR5 svulster er signifikant (*** = p 0,001). B) En prøve av celler som anvendes for xenograft injeksjon ble testet ved QRT-PCR for LGR5 ekspresjon. Data ble analysert i ABI 7300 (ΔΔCt studien), og er presentert som LGR5 uttrykk i forhold til foreldre celler. Data er presentert som gjennomsnitt og standardfeil. C) Tid løpet av transgene ekspresjon i dyrkede LIM 1899. ekspresjon av LGR5 i celler transfektert med siLGR5 eller pTune LGR5 ble fulgt over en periode på to uker ved å QRT-PCR. Nivåer av LGR5 uttrykk er presentert i forhold til vektorkontroll for hver av de tidspunkter. D) En prøve av celler som anvendes for xenograft eksperimentet ble dyrket i myk-agar plater ved 5 x 10
3 celler /plate for å bestemme kloningseffektiviteten. Platene ble inkubert i 10 dager, deretter farget med krystallfiolett og kolonitall bestemt ved lysmikroskopi. *** = P 0,001. E) Sammenheng mellom tumormasse (kurve A) og kloning effektivitet (graf D).
Vi analyserte subkutane svulster for LGR5 uttrykk ved hjelp av immunfluorescens. Representative bilder av svulster farget med heamatoxilin og eosin (A), eller ko-farget med LGR5 og β-catenin (immunfluorescens-bilder) er vist i fig. 6. Morfologisk alle tumorer besto av veldefinerte kjertler, og kan klassifiseres som moderat differensierte adenokarsinomer (Fig. 6A). Svulster som stammer fra siLGR5 LIM1899 tendens til å ha en mer uordnede morfologi, gjenspeiles i den subtile, men signifikant forskjell i antall velformede kjertler per felt mellom foreldre tumorer (26 +/- 3 n = 16) og siLGR5 svulster (15 + /-2 n = 16, p = 0,0014). Antallet kjertler pr feltet ble øket i tumorer som overuttrykker LGR5 (31 +/- 2, n = 16), men forskjellen fra foreldre tumorene var ikke statistisk signifikant. I alle tumorprøver LGR5 flekker var mest fremtredende i kjertlene, særlig mot kjertelen lumen, og var svakere i de mer amorfe områder av svulsten (Fig. 6B). Farging for LGR5 var spesifikk, da ikke noe signal ble detektert i prøver inkubert med normalt kaninserum (Fig. 6C). LGR5 immunoreaktivitets ble marginalt forhøyet i svulster avledet fra LIM1899 celler transfektert med pTune LGR5, men ikke i alle områder av svulster. LGR5 farging ble redusert, men ikke helt fraværende, i tumorer avledet fra LIM1899 celler transfektert med siLGR5. I disse prøvene, dukket LGR5 uttrykk begrenset til kjertelstrukturer (Fig. 6B).
A) Haematoxilin og eosin farging av frosne seksjoner fra representative svulster generert fra foreldre LIM1899, LIM1899 transfektert med siRNA til LGR5 eller LIM1899 transfektert med pTune-LGR5 konstruere. Lysfelt bildene ble kjøpt på et Nikon 90i mikroskop med en 20 × linse. B) Confocal bilder av frosne snitt farget med antistoffer mot p-catenin (rød), LGR5 (grønn) eller DNA flekk DAPI (blå). Alle bilder er Z-stabler av confocal seksjoner. For hvert sett, viser den øverste panelet de tre kombinerte flekker, det midtre panelet LGR5 (gråtoner), og den nederste panel β-catenin (gråtoner). Bilder ble oppnådd på et Nikon C1 konfokal mikroskop med en 60 × olje linse. C) Spesifisitet kontroll for LGR5 farging: frosne snitt ble farget med antistoff mot p-catenin og normalt kaninserum etterfulgt av Alexa 488 anti-kanin-Ig (grønn) og Alexa 546 anti-mus-Ig (rød) og den nukleære flekk DAPI ( blå). Den grønne kanalen (NRS) og rød kanal (β-catenin) er vist separat i gråtoner. Bilder ble oppnådd som i B).
Cell-celle adhesjon og migrasjon er regulert av LGR5 nivåer
LGR5 nivåer har dyptgripende virkninger på anker uavhengig spredning av kolorektal kreft celler «i vitro «og» in vivo «; men hvordan LGR5 modulerer forankringsuavhengig vekst er uklart. Vi har observert at LIM1899 celler som overuttrykker LGR5 tendens til å vokse i » kolonier med tette celle-til-celle-kontakter, mens LIM1215 og LIM1899 celler med redusert LGR5 er mer diffuse på plastoverflaten (ikke vist). De motsatte fenotyper observert etter knockdown eller overekspresjon av LGR5, og deres konsistens i forbigående og stabile uttrykk systemer, viser at dette fenomenet er direkte korrelert til LGR5 nivåer. Således kan LGR5 modulere balansen mellom celle-celle og celle-substrat adhesjon. For å karakterisere celle-matriks og celle-celleinteraksjoner vi dyrkede celler som sfæroider i hengende dråper [38] og utført både viklet analyser og motilitet assays for å måle potensialet migrasjon av cellene. Hengende dråper analyser måle den proliferative potensial av cellene i fravær av celle-matriks-vekselvirkninger; sår analyser vurdere graden av bevegelse av en celle monolag, og motiliteten analysen måler hastigheten på migrasjonen av cellene gjennom ECM i filterporene.
sperre LIM1899 celler eller LIM1899 celler transfektert med tom vektorer, vokser i hengende dråper som aggregater med tette sentre (fig. 7A). I parallelle kulturer, er kuler av celler med reduserte nivåer av LGR5 (siLGR5) omgitt av en glorie av løst tilknyttede celler og er lett forstyrret, mens cellene uttrykker høye nivåer av LGR5 (M2LGR5), enten forbigående eller stabilt, pakke inn i kompakte kuler motstandsdyktig mot mekanisk ødeleggelse (fig. 7A og data ikke vist). Forskjellen i celletetthet er reflektert i volumet av kulene i forhold til deres cellularitet: mens kulene fra forskjellige cellelinjer inneholde lik antall celler (Fig. 7A, høyre grafen), forskjellen i volum mellom siLGR5 sfæroidene og sfæroider overekspresjon LGR5 (fig. 7A, venstre grafen) er signifikant (p = 0,001), som viser en tettere pakking av cellene i M2LGR5.
Lim1899-celler ble transfektert med vektor kontroller (Cy3V og pTuneV), med Cy3- siLGR5 eller med pTune /LGR5. Sperre, forbigående transfekterte celler (Tr) eller stabilt transfekterte cellelinjer (ST) ble dyrket under følgende betingelser: A) celler ble sådd i 30 pl dråper på en plastoverflate, og platen invertert for å skape hengende dråper, som beskrevet i Metoder. Bilder ble tatt etter 8 dager etter re-invertere plast støtte og bildebehandling i sterkt felt med et Nikon 90i mikroskop og en 10 × linse. Digitale bilder ble kjøpt med en fotometriske CoolSnap digitalkamera. Spheroid volumer (venstre graf) ble beregnet ut fra disse bildene ved hjelp av modifisert ellipsoiden formel. Sfæroide størrelser var signifikant forskjellig mellom siLGR5 eller M2LGR5 transfekterte celler og deres motstykker transfektert med tom vektor (p = 0,0312 og p = 0,321, respektivt, av den uparede t-test). Den cellularitet av sfæroidene (høyre graf) ble vurdert som beskrevet i Metoder. I begge grafer av data representerer gjennomsnitt og standardavvik for 10 individuelle kuler per cellelinje. B) parentale celler og celler stabilt transfektert med pTune /LGR5 (klonene 6-1) ble sådd ut ved høy tetthet i 24-brønners plater. Sår ble skrapet i de adherente monolyers og brønnene ble fotografert hver to dager med en Nikon90i mikroskop ved anvendelse av en 10 x objektiv (øvre panel). Mikrofotografiet på nederst til høyre viser en høyere forstørrelse av LGR5 6-1 sår på dag 6 (20 × linse). Sett: Pris for sårheling over 96 timer.
