Abstract
Formål
PP2A er en serin /treonin fosfatase kritisk til fysiologiske prosesser, herunder apoptose. Cellegjennomtrengende peptider er molekyler som kan translocate inn i cellene uten å forårsake skade på membranen. Vårt mål var å utvikle celletrengende fusion peptider spesielt utviklet for å forstyrre caspase-9 /PP2A samhandling og evaluere deres terapeutiske potensial
in vitro Hotell og
in vivo
.
Experimental design
Vi ga en peptid som inneholder en gjennomtrengende sekvens knyttet til samspillet motivet mellom menneske caspase-9 og PP2A (DPT-C9h), for å målrette deres tilknytning. Ved hjelp av tumorcellelinjer, primære humane celler og primære human brystkreft (BC) xenografter, undersøkte vi kapasiteten til DPT-C9h å provosere apoptose in vitro og hemming av tumorveksten (TGI)
in vivo
. DPT-C9h ble intraperitonealt administrert i doser fra 1 til 25 mg /kg /dag i 5 uker. Relativ Tumor Volume (RTV) ble beregnet.
Resultater
Vi viste at DPT-C9h spesifikt mot caspase-9 /PP2A samhandling
in vitro Hotell og
in vivo Hotell og indusert caspase-9-avhengig apoptose i kreftcellelinjer. DPT-C9h også indusert betydelig TGI i BC xenoimplantater modeller. Musen-spesifikt peptid DPT-C9 også indusert TGI i lunge (K-Ras modell) og brystkreft (PyMT) modeller. DPT-C9h har en spesifikk effekt på transformerte B-celler isolert fra kronisk lymfatisk leukemi pasienter uten noen effekt på primær friske celler. Til slutt ble det ikke observert hverken toksisitet eller immunogene responser.
Konklusjon
Ved hjelp av cellepenetrerende peptider som blokkerer caspase-9 /PP2A interaksjoner, har vi vist at DPT-C9h hadde en sterk terapeutisk effekt
in vitro Hotell og
in vivo
i musemodeller av tumorprogresjon
Citation. Arrouss jeg, Nemati F, Roncal F, Wislez M, Dorgham K, Vallerand D, et al. (2013) Spesifikk målretting av caspase-9 /PP2A Interaksjon som potensielle nye Anti-Cancer Therapy. PLoS ONE 8 (4): e60816. doi: 10,1371 /journal.pone.0060816
Redaktør: Ming Tan, University of South Alabama, USA
mottatt: 12. oktober 2012; Godkjent: 03.03.2013; Publisert: 23 april 2013
Copyright: © 2013 Arrouss et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne takke Inserm og Institut Curie for finansiering. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Apoptose er en genetisk programmert celledød og dens deregulering er knyttet blant annet patologi, med kreft. Flere fosfataser har nylig blitt attraktive mål for behandling av en rekke sykdommer, inkludert kreft [1], [2], [3], [4]. Imidlertid er den eneste kliniske medikamenter som målretter et fosfatase er de immunosuppresssive cyklosporin A og FK-506, som inhiberer serin /treonin-fosfatase 2B (calcineurin) og NFAT-aktivering [5], [6], [7], [8], [9]. Men langvarig bruk av disse legemidlene kan føre til uønskede bivirkninger [10].
Ser /Thr fosfataser PP1 og PP2A har vært implisert både i induksjonen av celledød gjennom en) defosforylering av Bad [11 ] og caspase-9 [12] 2) stimulering av cytokrom
c
meldingen [13], og 3) defosforylering av retinoblastom-proteinet [14], [15]. Men disse fosfataser for det meste kontrollere fosforylering nivået av Bcl-2 og caspase-9, som bestemmer deres funksjonelle egenskaper [16], [17], [18]. Omvendt, inhibering av PP1 [19], PP2A [20], eller PP2C [21] utløser celledød, noe som indikerer også en potensiell anti-apoptotiske funksjonen til disse fosfataser, og peker til et komplekst samspill av fosfatase handlinger. Vi har tidligere vist en interaksjon mellom caspase-9 og PP1α. I dette komplekse, induserer aktiverte PP1α caspase-9 defosforylering, og som en konsekvens av dens aktivering fører til apoptose [12]. Vi har oppdaget at i dette komplekset, i tillegg til PP1αactivity, en annen okadainsyre følsom enzymatisk aktivitet er kompatibel med en PP2A-aktivitet, noe som antyder en mulig interaksjon mellom caspase-9 og PP2A som kan være involvert i celledød regulering.
celle~~POS=TRUNC peptider (CPP) er molekyler som kan translocate inn i cellene uten å forårsake skade membranen, hvilket fører til deres foreslåtte anvendelse som vektorer for å levere terapeutiske last [22]. Disse peptidene kan krysse membranen og nå cytoplasma og /eller kjernen [23]. Ved hjelp av CPP, har vi også tidligere rapportert eksperimentelle bevis som bevis på prinsipp for stoffet fosfatase teknologi (DPT), [24], [25].
På disse basene, bestemte vi oss for å analysere om modulering av PP2A og caspase-9 interaksjon kan ha en innvirkning på induksjon av tumorcelle deathing uten å påvirke friske celler, og demonstrerte DPT-C9h og DPT-C9 tilsvarende bindingsstedene mellom menneske og mus caspase-9 og PP2A henholdsvis har en bestemt anti -tumour effekt.
Materialer og metoder
Cells og kultur
Menneskelig Daudi, Jurkat, og HeLa cellelinjer ble dyrket i RPMI supplert med 10% FCS. LKR10 og LKR13 har tidligere blitt beskrevet [26] og ble dyrket i RPMI supplert med 10% FCS. Human brystkreft (BC), uveal melanom (UM), ikke-småcellet lungekreft, og små-celle lungecancer cellelinjer har blitt isolert fra primære humane cancer xenografter [27], [28], [29]. De tre UM-cellelinjene er blitt direkte oppnådd fra pasienter «. BC-cellelinjer ble dyrket i DMEM eller RPMI-medium supplert med 10% til 20% FCS, med unntak av HBCx-15, som ble supplert med 10% hesteserum. UM og lungecancercellelinjene ble dyrket i RPMI supplert med 10% eller 20% FCS, respektivt. BC og UM cellelinjer ble direkte isolert fra tilsvarende svulst. De Daudi, HeLa og Jurkat cellelinjer ble hentet fra samlingen av instituttet.
Immunpresipitasjon og western blot
immunoprecipitation og western blot ble gjort som beskrevet tidligere [12]. Anti kaspase-9, og anti-PP2A-antistoffer ble innkjøpt fra Santa Cruz, Cell Signal, Sigma eller Abcam. Den anti-Tim 23 og anti Cyt c ble hentet fra Transduction Laboratories.
Peptidsyntese og sekvens
Peptidene ble syntetisert som tidligere beskrevet [30].
Påvisning av apoptose av Annexin farging
Apoptose ble oppdaget av Annexin V-FITC flekker i henhold til produksjon protokoll (BD Biovitenskap).
caspase-9 aktivitet
caspase-9 aktivitet ble oppdaget ved hjelp av Caspase-Glo 9 kit (Promega) og etter fremstillingen protokoll.
serum enzymbundet immunosorbent assay (ELISA serum)
ELISA-testen ble utført som tidligere beskrevet [31], [ ,,,0],32].
Miochondrial membranpotensialet analysen
for påvisning av endringer i mitokondrienes membranpotensiale, vi brukte Cell Meter JC-10 analysesett følger produserer anbefalinger.
cellesyklusanalyse
Det er totalt 1 × 10
6 celler ble fiksert i etanol 70% i 1 time ved 4 ° C. Cellene ble sentrifugert og vasket med flekker buffer (DPBS /2% FCS). Etter vasking ble cellene behandlet med 50 ul RNase (1 mg /ml lager) og inkubert i 30 minutter ved 37 ° C. Celler ble farget med 5 ug propodim jodid i 30 minutter ved romtemperatur. Cellular DNA innhold ble analysert ved FACS.
Isolering av Mitokondrier brøkdel
I alt 40 × 10
6 celler ble vasket med avkjølt PBS. Cellepelleten ble resuspendert i 5 volumer iskald buffer A (20 mM Hepes-KOH, pH 7,5, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl
2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 0,1 mM PMSF , 250 mM sakkarose) supplementert med proteasehemmere. Celler ble avbrutt i en Dounce-homogenisator, ble kjernene sentrifugert (1000 x g, 10 min, 4 ° C), og supernatanten ble ytterligere sentrifugert (10.000 g, 10 min, 4 ° C), mitokondrial pellet ble resuspendert i buffer A og lagret ved -80 ° C.
Isolering av cellepopulasjoner
Friskt blod fra friske givere ble samlet inn av Etablissement Francais du Sang. Kronisk lymfatisk leukemi (KLL) prøver ble innhentet fra Hematologisk Service of Pitié Salpêtrière-sykehuset. Perifere mononukleære blodceller (PBMC) ble isolert fra pasienter eller friske donorer ble opprettholdt i RPMI 1640 supplementert med 10% FCS, 1% ikke-essensielle aminosyrer, 1% Hepes, 1% natriumpyruvat, 1% glutamin. B-celler ble isolert ved anvendelse av Dynal negativ isolasjonskit (Invitrogene). Renheten av de isolerte cellene nådde opp til 98%. Humane lymfocytter isolert ble farget med anti-hCD19-AP og tidlig apoptose hendelser ble bestemt med Annexin-V-FITC.
In vivo
modeller av primære humane tumorxenotransplantater
de primære human brystkreft (BC) xenotransplantater ble oppnådd som tidligere beskrevet [27], [28] for mus brystkreftsvulster ble oppnådd ved anvendelse av den transgene
Polyoma USA-T
Mouse PyMT modell [33]. Spontant voksende svulster på melkekjertler som forekommer i transgene mus ble xenopodet inn
naken
immunsvikt mus for å tillate farmakologiske vurderinger, og vedlikeholdes fra
naken
musen til å
naken
mus serielt passasjer.
mus modell av primær pulmonal adenokarsinom mutert for
K-ras
K-ras
LA1 mus ble gitt av NCI mus modeller av kreft hos mennesker Consortium (MMHCC) (NCI Mouse Repository /NIH, Rockville, MD). De bærer en latent
K-ras
allel med to kopier av exon 1: en var villtype og den andre G12D mutant (Tyler Jacks). Den latente allelet er stokastisk aktivert i celler gjennom homolog rekombinasjon, noe som resulterer i delesjon av villtypekopi av ekson 1 og ekspresjonen av en onkogen form av
K-ras-genet
. Multifokale lunge adenokarsinomer utvikle spontant i 100% av disse musene.
Medisinske analyser
For terapeutiske eksperimentelle analyser i subkutane transplantert xenografter (primære humane svulster og PyMT svulster), 5- til 8-ukers gammel Swiss nu /nu hunn-mus mottok en subkutan pode av tumorfragmenter med et volum på ca. 15 mm
3 som tidligere beskrevet [29].
for terapeutiske eksperimentelle forsøk i K-ras
LA1 mus , 16-ukers gamle mus randomisert mellom kontroll (n = 17) eller behandlingsgruppen (n = 16) i 4 uker. Musene ble veid en gang i uken. Ved slutten av behandlingen, ble obduksjon utført for placebo eller behandlingsgrupper og lungesvulster ble talt opp. Resultatene er uttrykt som antall tumor /mus, gjennomsnitt ± SEM.
Tumorvolumet ble beregnet ved å måle to vinkelrette diametere målepunkter. Hver tumorvolum (v) ble beregnet i henhold til følgende formel: V = axb
2/2, hvor a og b er den største og den minste perpendikulære tumor diametere. Relativ tumorvolum (RTV) ble beregnet fra følgende formel: RTV = (Vx /V1), hvor Vx er tumorvolumet på dag x og V1 er tumorvolumet ved initiering av behandlingen (dag 1) .Growth kurver ble oppnådd ved å plotte det midlere volum av RTV på Y-aksen mot tiden (X-aksen, uttrykt i dager etter start av behandlingen), Antitumoraktiviteten tumor~~POS=TRUNC aktiviteten~~POS=HEADCOMP ble evaluert i henhold til tumorvekst-inhibering (TGI), beregnet i henhold til følgende formel: prosent GI = 100 -. (RTVt /RTVc) x 100, hvor RTVt er mediet RTV hos behandlede mus, og RTVc er median RTV av kontroller, både på et gitt tidspunkt da den anti-tumor effekt var optimal
DPT- C9h og DPT-C9 peptider fortynnet i vann /glukose (1-25 mg /kg) ble gitt av intraperitonealt rute 5 til 7 dager per uke, i henhold til modellene og de terapeutiske tidsplaner.
bioluminesens analyser
HBCx-12A-cellelinjen ble etablert fra den HBCx-12A xenograft og vedlikeholdt i RPMI, supplert med 20% føtalt kalveserum og penicillin /streptomycin. Celler ble transdusert med den lentiviral supernatanten inneholdende luciferase [19] og Ds-Red og totalt 1,9 x 10
6-celler som uttrykker Ds-RED-Luc ble implantert subkutant i
nakne mus
. Vekst svulst ble måling av caliper og ved optisk avbildning.
Bioluminesens bildebehandling ble utført med IVIS Imaging System (IVIS100, Caliper Life Sciences, USA). Anesteserte mus ble injisert i.p. med luciferin ved 150 mg /kg. Imaging innhentingstiden var fra 1 s til 1 min, avhengig av Bioluminescens signal. Analysene ble utført ved hjelp av programvare Leve Bilde V. 2.50 (Caliper Life Sciences).
Statistiske tester
For
in vivo
eksperimenter «analyser, statistisk signifikans av forskjeller observert mellom individ RTVs svarende til gruppen av behandlede mus og kontrollgruppen, hvori 9-10 mus per gruppe har blitt inkludert, ble beregnet ved en paret Students t test [29]. For K-ras
L1 mus modell, bruker vi Mann Whithney test
peptider sekvens
DPT-SH1. VKKKKIKREIKI
C9: YIETLDGILEQWARSEDL
C9h: YVETLDDIFEQWAHSEDL
DPT-C9h: VKKKKIKREIKI YVETLDDIFEQWAHSEDL
DPC-C9: VKKKKIKREIKI YIETLDGILEQWARSEDL
DPT-C9h Mut: VKKKKIKREIKI YVETLDDIFEQAAHSEDL
All peptider ble oppløst på sterilt vann.
den eksperimentelle protokollen og dyr bolig var i samsvar med institusjonelle retningslinjer som foreslått av den franske etisk komité (avtale B75-05-18, Frankrike). Ingen samtykke var nødvendig for denne studien. Alle operasjoner ble utført under total zylazine /ketamin anestesi og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse.
Alle pasientene hadde tidligere gitt sitt samtykke for eksperimentell forskning på rest svulstvev tilgjengelig etter histophatologic og cytogenetisk analyse. De KLL prøver er tumorrester og pasientene gitt sitt samtykke. Denne forskningen ble ikke utført utenfor landet vårt. De etiske komiteer godkjenne denne prosedyren.
De bevilgende myndighet hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet.
Resultater
DPT -C9h peptid blokkerer caspase-9 /PP2Ac samhandling i brystkreftcellelinjer
Vi har tidligere fastslått at bindingssetet av menneskelig og mus caspase-9 til PP2A (patent PCT-EP2010 /054134, web site: Espacenet .com eller worlwide.espacenet.com, for peptidsekvens, se Materialer og metoder) og knyttet dette samspillet motiv til en celle gjennomtrengelig shuttle [24], [25]. For å målrette caspase-9 /PP2Ac samhandling, bestemte vi oss for å bruke den patenterte peptid som inneholder tidligere utgitt trengende sekvens knyttet til området av samspillet mellom mus (DPT-C9) eller menneske (DPT-C9h) caspase-9. Som kontroller genererte vi shuttle DPT-SH1 alene, peptider C9 og C9h, som ikke inneholdt shuttle og peptid DPT-C9h Mut, med en mutasjon i caspase-9 /PP2A bindende sekvens og som ikke binder PP2A (data ikke vist).
Vi var først interessert i å bekrefte at den spesifikke målet for DPT-C9h peptid var komplekset caspase-9 /PP2A. For å nå dette målet, analyserte vi om den menneskelige peptid DPT-C9h wasable å målrette
in vivo Hotell og
in vitro
caspase-9 /PP2A interaksjon. For
in vivo
konkurranse, lysater fra kontroll ubehandlede eller DPT-C9h-behandlede HBCx-12A-celler ble immunopresipitert med anti-kaspase-9-antistoff og nærværet av caspase-9 /PP2A-komplekset ble analysert ved hjelp av western blot . Figur 1A viser at mengden av komplekset påvises i DPT-C9h-behandlede celler var sterkt redusert sammenlignet med ikke-behandlede kontrollceller. For
in vitro
konkurranseanalyse, lysater fra HBCx-8-celler ble immunoutfelt med et anti-kaspase-9-antistoffet og interaksjonen med PP2A konkurrerte med DPT-C9h peptid (figur 1A). PP2Ac ble påvist i kontroll-kaspase-9 immunopresipitater, mens det var nesten umulig å oppdage etter konkurranse med 1,5 mM av DPT-C9h peptid. I begge (
in vitro Hotell og
in vivo
konkurranser), ble caspase-9 /PP2A komplekse ikke endres av shuttle DPT-SH1 (figur 1B). Dette tyder sterkt på at DPT-C9h peptid spesifikt rettet mot samspillet mellom menneske caspase-9 og PP2Ac.
A)
In vivo
konkurranse av caspase-9 /PP2Ainteraction. Den HBCx-12A brystkreftcellelinjen ble dyrket i 24 timer i nærvær eller fravær (kontroll) av DPT-C9h (100 uM); Cellene ble lysert og cytoplasmiske ekstrakter immunopresipitert med anti-kaspase-9-antistoffet og immunoblottet med anti-PP2Ac og anti-caspase-9-antistoffer.
In vitro
konkurranse av caspase-9 /PP2A interaksjon. Cytoplasmatiske lysater fra HBCx-12A-celler ble immunopresipitert med anti-kaspase-9-antistoffet; caspase-9 /PP2Ac interaksjonen ble konkurrert
in vitro
med 1,5 mM av DPT-C9h peptid i 30 minutter ved romtemperatur; immunopresipitater ble vasket og immunoblottet med anti-PP2Ac og anti-kaspase-9, idet sistnevnte som intern kontroll av protein lasting. B) HBCx-12A cellelinjen ble dyrket i nærvær eller fravær (kontroll) av transporttjenesten DPT-SH1 (100 mm) i 24 timer og
in vitro Hotell og
in vivo
konkurranse av caspase-9 /PP2A interaksjon ble analysert som ovenfor.
de trengende peptider DPT-C9 og DPT-C9h indusere artsspesifikke apoptose
Vi analyserte muligheten av to trengende peptider DPT-C9h og DPT-C9, samt negative kontroll peptider C9, C9h og DPT-SH1 å indusere apoptose. Som vist i figur 2A, DPT-C9h indusert apoptose, som detektert av Annexin V-farging i humane Daudi, Jurkat, og HeLa-cellelinjer ved 20 timer fra behandlingen, mens C9 og C9h peptider uten transport og skyttelen alene, ikke gjorde indusere apoptose i humane cellelinjer. Tilsvarende hadde den DPT-C9h peptid ikke har noen apoptotisk virkning på muselungecancercellelinjer LKR10 og LKR13, mens peptidet DPT-C9, spesifikk for mus caspase-9, indusert apoptose i begge cellelinjer ved 24 timer etter behandlingen ( figur 2B). Videre vi ikke observere noen apoptotisk effekt på behandling av cellelinjer med shuttle (Fig 2B). Basalnivået av apoptose i ikke-behandlede kontrollceller er også vist. Disse resultatene støtter sterkt artens spesifisitet for både DPT-C9 og DPT-C9h peptider.
A) Daudi, Jurkat, og HeLa-cellelinjer ble dyrket i nærvær av DPT-C9h, DPT-SH1, C9h, eller C9-peptider i 20 timer ved 100 uM, og apoptose ble bestemt ved Annexin V-farging. B) Mus lungekreft cellelinjer LKR10 og LKR13 ble dyrket i nærvær av DPT-C9h, DPT-C9, eller DPT-SH1 ved 100 uM. Etter 24 timers inkubering, ble estimert ved apoptose Annexin farging. Basalnivået av apoptose av kontroll ikke-behandlede celler er vist. P-verdier er også vist (* 0,05; ** 0,001; *** 0,0001). C) Bryst, uveal melanom og lungecancercellelinjer isolert fra primære humane xenografs ble dyrket i nærvær eller fravær av DPT-C9h peptid (100 uM) i 24 timer, og apoptose ble bestemt ved Annexin V-FITC. Basal nivå av apoptose uten peptid tillegg vises (grå farge) p-verdiene vises. D). Brystkreftcellelinjer avledet fra primære humane xenografter, ble inkubert med C9h i kulturmedium til 150 uM og apoptose-induksjon ble anslått til forskjellige tider. E) brystkreftcellelinjer isolert fra primære humane xenografter BCX-3 og BCX-12 ble dyrket i nærvær eller fravær (kontroll) av peptidet DPT-C9h i 24 timer, og apoptose ble bestemt.
Bruke menneskelige brystkreft, uveal melanom, ikke-småcellet lungekreft og småcellet lungekreft cellelinjer hentet fra primære humane xenograft modeller, testet vi den apoptotiske effekten av både DPT-C9h og C9h peptider. Apoptose ble også analysert i kommersielle brystkreftcellelinjer. I alle cellelinjer ble analysert, DPT-C9h indusert apoptose, i området fra 20 til 75% ved 24 timer av kulturen (figur 2C), mens ingen virkning ble observert etter C9h behandling av brystkreft-cellelinjer (figur 2D). Den apoptose av styre ikke-behandlede celler varierte fra 3 til 8%. Supplerende tilsetning av DPT-C9h peptid 27 timer etter den innledende behandling sterkt økt nivå av apoptose (data ikke vist). Figur 2E viser to representative apoptose histogram plott av to cellelinjer isolert fra human brystcancer-xenograft HBCx-3 og HBCx-12A modeller ble behandlet i 24 timer med eller uten (kontroll) DPT-C9h peptid. Samlet utgjør disse resultatene viser en sterk
in vitro
antitumoreffekten av DPT-C9h peptid i ulike humane cellelinjer.
Hemming av caspase aktivitet blokker apoptotisk effekt av DPT-C9h
Gitt at initiatoren caspase-9 er en viktig mediator av apoptose, analyserte vi evnen til DPT-C9h å aktivere caspase-9 i den humane brystkreftcellelinje HBCx5. Celler ble inkubert med peptidet og caspase-9 aktivitet ble anslått til forskjellige tider. Vi har observert en økning av kaspase-9 aktivitet i DPT-C9h behandlede cellelinje (figur 3A). Lignende resultater ble oppnådd ved anvendelse av cellelinjer uveal melanom og ikke-småcellet lungekreft (data ikke vist). Dessuten, ved hjelp av kaspaseinhibitor Z-VAD, vi har observert en reduksjon i caspase-9 aktivitet.
A) HBCx-3-celler ble dyrket i 3 eller 6 timer med medium (kontroll), 100 uM av DPT- C9h eller 10 uM av kaspaseinhibitor Z-VAD (pre inkubasjon av 1 time) og 100 uM av DPT-C9h. Caspase-9 aktivitet ble beregnet ved hjelp av en luminogenic substrat. Resultatene er representert i forhold til kontroll ikke-behandlede celler som vilkårlige enheter. P-verdiene er vist. B) HBCx-3 celler ble dyrket i 24 timer med medium (kontroll), DPT-SH1 (100 mm), DPT-C9h (100 mm) eller Z-VAD (10 mm, før inkubasjon av 1t) og DPT-C9h ( 100 uM). Apoptose ble estimert ved Annexin V-FITC-binding. C) HBCx-3-celler ble behandlet i forskjellige tidsperioder med DPT-C9h (100 uM) og deretter inkubert i 30 minutter ved 37 ° C beskyttet fra lys med den fluorescerende probe JC-10. Grønne og røde fluorescens ble målt. Data er representert i forhold til kontroll ikke-behandlede celler. P-verdiene er vist. D) HBCx-12A og HBCx-3 cellelinjer ble behandlet i 24 timer med 100 uM av DPT-C9 timer. Mitokondrie fraksjonen ble skilt fra helcellelysater og immunoblottet for cytokrom
c
. WB ble også hybridisert med mitokondrie markør Tim23 som intern kontroll av protein lasting. E) HBCx-3 celler var ikke-behandlede (kontroll) eller behandlet med 10 eller 25 mikrometer av DPT-C9h i 24 eller 48 timer og cellesyklusen ble analysert ved FACS.
For å avgjøre om aktivert kaspase-9 er involvert i den apoptotiske virkning av DPT-C9h, analyserte vi effekten av caspaser inhibitor Z-VAD på celle apoptose detektert av annexin-V-FITC-binding. Som vist i figur 3B, caspase-inhibitoren reduserer markant apoptose indusert av peptidet. Behandling av cellene med shuttle eller hemmer alene ikke induserer apoptose (figur 3B).
DPT-C9h induserer mitokondrie membran depolarisering og cytokrom
c
utgivelse uten å påvirke cellesyklusen
for å karakter DPT-C9h-indusert apoptose, undersøkte vi involvering av mitokondriene. I et fluorescens-baserte assay, eksponeringen av HBCx-5-celler til peptid induserte en markert minskning av mitokondriemembranpotensialet (figur 3C). For å bekrefte rollen som mitokondriene i DPT-C9h-indusert apoptose, analyserte vi enten DPT-C9h behandling indusert cytokrom
c
utgivelse. Ved hjelp av mitokondrielle proteiner fra kontroll ubehandlet eller peptid-behandlede celler, observerte vi utgivelsen av cytokrom
c
fra mitokondriene i DPT-C9h behandlede celler mens i ikke-behandlede kontrollceller, cytokrom
c
er beholdt i den mitokondrielle fraksjon (figur 3D). Forholdet mellom cytokrom
c Twitter /Tim 23 brukes som intern kontroll for normalisering og kvantifisering av mengden frigjort Cyt
c.
Disse resultatene bekrefter mitokondrie innblanding i DPT-C9h-indusert apoptose .
til slutt analyserte vi enten DPT-C9h peptid kan blande seg inn i cellesyklus sekvens. Cellene var ikke-behandlede (kontroll) eller behandlet med forskjellige doser av peptid for forskjellige perioder av tider og cellecyklus-fordeling ble analysert (figur 3E). Ved hjelp av
in vitro
sub-apoptotiske dose av peptidet, viste vi at DPT-C9h ikke induserte akkumuleringen av tumorceller i en hvilken som helst fase av cellesyklusen, uansett konsentrasjon som brukes og tiden analysert (figur 3E).
DPT-C9h har effekt på tumorceller, men ikke på friske celler
Kronisk lymfatisk leukemi (KLL) er preget av opphopning av monoklonale B-celler CD5 + i blodkreft organer, noe som gjenspeiler en defekt i apoptose. For å evaluere den apoptotiske effekt av DPT-C9h peptid i primær friske og tumorceller av lignende opprinnelse, brukte vi perifere mononukleære blodceller (PBMC) fra friske donorer og kronisk lymfatisk leukemi pasienter (CCL). PBMC fra friske donorer eller CLL pasienter ble behandlet i 3 timer med DPT-C9h peptid, vasket, resuspendert i fullstendig medium uten peptid i 6 timer og deretter analysert for apoptose. Figur 4A viser at DPT-C9h har en apoptotiske effekt på B-celler fra CLL pasienter, men ikke på B-celler fra friske donorer i forhold til å styre ikke-behandlede celler. DPT-C9h har ingen effekt på T, NK og monocytter fra friske givere eller KLL pasienter. Shuttle DPT-SH1 eller C9h peptider alene hadde ingen effekt (data ikke vist). Til slutt ble det observert en tilsvarende pro-apoptotiske virkning av DPT-C9h peptid når B-celler ble isolert fra benmarg fra KLL pasienter (figur 4B). Dette resultatet tyder på at bare tumor B-celler som er påvirket av DPT-C9h behandling uten noen effekt på celler fra friske givere, og understreker den spesifikke svulst effekten av DPT-C9h.
A) Perifere mononukleære blodceller (PBMC) fra friske donorer eller CLL pasienter ble dyrket i nærvær av DPT-C9h (150 mM) i 3 timer, deretter vasket, overført til fullstendig medium, og apoptose ble bestemt 6h senere. Valg av B-celler ble utført ved hjelp av anti-CD19-antistoff før Annexin V-FITC farging. Ubehandlet celler ble brukt som kontroll. B) Celler isolert fra benmarg fra KLL pasienter og friske donorer ble behandlet som i A og analysert for apoptose. P-verdiene er vist.
Mangel på immunogen aktivitet og
in vivo
toksisitet av DPT-C9h og DPT-C9 peptider
Gitt at vår endelige interesse er å bevise en anti-tumor effekt av DPT-C9h på kreft hos mennesker, bestemte vi oss for å analysere
in vivo
immunogen aktivitet av peptid.
Nude
immunsvikt T-celle mus ble behandlet fem dager per uke i 6 uker ved intraperitoneal injeksjon av DPT-C9h. Sera ble oppsamlet ved forskjellige tidspunkter og produksjon av antistoffer rettet mot DPT-C9h eller DPT-SH1 ble analysert. Ved hjelp av ELISA-test, hadde vi ikke påvise noen i antistoffer mot DPT-C9h eller DPT-SH1 hele kinetic analysert ved to forskjellige doser peptid (figur 5A). Tilsvarende antistoff-respons ble også analysert ved bruk av immunkompetente mus, igjen viser mangel på antistoffproduksjon heller mot DPT-C9h eller DPT-SH1 peptider (figur 5B). Dette resultatet tyder sterkt på at den DPT-C9h peptid er immunogent selv etter lang tids
in vivo
administrering hos immunkompetente eller immunodefficient musemodeller.
A) Serum antistoffer tatt fra nakne mus som ble behandlet i forskjellige perioder tid ble påvist ved ELISA ved to forskjellige konsentrasjoner av DPT-C9h peptid (10 og 50 uM). B) Serum antistoffer fra villtype mus behandlet for ulike perioder for tid ble testet ved ELISA mot DPT-C9h og DPT-SH1 (50 mm). C) DPT-C9h ble administrert intraperitonealt i mus med tumorer HBCx-12A på 1, 5 eller 25 mg /kg en gang daglig i 5 uker; medianvekten av mus i hver forsøksgruppe er representert ved forskjellige tidspunkter. Totalt 10 mus ble inkludert i hver gruppe. Tilsvarende DPT-C9h ble administrert intraperitonealt i mus som har svulster HBCx-8 ved 10 mg /kg to ganger daglig i 4 uker. DPT-C9 ble IP administrert på mus modell PyMT modell ved dose på 5 mg /kg. Median vekt av mus i hver forsøksgruppe er representert ved forskjellige tidspunkter. Ti mus ble inkludert per gruppe.
Før
in vivo
terapeutisk vurdering, toksisitet av DPT-C9h ble evaluert i mus med HBCx-8 og HBCx-12A svulster etter ulike tidsplaner administreringsmåte, dvs. intraperitoneale injeksjoner ved 1, 5, eller 25, mg /kg en gang daglig, eller 10 mg /kg to ganger daglig, i 4 til 5 uker. Uansett dose, har vi ikke observert noen bivirkninger i alle behandlede mus, så vel som en fullstendig vekt stabilitet av den behandlede mus (figur 5C). I tillegg ble det ikke observert noen døde i løpet av eksperimentet. Til slutt, for å bekrefte fraværet av toksisitet av musen spesifikt peptid, vi evaluert toleranse DPT-C9 peptid administrert på 5 mg /kg én gang daglig i den transgene
polyoma Midt-T
Mus PyMT (Fig 5C) . I alle forsøkene ble det ikke observert noen bivirkninger, inkludert vekttap.
DPT-C9h og DPT-C9 indusere
in vivo
hemming tumorvekst i lunge- og brystkreft modeller
Hvis du først bekrefte
in vivo
induksjon av artsspesifikke apoptose, vurderte vi effekten av DPT-C9 peptid i K-ras
LA1 adenokarsinom musemodell og i transgene
polyoma Middle -T
Mus (PyMT). Administrert intraperitonealt i en dose på 5 mg /kg i 5 dager /7 i 4 uker, DTC-C9 induserte en signifikant reduksjon i lungetumorbyrde som antall tumorer pr mus var 24,6 ± 2.8 (gjennomsnitt ± SEM) i placebogruppen sammenlignet med 15,4 ± 1,9 i den behandlede gruppen (p = 0,01) (figur 6A). Figur 6B viser histologisk analyse av lungevev av kontroll og DPT-C9h-behandlede mus representative. Videre
Nude
mus med xenopodet mus PyMT brystsvulster ble behandlet intraperitonealt med musen spesifikke DPT-C9 peptid ved en daglig dose på 5 mg /kg. Til tross for en meget rask spontant tumorvekst, DPT-C9 induserte en signifikant TGI på 46% (p 0,03) (figur 6C). Den relative tumorvolum (RTV) ble beregnet som beskrevet i detalj i materialer og metoder.
A) Peptidet DPT-C9 ble administrert IP ved 5 mg /kg en gang daglig, 5 dager i uken i 4 uker i K-Ras
LA1 adenokarsinom musemodell, viser en betydelig reduksjon i lungetumorbyrde sammenlignet med kontroll formulere kjøretøy-behandlede mus (p = 0,01). B) Histologisk analyse av lungesvulster av kontroll som ble behandlet bare med den utforme kjøretøyet og DPT-C9-behandlede mus. C) DPT-C9 ble administrert IP som for K-Ras
LA1 modell i mus med xenopodet mus PyMT brystsvulster, med en betydelig TGI på 46% etter 11 dager med behandling i forhold til å styre mus behandlet med formulere kjøretøy.
