Abstract
Bakgrunn
kreft i urinblæren er ofte et resultat av eksponering for kjemiske karsinogener som sigarettrøyking. På grunn av histologisk likhet, ble kjemisk-indusert gnager kreft modell i stor grad brukes for menneske blærekreft studier. Tidligere undersøkelser har antydet at nikotinamid, vannløselig vitamin B3, kan spille en nøkkelrolle i kreftforebygging gjennom sin virksomhet i mobilnettet reparasjon. Men til dags dato, bevis mot å identifisere de genetiske endringer av nikotinamid i kreftforebygging ikke har blitt gitt. Her søker vi etter de molekylære signaturer av kreftforebygging ved nikotinamid hjelp av en N-butyl-N- (4-hydroksybutyl) -nitrosamine (BBN) indusert kreft i urinblæren modell i mus.
metodikk /hovedfunnene
Via microarray gene expression profilering av 20 mus og 233 mennesker blære prøvene, utførte vi ulike statistiske analyser og immunhistokjemisk farging for validering. Uttrykket mønstre av 893 gener assosiert med nikotinamid aktivitet i kreftforebygging ble identifisert ved microarray dataanalyse. Gene nettverk analyser av disse 893 gener avslørte at
Myc Hotell og tilhørende genene kan være den viktigste regulatoren av forebygging blærekreft, og genuttrykket signatur korrelert godt med protein expression data. Sammenligning av genekspresjon mellom menneske og mus avslørte at BBN-induserte mus blærekreft oppviste genekspresjonsprofiler som var mer lik de av invasive humane blære kreft enn for de av ikke-invasive humane blærekreft.
Konklusjoner /betydning
Denne studien viser at nikotinamid spiller en viktig rolle som en chemo-forebyggende og terapeutisk middel i blærekreft gjennom regulering av
Myc
onkogene signatur. Nikotinamid kan representere et lovende terapeutisk modalitet hos pasienter med muskel-invasiv blærekreft
Citation. Kim SK, Yun SJ, Kim J, Lee OJ, Bae SC, Kim WJ (2011) Identifisering av Gene Expression Signatur Modulert av nikotinamid i en mus blærekreft Model. PLoS ONE 6 (10): e26131. doi: 10,1371 /journal.pone.0026131
Redaktør: Ilya Ulasov, University of Chicago, USA
mottatt: 02.06.2011; Godkjent: 20 september 2011; Publisert: 10. oktober 2011
Copyright: © 2011 Kim et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av Basic Science Research Program gjennom National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av departementet for utdanning, vitenskap og teknologi (2011-0001042 og R16-2003-002-01001-02006). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Mange blære kreft kan være knyttet til kjemiske karsinogener, og i vestlige populasjoner omtrent en tredjedel til halvparten av blære kreft er forbundet med sigarettrøyking [1], [2]. Selv om den utløsende stoff i sigarettrøyk ennå ikke er identifisert, er α- og β-naphthylamine mistenkt agenter. Som mulige kreftfremkallende for blærekreft, kan aromatiske aminer så som β-naftylamin, 4-aminobifenyl, benzidin, og 2-amino-1-naftol utgjør opp til 20 til 30% av blærekreft tilfeller [3], [4]. Det er to primære kjemisk-induserte modeller av kreft i urinblæren hos gnagere, som induseres ved administrering av N-butyl-N- (4-hydroksybutyl) -nitrosamine (BBN) i enten mus eller rotter [5], [6]. De resulterende svulster er histologisk ligner på sykdom hos mennesker, og er manifestert gjennom to ulike kreftfremkallende veier; nemlig, ikke-muskel-blærekreft (NMIBC) hos rotter og muskel-blærekreft (MIBC) hos mus [7], [8]. Fordi human blærekreft er ofte et resultat av eksponering for kjemiske karsinogener, disse gnagermodeller er nyttig for å forstå human blærekreft. Williams et al illustrert den generelle genekspresjonsprofiler fra gnagere tumorer og gitt en liste av gener som er sannsynlige kandidater for kjøring blærekreft utvikling og progresjon [9].
Nikotinsyre er et vannløselig vitamin som tilhører vitamin B-familien. Det finnes i mange dyr og plantemateriale, og har antihyperlipidemiske aktivitet. I kroppen blir nikotinsyre omdannes til sin aktive form nikotinamid, som er en komponent av koenzymer nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD) og dets fosfat form, NADP. Disse koenzymer spiller en viktig rolle i vev åndedrett og i glykogen, lipid, aminosyre, protein og purinmetabolismen. Aktuell forskning tyder på at nikotinamid, eller vitamin B3, kan spille en nøkkelrolle i kreftforebygging gjennom sin virksomhet i mobilnettet reparasjon. Ledende forskere som studerer nikotinamid ernæring mener vitamin viser løfte om å behandle og selv forebygge kreft. Myron et al viste at celler utarmet av nikotinamid utvikle kreft ti ganger raskere enn de som får tilstrekkelige mengder av vitamin [10]. Kosthold er en viktig faktor i forekomsten av blærekreft, med både effekt og komponenter, og nikotinamid er en av de gunstige komponenter. Skjønt den optimale dose av nikotinamid er fortsatt ikke bestemt, er nikotinamid også en lovende supplement til kjemoterapi på grunn av sitt forhold til tumor nekrose (drepe) faktor, en forholdsvis ny faktor som selektivt dreper kreftceller [11], [12], [13] . I denne studien, søkte vi identifisere de genetiske signaturer av nikotinamid i kreftforebygging ved hjelp av en BBN-indusert mus blærekreft modell, og undersøkt muligheten effekt av nikotinamid behandling i blærekreftpasienter.
Materialer og metoder
Mus vevsprøver
Dyrestudier studier~~POS=HEADCOMP ble gjort i samsvar med retningslinjene i Institutional Animal Care komité Chungbuk National University (tillatelse numre: CBNUA-030-0901-02). Hunn C3H /He-mus ble oppnådd fra Japan SLC, Inc. (Shizuoka, Japan) ved 6 ukers alder og ble holdt i bur (fem per bur). Dyrene ble holdt i et opplyst rom i 12 timer hver dag, holdt ved 23 ± 2 ° C og 55% ± 5% fuktighet. BBN ble oppnådd fra Tokyo Kasei Kogyo Co. (Tokyo, Japan), og nikotinamid ble kjøpt fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). BBN ble fortynnet med vann til en endelig konsentrasjon på 0,05%. For analyse av de forebyggende virkninger av nikotinamid, ble drikkevann supplert med 0,1%, 0,25%, 0,5% eller 1% nikotinamid med eller uten 0,05% BBN i 20 uker. Alle mus som mottok den første behandling ved 7 ukers alder og ble avlivet ved 20 uker etter den første behandling. Ved obduksjon ble urinblæren hos mus oppblåst med normal saltløsning og deretter fjernet, og under et høy-intensitet lys ble kontrollert for store lesjoner. Etter inspeksjonen ble alle blærer frosset for histopatologisk undersøkelse og påfølgende molekylære analyser. En porsjon av hvert vev ble fiksert og behandlet for rutinemessig parafin innebygging, kuttet i 5-um seksjoner, og montert for hematoxylin og eosin farging for histopatologi. Blæretumorer ble klassifisert i NMIBC og MIBC basert på omfanget av invasjon i muskelen.
RNA-ekstraksjon, microarray eksperimenter, og databehandlings
Total RNA ble isolert ved anvendelse av TRIzol-reagens (Life Technologies, NY) i henhold til produsentens protokoll. Kvaliteten og integriteten av RNA ble bekreftet ved agarosegelelektroforese og etidiumbromidfarging, etterfulgt av visuell undersøkelse under ultrafiolett lys. Fem hundre nanogram av total RNA ble benyttet for merking og hybridiseringen, i henhold til produsentens protokoller (Illumina mus 6 BeadChips, versjon 1.0). Arrays ble skannet med en Illumina Bead Array Reader konfokal scanner (BeadStation 500GXDW, Illumina, Inc., San Diego, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. Etter skanning, ble microarray data filtrert ved påvisning
P
-verdi (
P
0,05) som ble gitt av Genome Studio
TM programvare (Illumina, Inc., San Diego , CA) og ble normalisert ved hjelp quantile normalisering i R språkmiljø (versjon 2.10.0, tilgjengelig på https://www.r-project.org/). Målt genekspresjon verdier ble log2 transformert og median-sentrert over gener og prøver. Den fulle microarray datasettet er tilgjengelig i National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO) offentlig database under dataseriene sjonsnummer GSE21636. All microarray data er minimum informasjon om en microarray Experiment (MIAME) kompatibel.
Menneskelig blærekreft mikromatriser
For komparativ analyse av mus og menneskelig kreft, brukte vi en tidligere publiserte data satt av menneskelig blære kreft mikromatriser (koreansk kohort), GSE13507, fra NCBI GEO offentlige databasen [14]. Datasettet besto av 165 primær blærekreft prøver (103 NMIBCs og 62 MIBCs), 58 prøver av histologisk normale utseende omkringliggende vev, og 10 normal blære slimhinner fra pasienter med godartede sykdommer. Disse genekspresjonsdata ble bygget på Illumina HumanWG-6 BeadChips (versjon 2). For ytterligere validering, vi også brukt et annet menneske blærekreft datasett (spansk kohort, Affymetrix U133A Genechip), som besto av 24 NMIBCs, 66 MIBCs, og 38 normale blæren slimhinner [15].
Sanntids revers transkriptase polymerase kjedereaksjon (RT-PCR) analyse
RT-PCR ble utført ved hjelp av en Rotor Gene 6000 PCR system (Corbett Research, Mortlake, Australia). RT-PCR reaksjoner i mikro-reaksjonsrørene (Corbett forskning) inneholdt primere og SYBR Premiks EX Taq (Takara Bio Inc., Otsu, Japan). Spektrale data ble tatt og analysert ved hjelp av Rotor-Gene Real-Time Analysis Software 6.0 Build 14 (Corbett Research). Genekspresjon ble normalisert til
GAPDH
uttrykk.
Immunhistokjemisk analyse
Immunhistokjemisk farging ble utført på formalinfiksert, parafininnstøpte eksemplarer av mus normal og svulst blærer. Seksjoner ble inkubert med primære antistoffer anti-Myc (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, California) og anti-Pmp22 (Abcam, UK). For automatisert farging, Benchmark XT Autostainer (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) ble brukt. Etter farging, vurderte vi både fargeintensitet og andel av farget epitelceller. Fargeintensitet ble klassifisert som følger: 1, svak; 2, moderat; og 3 = sterk. Andelen av positive celler ble uttrykt som en prosentandel av det totale antall epitelceller som ble undersøkt, og som er tilordnet en av fem kategorier: 0, mindre enn 5%; 1, 5-25%; 2, 26-50%; 3, 51-75%; og 4, 75%. Poeng for prosentandelen av positive celler og fargeintensitet ble multiplisert sammen for å produsere immunoreaktiviteten score (IS) for hver prøve. Det er av Myc og Pmp22 ble målt i kjernen og cytoplasmaet, respektivt. Hver prøve ble undersøkt og scoret separat av tre etterforskere, og avvikende score ble diskutert før avtalen ble nådd.
Western blot analyse
Etter skylling i destillert vann, prøver i glassrør som inneholder 1 ml cellelyseringsbuffer ble mekanisk homogenisert med en vevshomogenisator. Homogenatet ble overført til et 1,5 ml rør og ble sentrifugert ved 14 000 rpm i 5 minutter ved 4 ° C. Den øvre vandige fasen ble fjernet og blandet med 2ul av fenylmetylsulfonylfluorid, og 200 pl av protein-analyse-buffer. Etter inkubasjon i 1 time ved 4 ° C, ble prøvene sentrifugert ved 14.000 rpm i 30 minutter ved 4 ° C. Den øvre vandige fasen ble overført til et nytt rør og lagret ved -80 ° C inntil bruk. Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved Bio-Rad proteinanalyse (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Hver prøve (70 ug) ble applisert på 10% (vekt pr volum) natriumdodecylsulfat-gel og overført til polyvinylidenfluorid membran (GE Healthcare, San Antonio, TX). Western blot ble analysert med antistoffer mot Pmp22 (Abcam, Cambridge, UK) og Myc (Life biovitenskap, Seattle, WA).
Statistisk analyse
For å sammenligne de molekylære egenskaper mellom ulike muse grupper, vi utførte en hierarkisk clustering analyse. En hierarkisk clustering algoritmen ved å bruke sentrert korrelasjonskoeffisienten som mål på likheten og gjennomsnittlig klynger binding, ble påført som beskrevet i Eisen et al [16]. Vi identifiserte gener som var forskjellig uttrykt mellom to grupper bruk av et tilfeldig varians to-utvalgs t-test [17]. Genene ble ansett for å ha statistisk signifikante forskjeller i ekspresjon hvis P-verdien var mindre enn 0,001. Vi utførte også en global test av hvorvidt uttrykket profiler varierte mellom klassene ved å utføre permutasjoner. For hver permutasjon,
P
-verdier ble gjen beregnet og antall gener signifikant på 0,001 nivå notert. Andelen av permutasjoner som resulterte i minst like mange betydelige gener som selve dataene ble tatt som signifikansnivå på det globale testen. Mens skaffe differensielt uttrykk gener, har vi valgt gener som hadde en 1,2 ganger eller mer forskjell på bety uttrykk verdier av to grupper.
For å utforske forholdet mellom tumorigen gener som besvarte nikotinamid, undersøkte vi funksjonelle assosiasjoner mellom gener og genererte genet nettverk basert på om de hadde mer sammenhengende gener enn det som forventes å oppstå ved en tilfeldighet. Betydningen av hvert nettverk ble estimert ved hjelp av scoring system levert av oppfinnsomhet Pathway Analysis Tool (versjon 7.5). Poengene ble bestemt av antall differensielt uttrykte gener innenfor hvert av nettverkene og styrken av foreningene blant nettverkets medlemmer.
Som et middel for å sammenligne genuttrykksmønster mellom menneskelige og mus prøver, microarray data av musemodeller ble slått sammen med den datasettet av humane blære- kreft ved hjelp av HomoloGene (NCBI), et system for påvisning av homologe gener i flere eukaryotiske genomer [18]. Før integrering av de to datasettene ble de ekspresjonsnivåene av hvert gen i hvert datasett standardisert uavhengig av hverandre, til et gjennomsnitt på null og et standardavvik på 1. For å forutsi musemodeller mot humant vev, vi anvendt fire forskjellige prediksjonsmodeller: Forbindelse kovariat Predictor [19], lineær discriminator analyse [20], nærmeste Tyngdepunktet klassifisering [20], og støttevektormaskiner [21]. Modellene innarbeidet gener som var forskjellig uttrykt mellom de to klasser ved hjelp av en to-utvalgs t-test. Gener ble ansett for å ha statistisk signifikante forskjeller i uttrykk hvis
P
-verdi var mindre enn 0,001. Vi har beregnet den prediksjonsfeil av hver modell ved hjelp av leave-on-out kryssvalidering (LOOCV), som beskrevet av Simon et al [22]. For hvert LOOCV treningssettet, ble hele modellbygging prosedyre gjentatt, inkludert genet utvelgelsesprosessen. Cross-arter prediksjon prosedyren ble utført i BRB ArrayTools (versjon 3.8.0).
Resultater
Effekten av nikotinamid som et beskyttende middel mot BBN-indusert mus blærekreft
for å undersøke effekten av nikotinamid på tumordannelse i BBN-indusert blærekreft modell, fikk musene 0,05% BBN alene eller BBN pluss økende konsentrasjoner av nikotinamid i drikkevannet i 20 uker (figur 1A). Merkbart, nikotinamid tilskudd hemmet tumordannelse. Tilskudd med 0,5% nikotinamid redusert tumordannelse forholdet fra 100% til 74%, og 1% nikotinamid redusert forholdet ytterligere, til 52% (figur 1B). Histologisk analyse av blæretumorer fra de forskjellige behandlingsgruppene viste at utviklingen av MIBC ble markert inhibert av nikotinamid. Behandling med 0,1% nikotinamid reduserte forekomsten av MIBC 88-42%, og 1% nikotinamid redusert den ytterligere, til 12% (figur 1 B), noe som indikerte at nikotinamid sterkt hemmer blæretumorprogresjon. Tumor volum var også bemerkelsesverdig redusert med nikotinamid. De fleste av de BBN-behandlede mus utviklet store tumorer (gjennomsnittlig størrelse og 129 mm
3). Økning av behandling av nikotinamid betydelig redusert gjennomsnittlig tumorstørrelse (99 til 18 mm
3 når 0,1 til 1% nikotinamid ble behandlet, figur 1C). Resultatene viste at nikotinamid forhindrer effektivt tumordannelse og undertrykker tumorvekst og progresjon til MIBC.
(A) Eksperimentell protokoll for analyse av den forebyggende virkningen av NC. Mus ble behandlet med BBN alene eller i kombinasjon med de angitte mengder av NC i 20 uker. «N» indikerer antall mus i hver gruppe. En dose på 0,1% NC i drikkevann tilsvarer omtrent 100 mg /kg /dag. (B) Oppsummering av forekomsten av tumordannelse, ikke-muskel invasiv blærekreft (NMIBC), og muskel invasiv blærekreft (MIBC) for hver behandlingsgruppe. Tallet over hver søyle viser antall mus i hver histologiske kategori. (C) Et boksplott å sammenligne tumorvolumer av behandlingsgruppene.
P
-verdier ble innhentet av to utvalgs t-tester mellom gruppe G1 og andre grupper.
Differensial genuttrykksmønster blant eksperimentelle grupper
For å karakterisere genutrykksmønster av nikotinamid i kreftforebygging, vi tilfeldig velge 20 mus blærer og utført en genuttrykk profilering; fem BBN-induserte mus blæretumorer (MIBCs fra gruppen G1, figur 1A), fem ikke-tumorbærende blærer behandlet med BBN og nikotinamid (normale prøver fra gruppe G5, figur 1A), fem normale blærer behandlet med 1% nikotinamid (Group G6 i figur 1A), og fem normale blærer uten behandling (Gruppe G7 i figur 1A). De 5 prøver i hver gruppe var histologisk identisk hverandre. Vi først brukt hierarkisk clustering analyse av genuttrykk mønstre for å vurdere de molekylære egenskapene til de ulike forsøksgrupper. Som forventet, hierarkisk clustering analyse av genekspresjon data fra alle vev ga tre hovedklyngene, en som representerer den normale blæren, en andre representerer BBN-induserte mus blære tumor-gruppe, og en tredje som representerer BBN + nikotinamid-behandlet ikke-tumorigene blære gruppe (Figur S1). Dermed genuttrykksmønster reflekterer den molekylære konfigurasjon er lett gjenkjennelig mellom blæren svulster og ikke-tumorvev.
siden forsøkte å identifisere genet sett som ble forskjellig uttrykt blant de tre ulike grupper. Før analysen ble normal blærer behandlet med nikotinamid utelukket, siden det var ingen histopatologiske eller molekylære forskjeller mellom normal og nikotinamid-behandlet blære (figur S1). Vi søkte Venn-diagram sammenligning av to gen lister å velge genuttrykksmønster felles for kreftutvikling og forebygging kreft. Først genererte vi to forskjellige gener lister ved å bruke de to-utvalgs t-test (figur 2A,
P
0,001). Gene liste A representerer gener som var forskjellig uttrykt mellom normal blære og BBN-indusert tumorgrupper, og genet liste B representerer gener som var forskjellig uttrykt mellom BBN- og BBN + nikotinamid-behandlede grupper. Når man sammenligner de to genet listene, ble tre ulike mønstre observert: A ikke B (3,344 gener), A og B (893 gener), og B ikke et (1,115 gener) (figur 2B). Gener i A ikke B-kategorien viste BBN-indusert tumorspesifikke uttrykk mønstre, mens gener i B ikke en kategori vises de uttrykk mønstre av gener som besvarte nikotinamid. Gener i A- og B-kategorien oppviste både BBN-indusert tumorigen samt nikotinamid-responsive uttrykk mønstre. Disse resultatene betydde at 893 gener i A- og B-kategorien var felles for begge kreft indusert av BBN og kreft forebygging indusert av nikotinamid.
(A) Venn-diagram av gener som er valgt av to-utvalgs t-test i musemodell. Den lilla sirkel (gen liste A) representerer gener differensielt uttrykte mellom normale blære vev og N-butyl-N- (4-hydroksybutyl) -nitrosamine (BBN) -indusert blæretumorer. Den blå sirkelen (genet liste B) representerer gener differensielt uttrykt mellom BBN-indusert blæren svulster og BBN + nikotinamid (NC) behandlet ikke-tumorvev. Vi søkte en cut-off
P
-verdi på mindre enn 0,001 for å velge gener hvis uttrykk var signifikant forskjellig mellom de to gruppene. (B) Expression mønstre av utvalgte gener i Venn-diagram. Blant de genene i A ikke B-kategorien, 1,525 gener (45,6%) viste opp ned mønstre og 1.819 gener (54,4%) viste down-up mønstre i normal og BBN-indusert kreft. I A- og B-kategorien, 290 gener (32,5%) og 603 gener (67,5%) representert ned-opp-ned-mønster og opp-ned-opp mønstre, henholdsvis i normal, BBN-indusert kreft, og BBN + NC- behandlede blære grupper. I B vises ikke en kategori, 606 gener (54,3%) ned-opp mønstre og 509 gener (45,7%) viste opp-ned-mønster i BBN-indusert kreft og BBN + NC-behandlede blære grupper. Dataene er presentert i matriseformat hvor p representerer enkeltgener, og kolonnene representerer hvert vev. De røde og grønne farger reflekterer høye og lave nivåer, henholdsvis.
Biologisk innsikt til genuttrykksmønster for kreftforebygging
For å identifisere de dominerende signalnettverk aktive i forebygging av blærekreft med nikotinamid, gene nettverk analyse av de 893 genene i kreft forebygging signatur (figur 2) ble utført ved anvendelse av oppfinnsomhet
TM Pathways Analysis programvare. Av de 893 genene, 477 ble kartlagt til genet nettverk definert av dette verktøyet. Denne analysen viste en serie av antatte nettverk og tilknyttede funksjonelle kategorier. De 10 putative nettverk med høyest score er oppført i tabell S1 og deres tilhørende funksjoner er vist på fig S2.
Som forventet, gener som er involvert i karsinogenisitetsstudier-relaterte funksjoner så som cellulær vekst og proliferasjon, kreft, celledød , og DNA-replikasjon og ordet -reparasjon ble beriket, og gir tillit til våre resultater. Vi fant også at gener som er involvert i inflammatoriske respons, celle-mediert immunrespons, infeksiøs sykdom, inflammatorisk sykdom og immunologisk sykdom var også tilstede i et betydelig antall. Interessant nok var en betydelig mengde av gener involvert i skjelett /muskel systemutvikling og skjelett observert (Figur S2).
Undersøkelse av beriket genene avdekket flere viktige signalnettverk (Tabell S1), det mest slående som viste dominerende aktivering av
Myc
, en av de onkogene signaturer (figur 3).
Myc
dannet primære navet av genet nettverket med høyest tilkobling til resten av genene i nettverket, noe som tyder på at
Myc
kan være en kritisk faktor i både molekyl karsinogenese indusert av BBN og kreft forebygging indusert av nikotinamid. Mange av satellitt gener knyttet til
Myc plakater (dvs.
MSH6 product: [
Msh6
],
METAP2 product: [
Metap2
]
LMNB1 product: [
Lmnb1
],
HK2 product: [
HK2
],
PPAT product: [
Ppat
],
PGK1 product: [
Pgk1
],
CCT2 product: [
Cct2
], og
PMP22 product: [
Pmp22
]) (figur 3) deltar i tumorgenese, celleproliferasjon, cellevekst, eller apoptose, som svarer til de mest kjente aktivitetene til
Myc
. Disse funnene sterkt indikerte at onkogene funksjon av
Myc Hotell og tilhørende genene kan reguleres ved nikotinamid behandling for å hindre blæren kreftutvikling.
Opp- og ned-regulerte gener i mus blære kreft er angitt i rødt og grønt, respektive. Intensiteten av fargen er en indikasjon på graden av over- eller under uttrykk. Gener uten markert farge er ikke en del av progresjon signatur, men er forbundet med de regulerte gener. Hver linje og pil representerer funksjonelle og fysiske interaksjoner mellom gener og retning av regulering rapportert i litteraturen.
Validering av
Myc
signatur for kreftforebygging ved nikotinamid
for å validere vår nylig identifiserte genuttrykk signatur for kreftforebygging ved nikotinamid, vi i tillegg gjennomført genekspresjon og proteiner uttrykk analyser. Blant de genene i
Myc
signatur identifisert av genet nettverksanalyse (figur 3),
Myc
som en primær hub onkogen og
Pmp22
som en svulst undertrykt gen som har den sterkeste signalintensiteten ble valgt for validering, og resultatene er presentert i Tabell 1 og Figur 4.
Sanntids revers transkriptase-polymerase kjedereaksjon ble utført (RT-PCR) -analyse for
Myc
(A) og
Pmp22 product: (B). Forskjeller (
P
verdier) mellom musegruppene ble innhentet av to-utvalgs t-test. Y-aksen indikerer (uttrykk forhold på hvert gen /
GAPDH
) x 1000. Immunhistokjemisk analyse av Myc (C) og Pmp22 (D) ble utført for å bekrefte protein ekspresjonsnivåer. Påvisning av Myc (E) og Pmp22 (F) protein uttrykk ble også bestemt ved Western blot analyse.
Vi urfremført genekspresjonsanalyse ved RT-PCR. Uttrykket nivåer av
Myc
i BBN-indusert blærekreft gruppe var betydelig høyere enn normalt eller BBN + nikotinamid-behandlede grupper (
P
0,001 og p = 0,02 etter to sample t- test henholdsvis figur 4, A). På den annen side er ekspresjonsnivåene av
Pmp22
i BBN-indusert blærekreft gruppen ble betydelig redusert sammenlignet med normal eller BBN + nikotinamid-behandlede grupper (
P
= 0,02 og P = 0,03 av to utvalgs t-test henholdsvis figur 4 B).
For å avgjøre om genuttrykk signatur identifiserte vi enig med protein uttrykk nivåer, ble immunhistokjemisk analyse utført. Vi har observert at Myc ble sterkt uttrykt i cytoplasma av normale mus urothelium celler, men ble ikke uttrykt i kjernen. Myc var hovedsakelig lokalisert til kjernen av tumorcellene i BBN-induserte mus blære tumor. Både en kjernefysisk og en cytoplasma fordeling av Myc ble observert; imidlertid antallet Myc-positive kjerner i mus urothelium behandlet med BBN og nikotinamid var betydelig lavere enn i den BBN-indusert blæretumor, og cytoplasmatisk fargeintensiteten av Myc i enten BBN gruppe var svakere enn den som i normal urothelium (figur 4, C og tabell 1). Vi fant også at Pmp22 ble distribuert i cytoplasma av normal mus urothelium, mens det var ingen tegn på enten cytoplasma eller kjernefysisk uttrykk for Pmp22 i BBN-indusert mus blære svulst. I BBN + nikotinamid-behandlet urothelium ble cytoplasma Pmp22 uttrykk observert; ble imidlertid nivået av Pmp22 uttrykk redusert i forhold til at det i normal urothelium (figur 4, D og tabell 1).
Vi utførte også vestlige blotter for Myc og Pmp22 å strengt kontrollere vår genuttrykk profilering analyse. På western blot-analyse ble Myc sterkt uttrykt i BBN-induserte mus blære tumor gruppe i forhold til normalen og BBN + nikotinamid-behandlet ikke-tumorigen blære gruppe, men Myc uttrykk viste ingen forskjell mellom normal og BBN + nicotinamide- behandles ikke-tumorigen blære gruppe. På den annen side, Pmp22 ekspresjonsnivået i normal blære gruppe var signifikant høyere enn i den BBN-induserte mus blære tumor gruppe. Selv om Pmp22 ekspresjon ble observert i BBN + nikotinamid-behandlet ikke-tumorigen blære gruppe, ble nivået av ekspresjon Pmp22 redusert i forhold til det i det normale. Disse resultatene indikerer at endringer i protein expression nivåer av
Myc
og tilhørende genene enige godt med endringer i genuttrykk nivåer avslørt av microarray analyse. Resultatene også gitt sterke bevis for påliteligheten av genekspresjon signaturen identifikasjon.
Sammenligning av genekspresjon mellom humane og mus blærekreft
Gitt de tre distinkte undergrupper av mus eksperimentell modell, vi undersøkt hvor godt disse modellene rekapitulere menneskelige blærekreft fenotyper som definert av genuttrykksmønster. Fordi to forskjellige microarray plattformer ble brukt til å studere mus og human blærekreft (koreansk kohort), valgte vi homologe gener som var til stede i begge mikromatriser bruker HomoloGene, som ga informasjon om homolog mus og menneskelige gener. Totalt 11,565 homologe gener var til stede i begge mikromatriser. Ved hierarkisk clustering analyse av de integrerte data, ble de tre undergrupper godt atskilt fra hverandre (figur 5). Med unntak av bare en mus prøven, de genuttrykksmønster i blæren i normale mus og BBN + nikotinamid-behandlede mus var veldig lik de i normal slimhinne eller slimhinne rundt (ved siden av) kreft hos mennesker (klynge I i figur 5). I motsetning til dette uttrykk mønstre av mus blærekreft fra BBN-indusert tumor gruppe var meget lik de MIBCs hos mennesker (cluster-III i figur 5).
Gener med ekspresjonsvektorer for arbeidsplass som hadde et standard avvik på minst 0,9 ble valgt for hierarkisk analyse (1,059 gen funksjoner). De røde og grønne farger reflekterer høye og lave nivåer, henholdsvis. BBN, NC, NMIBC, og MIBC indikere N-butyl-N- (4-hydroksybutyl) -nitrosamine, nikotinamid, ikke-muskel invasiv blærekreft, og muskel invasiv blærekreft, henholdsvis.
neste søkt tilsyn læringsmetoder for å validere uten tilsyn klyngeanalyse. Vi søkte fire uavhengige prediksjon metoder for å finne ut hvilke av musemodeller beste kan etterligne den menneskelige fenotyper. Vi brukte genuttrykk datasett fra de to undergrupper av menneske blærer å trene prediksjon metoder (Normal vs. MIBC, NMIBC vs. MIBC, og Normal vs. NMIBC). Alle prediksjon metoder forutsa at de normale og BBN + nikotinamid-behandlede mus blærene er relativt lik normal slimhinne eller slimhinnen rundt (ved siden av) kreft hos mennesker, mens BBN-induserte mus blærekreft er relativt lik MIBC i human (tabell 2) . I tillegg, når vi søkte prediksjon metoder trente med NMIBCs og MIBCs, observerte vi at alle BBN-induserte mus blærekreft ble spådd som MIBC (tabell 2). Videre, ved anvendelse prediksjon metoder trent med normal og NMIBCs, de fleste BBN + nikotinamid-behandlede mus blærene var relativt lik normal slimhinne eller slimhinnen rundt (ved siden av) kreft hos mennesker (tabell 2).
