Abstract
Bakgrunn
Kreft i bukspyttkjertelen er den fjerde største årsaken til kreftdød i vestlige land, med lavest 1-års overlevelse blant vanligvis diagnostisert kreft. Pålitelige biomarkører for kreft i bukspyttkjertelen diagnose mangler og er sterkt behov for å tillate kurativ kirurgi. Som mikroRNA (miRNA) nylig dukket opp som kandidat biomarkører for denne sykdommen, vi utforsket i den nåværende pilotstudie forskjeller i spytt mikroRNA profiler mellom pasienter med bukspyttkjertelsvulster som ikke er kvalifisert for kirurgi, forstadier til kreft, betennelsessykdom eller kreft-fri pasienter som en potensiell tidlig diagnostisk verktøy.
Metoder
Hele spyttprøver fra pasienter med kreft i bukspyttkjertelen (n = 7), pankreatitt (n = 4), IPMN (n = 2), eller friske kontroller (n = 4) ble oppnådd i løpet av endoskopisk undersøkelse. Etter total RNA isolering, ble uttrykket av 94 kandidat mirnas skjermet av q (RT) PCR Biomark Fluidgm. Menneske avledet kreft i bukspyttkjertelen celler var xenopodet i atymiske mus som en eksperimentell modell for kreft i bukspyttkjertelen.
Resultater
Vi identifiserte HSA-MIR-21, HSA-MIR-23a, HSA-speil 23b og MIR-29c som blir betydelig oppregulert i spytt av kreft i bukspyttkjertelen pasienter sammenlignet med kontroll, viser sensitivitet på 71,4%, 85,7%, 85,7% og 57%, henholdsvis og utmerket spesifisitet (100%). Interessant, HSA-MIR-23a og HSA-miR23b overexpressed i spyttet til pasienter med bukspyttkjertelkreft forstadier. Vi fant at HSA-MIR-210 og la-7c er overuttrykt i spyttet hos pasienter med pankreatitt, sammenlignet med kontrollgruppen, med sensitivitet på 100% og 75%, og spesifisitet på 100% og 80%, respektivt. Siste HSA-MIR-216 ble oppregulert hos kreftpasienter, sammenlignet med pasienter diagnostisert med pankreatitt, med sensitivitet på 50% og spesifisitet på 100%. I eksperimentelle modeller av PDAC, forut spytt mikroRNA deteksjon systemisk påvisning av kreftceller markører.
Konklusjoner
Våre nye funn tyder på at spytt miRNA er diskriminerende i bukspyttkjertelen kreftpasienter som ikke er kvalifisert for kirurgi. I tillegg har vi demonstrere i eksperimentelle modeller som spytt miRNA deteksjon forut systemisk påvisning av kreftceller markører. Denne studien stammer for bruk av spytt miRNA som biomarkør for tidlig diagnostisering av pasienter med inoperabel kreft i bukspyttkjertelen
Citation. HUMEAU M, Vignolle-Vidoni A, Sicard F, Martins F, Bournet B, Buscail L, et al. (2015) Spytt mikroRNA i bukspyttkjertelen kreftpasienter. PLoS ONE 10 (6): e0130996. doi: 10,1371 /journal.pone.0130996
Redaktør: Kandiah Jeyaseelan, National University of Singapore, SINGAPORE
mottatt: 10 desember 2014; Godkjent: 27 mai 2015; Publisert: 29 juni 2015
Copyright: © 2015 HUMEAU et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
finansiering:.. Disse forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
Konkurrerende interesser: forfatterne har innlevert en patent på «bruk av spytt mikroRNA for å diagnostisere kreft i bukspyttkjertelen «. Et utkast er skrevet i samarbeid med våre IP avdeling (INSERM Transfert), og deponert under # EP15305020.8 men er ennå ikke tilgjengelig på nettet. Likevel, dette betyr ikke endre forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. Forfatterne har ikke andre relevante erklæringer knyttet til sysselsetting, rådgivning, patenter, produkter under utvikling eller endrede produkter.
Innledning
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (kreft i bukspyttkjertelen, PDAC) er den fjerde ledende årsaken til kreftdød i vestlige land, med de laveste fem-års relativ [1] og 1-års overlevelse [2] rentene hos vanligvis diagnostisert kreft. kreft i bukspyttkjertelen er forventet å flytte til den nest største årsaken til kreft dødsfall på verdensbasis innen 2020 i fravær av forbedringer i behandlingen [3]. Det er foreløpig ingen midler for pålitelig diagnose av forstadier til kreft i bukspyttkjertelen. Følgelig er det store flertallet av pasientene (85%) viser en fremskreden sykdom som resulterer i en lav reseksjon sats (15% av pasientene) som fører til en total sturen median overlevelse av 4 til 6 måneder. Dermed kan oppdage biomarkører for tidlig kreft i bukspyttkjertelen diagnose favorisere tidlige pasienter ledelse og prognose.
microRNAs (mirnas) har nylig dukket opp som en ny klasse av robuste biomarkører for kreftdiagnostikk, inkludert PDAC [4]. Disse potente regulering av gen-ekspresjon kan bli grundig kvantifiseres i diverse vev og væsker, på grunn av deres iboende høy stabilitet i forhold til proteiner og messenger RNA. Av betydning, kan mirnas kvantifiseres i svært lave mengder materiale, inkludert mikro biopsier, og i svært nedbrutte prøver. Nye rapporter grundig demonstrert at miRNA profiler kan lykkes diskriminere normal fra kreft i bukspyttkjertelen vev, og kan også forutsi kreft prognose eller respons på behandling [4]. Stabiliteten miRNAs har vært nok en gang understreket som miRNA profilering i plasma ble nylig demonstrert for å skille PDAC pasienter fra friske kontroller [4]. Slike funn bane vei for bruk av sirkulerende mirnas som minimalt-invasiv PDAC biomarkører.
Flere andre kroppsvæsker som urin, sæd og spytt har nylig vært ansett som repositories for kreftdiagnose [5,6]. Spytt har overlegen fordel som prøvetaking er enkel, ikke-invasiv, forårsaker lite engstelse hos pasienter, og kan gjentas. Spytt har vist seg å inneholde proteiner /peptider, nukleinsyrer, elektrolytter, og hormoner som stammer fra både lokale og systemiske kilder og senere studier har ført til interesse for bruk av spytt som en kilde av biomarkører. Følgelig har bruken av spytt for deteksjon av orale sykdommer blitt grundig demonstrert [7], og spytt nylig dukket opp som en rik kilde for mirnas, som har-MIR-31, for oral kreftdiagnostikk [8-11]. På den annen side, er i stor grad uklar spytt anvendelse for systemisk sykdom. I de senere årene, metabolsk [12], transcriptomic [13] og microbiota [14] spytt profiler ble vist å ha diskriminerende effekt for påvisning av PDAC, med høy spesifisitet og sensitivitet.
Så vidt vi vet, bruk av spytt mirnas for diagnostisering av ikke resectable kreft i bukspyttkjertelen har ikke blitt rapportert til dags dato. Derfor er målet med denne studien var å utforske den vitenskapelige bevis og gi en begrunnelse for bruk av spytt for unresectable PDAC deteksjon som representerer det store flertallet av pasienter diagnostisert med denne kreftformen. I denne pilotstudien fant vi at fire spytt mirnas (HSA-MIR-21, HSA-MIR-23a, HSA-MIR-23b og HSA-MIR-29c) med hell segregerte PDAC pasienter fra kreftfrie givere, mens HSA-MIR -210 og la 7c indikere pankreatitt og HSA-MIR-216 diskriminerer pankreatitt av kreft. I tillegg viser vi her i eksperimentelle modeller av PDAC at spytt miRNA deteksjon forut påvisning av systemiske kreftceller markører. Til sammen presenterer vi foreløpige resultater som viser signifikante forskjeller i miRNA profiler mellom spytt fra pasienter med PDAC og spytt fra pasienter som er tumor-fri. De oppdaget spytt biomarkører har iboende diskriminerende potensial for en ikke-invasiv diagnostisk verktøy for PDAC, hos pasienter som ikke er kvalifisert for kirurgi.
Materialer og metoder
Pasienter
Denne protokollen var godkjent av etisk komité (
Comité de Protection des Personnes Sud-Ouest et Outre Mer N ° 1
,
antall 1-10-21
). For å unngå blodsmitte ble pasientene bedt om ikke å pusse tennene innen 45 minutter før prøvetakingen. Spytt ble samlet ved hjelp av sterile tips og mikropipetter under endoskopisk undersøkelse i narkose med propofol. Spyttet ble umiddelbart plassert i pre-kjølte 1,5 ml mikrosentrifugerør inneholdende og likt volum spytt beskytte reagens (Qiagen) og lagret ved -80 ° C inntil de er klare for bruk. I denne pilotstudien har vi inkludert pasienter i alderen 18 år som hadde gitt sitt skriftlige samtykke. Andre kriterier for inklusjon var ingen kontraindikasjoner for generell anestesi eller for endoskopisk ultralyd. Tynn nål aspirasjon materialet ble brukt for histologisk, cytologisk og molekylær (KRAS aktivering mutasjonsanalyse [15]) diagnosen pankreatitt eller kreft i bukspyttkjertelen. Tjueen pasienter ble inkludert i denne studien; 7 ble diagnostisert med lokalavansert, unresectable kreft i bukspyttkjertelen, fire fikk diagnosen pankreatitt (enten akutt eller kronisk) og 4 hadde urelaterte fordøyelsessykdommer (kontrollgruppen) (tab 1). Pasienter diagnostisert med intraductal papillær mucinkjertler neoplasi (IPMN) (n = 2) ble også inkludert. Pasientene ble ikke behandlet før spytt samling.
Eksperimentell protokoll
Alle dyr eksperimenter ble utført i henhold til de nasjonale etiske retningslinjer for eksperimentell forskning og protokoll ble godkjent av regional etisk komité Anexplo UMS 006 for dyreforsøk og ble utført i samsvar med guide for omsorg og bruk av forsøksdyr (amerikanske National Institutes of Health). Humane kreft i bukspyttkjertelen-avledet Mia PACA-2-celler som uttrykker utsondret Lucia luciferase [16,17] ble dyrket i RPMI-medium supplert med 10% føtalt kalveserum, L-glutamin, et antibiotikum, en antimykotisk cocktail (Life Technologies), og Plasmocin ( InvivoGen) i en fuktet inkubator ved 37 ° C i 5% CO
2. Seks to-ukers-gamle hunn nu /nu-mus ble bedøvet ved intraperitoneal injeksjon av pentobarbital (80 mg /kg) fortynnet i 0,9% NaCl, supplert med oral anestesi ved bruk av oksygen /isofluorane (2,5 blanding) og Mia PACA-2 Lucia-celler ble implantert i halen av bukspyttkjertelen som tidligere beskrevet [16,17]. Spyttsekresjon ble ikke stimulert av pilokarpin. Spytt ble oppnådd fra munnhulen ved mikropipette og umiddelbart plassert i pre-kjølte 1,5 ml mikrosentrifugerør inneholdende og likt volum spytt beskytte reagens (Qiagen). Samlingen ble fullført på 20 minutter, og prøvene ble lagret ved -80 ° C inntil analyse. For ikke-invasiv sporing av tumorvekst, ble blod samplet av retro-orbital innsamling og sentrifugert ved 1000 ×
g
i 10 min i Mikrosentrifugerør behandlet med EDTA. Lucia produksjonen ble målt i 5 ul plasma ved hjelp coelenterazine (50 uM) som et substrat. For miRNA kvantifisering studier ble tumorer frosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C inntil bruk. På slutten av forsøkene ble mus avlivet ved injeksjon av en dødelig dose av pentobarbital.
RNA-ekstraksjon
Før spyttprøver ble anvendt, ble de tint på is og sentrifugert i 15 minutter ved 2600 x
g
ved 4 ° C. Den cellefrie supernatant ble samlet opp fra bunnfallet og anvendt umiddelbart i det neste trinn. Total RNA ble isolert fra 250 ul supernatant og spytt fra tumorer ved hjelp av Trizol LS-reagens (Life Technologies) og miRNAeasy ekstraksjon kit (Qiagen), respektivt. DNase I-behandling (DNase I, Qiagen) ble benyttet for å fjerne kontaminerende DNA ved RNA-ekstraksjon. Konsentrasjonen av total RNA ble målt ved hjelp av Nanodrop N-100.
miRNA kvantifisering
Totalt spytt, mobilnettet eller svulst RNA (20 ng) ble revers transkribert og pre-forsterket ved hjelp av Universal cDNA syntese kit (Exiqon), etterfulgt av Spesifikk Target Amplification (STA) med TaqMan PreAmp Master Mix (Life Technologies) og samlet 94 mikroRNA LNA PCR primersett (Exiqon, oppført i S1 tabell). Etter 15 pre-amplifaction sykluser, ble STA reaksjoner fortynnet 1:10 i nuklease fritt vann. qPCR analyse Mix besto av TaqMan Gene Expression Master Mix (Life-teknologi), DNA Binding Dye Sample Loading Reagens (Fluidigm), EvaGreen (Biorad), fremover og bakover primer mix (Exiqon) og analyse Loading Reagens, og utarbeidet i henhold til produsentens anbefalinger . Prøver og prøveblandingen ble applisert på en Fluidigm brikke (Fluidgm) og kvantitativ sanntid PCR-reaksjonen ble kjørt ved 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 30 sykluser ved 95 ° C i 10 sekunder og 60 ° C i 1 minutt på Fluidigm plattform (Fluidgm). Kvantifiseringen syklus (Cq) verdi er definert som syklusen tall på fluorescensemisjonen, som overskrider den til en fast terskel. En Cq av 15 til 30 ble ansett som høyt uttrykk og en Cq av 35 vurderes som lav uttrykk. En Cq verdi mer enn 40 ble ansett som umulig å oppdage miRNA. Data normalisering ble utført med RQ leder 1.2.1 og Data Assist v3.0 fra Applied Biosystems.
Statistisk analyse
qPCR-basert genuttrykk verdier mellom de ulike gruppene ble sammenliknet med nonparametric Wilcoxon rank-sum test. Kandidat biomarkør mirnas ble deretter valgt basert på P 0,05
Resultater
Identifikasjon av kreft i bukspyttkjertelen spesifikke spytt mirnas
For denne pilotstudien, ble 94 mirnas valgt fra litteraturen som følger:. Tidligere rapportert biomarkører for kreft, tidligere rapportert biomarkører for kreft i bukspyttkjertelen, påvist i blodet hos pasienter med kreft eller påvist i spytt av pasienter med kreft (S1 tabell). Ekspresjon av kandidat mirnas ble screenet ved q (RT) PCR ved anvendelse av Biomark Fluidgm hos pasienter med kreft i bukspyttkjertelen (n = 7), pankreatitt (n = 4), intraductal papillær mucinous neoplasi (IPMN, n = 2) eller uten kreft (n = 4) (tabell 1).
av de 94 mirnas, 23 mirnas var umulig å oppdage i alle prøvene som ble testet (S2 Table). Vi fant ut at 4 mirnas (HSA-MIR-21, HSA-miR23a, HSA-MIR-23b og HSA-MIR-29c) ble betydelig uttrykt i spytt fra pasienter med kreft i bukspyttkjertelen (n = 7), mens undetectable i spyttet til kontrollpasienter (n = 4; Wilcoxon test, 0.001
p
0,03) (figur 1 og tabell 2). Uttrykket av kandidat mirnas var strengt bestemt av kreft i bukspyttkjertelen (100%) med utmerket følsomhet (varierer fra 57% til 86%, tabell 2). Kandidaten mirnas ble også påvist i spytt fra pasient diagnostisert med andre kreftformer (n = 2, tabell 2), mens HSA-miR23a og HSA-Mir-23b ble påvist i spytt av pasienter diagnostisert med IPMN, en godt karakterisert forløper lesjon av PDAC. Av notatet, HSA-MIR-21, HSA-miR23a, HSA-MIR-23b og HSA-MIR-29c kunne påvises i spytt av pasienter med pankreatitt (fig 1).
Resultatene er presentert som Whiskers boksen (min-max) og gjennomsnittlig (+) er indikert.
p
verdi (parametrisk Wilcoxon rank sum test) er indikert.
Pankreatitt er en vanlig betennelse i bukspyttkjertelen. Til tross for moderne avbildningsteknikker, problemene fortsetter å skille PDAC fra benigne sykdommer slik som kronisk pankreatitt, spesielt i sin pseudotumoral form [15]. En slik faktor er avgjørende for å unngå unødvendig reseksjon av benigne lesjoner (som for eksempel fokale lesjoner i kronisk pankreatitt eller autoimmun pankreatitt), eller for å forsinke behandling av PDAC i en undergruppe av pasienter. Vi har tidligere vist at RNA signaturer [18] eller
KRAS
mutasjon analyse [15,19] kan være nyttig for diagnostisk. I det foreliggende arbeid, utforsket vi hvorvidt spytt miRNA kan representere en ikke-invasiv metode for screening pankreatitt deteksjon. Vi fant ut at spytt HSA-MIR-216 kan hjelpe diskriminere pankreatitt fra PDAC, med utmerket spesifisitet (100%), men dårlig sensitivitet (50%) (tabell 3). På den annen side er HSA-MIR-210 og la-7c overuttrykt i spyttet hos pasienter diagnostisert med pankreatitt, men kunne ikke påvises i spyttet hos kontrollpasientene (tabell 4). I tillegg presenterer HSA-MIR-210 bemerkelsesverdig spesifisitet og sensitivitet for pankreatitt, enten kronisk eller akutt (100%, tabell 3). På den annen side ble HSA-MIR-210 påvist i spytt fra pasienter med PDAC. Til sammen tyder vår pilotstudie sterkt at spytt mirnas kan være nyttig for diagnostisering av pankreatitt og ikke resectable PDAC.
Spytt mirnas foran proteinbasert, systemisk påvisning av PDAC i eksperimentelle modeller
Vi neste undersøkt den kinetiske av spytt miRNA deteksjon i eksperimentell modell for kreft i bukspyttkjertelen. Mia PACA-2 human-avledede kreft i bukspyttkjertelen celler ble implantert i bukspyttkjertelen av atymiske mus (n = 6). Vi fant at disse cellene og resulterende xenografter uttrykker høye nivåer av HSA-MIR-21, HSA-MIR-23a, HSA-MIR-23b og HSA-MIR-29C (S3 og S4 Tables). Disse cellene ble konstruert for å uttrykke høye nivåer av utskilt luciferase for protein, systemisk-baserte, ikke-invasiv tumor overvåking [16,17]. Eksperimentelle bukspyttkjertelkreft svulster ble oppdaget 25 dager etter tumorcelle engraftment hjelp systemisk dose utskilles luciferase og før de ble følbar (fig 2).
Resultatene er gjennomsnitt ± standardavvik 6 biologiske replikater gjort i eksperimentelle triplicates. miRNA nivåer er uttrykt i CK, er Lucia nivåer uttrykt i relative lysenheter (r.l.u.). Den grå sone svarer til tumordeteksjon ved bruk av utskilt Lucia som en systemisk, proteinbasert tumormarkøren.
Interessant, HSA-MIR-21 ble lett påvist ved høye nivåer i spytt fra tumorbærende mus, så snart som 14 dager etter tumorinduksjon (bety Cq = 24,41 ± 1,29 figur 2 og tabell S5), mens påvises i spyttet hos tumorfrie dyr (data ikke vist). I tillegg forble spytt HSA-MIR-21 ekspresjon forhøyet i løpet av eksperimentet (figur 2). På den annen side ble spytt HSA-MIR-23a, HSA-MIR-23b og HSA-MIR-29c detekteres ved lave nivåer i spyttet til PDAC-bærende mus (figur 2 og S5 Table). Dermed validere vi HSA-MIR-21 som en spytt biomarkør i denne eksperimentelle modellen av PDAC; i tillegg våre resultater tyder sterkt på at spytt miRNA er mer følsomme enn systemiske protein markører for diagnostisering av bukspyttkjertelsvulster.
Diskusjoner
Et stort problem i kreft i bukspyttkjertelen forskning er behovet av biomarkører for tidlig diagnose, ikke bare for tidlig påvisning av sykdommen i kohort av pasienter, men også for å akselerere beslutningsprosesser i vanskelige å diagnostisere pankreatiske massene. Dette er svært viktig med tanke på at pasientens overlevelse og prognose være avhengig av fasen av svulsten ved diagnosetidspunktet. Teoretisk kan tidlig diagnose tillate tumorreseksjon og er vanligvis forbundet med den beste prognosen. Men vanskeligheten med tidlig diagnose og den høye forekomst av metastasering assosiert med kreft i bukspyttkjertelen bidra til dens sturen prognose [1]. Dermed har de siste årene vært vitne til intensiv studie i å søke etter mer sensitive, spesifikke og kostnadseffektive biomarkører. Til dags dato, er det mange molekylær-baserte, fler-omics strategier anvendes for å oppnå dette målet. Tissue mirnas ble nylig demonstrert som nye biomarkører for diagnose, prognose og prediksjon til behandlingsrespons for kreft i bukspyttkjertelen pasienter [4]. Bemerkelsesverdig, kan disse små ikke-kodende RNA også påvises i mange om ikke alle kroppsvæsker [20]. Følgelig miRNA profilering i blodet ble nylig demonstrert for å skille kreftpasienter fra friske kontroller [4], og sirkulerende miRNA analyse har blitt stadig foreslått som en roman biomarkør for kreft i bukspyttkjertelen diagnose.
I de siste årene, mirnas i menneskets spytt har vist seg å være potensielle biomarkører for diagnostisering formål. Fordi samlingen er ikke-invasiv, atraumatisk og lett tilgjengelig, ved hjelp av spytt for tidlig deteksjon sykdom er ideell. Historisk HSA-MIR-31 var en av de første diskriminerende miRNA spytt biomarkører identifisert for munnhulekreft [21]. Nylig, over-uttrykk for har-MIR-17 og har-MIR-20a har blitt rapportert å være signifikant assosiert med dårlig resultat av spytt adenoid cystisk karsinom [22]. I tillegg ble 13 mirnas funnet betydelig deregulert i spytt av muntlig plateepitelkarsinom pasienter sammenlignet med friske kontroller [23]. Sist, spytt miRNA profiler forskjellig i spytt fra pasienter med ondartet fra spytt fra pasienter med godartet parotidkjertelen svulst, og dermed representerer en ny ikke-invasiv diagnostisk verktøy for å diagnostisere svulster i spyttkjertlene [9]. I løpet av redaksjonen av dette manuskriptet, Xie
et al
beskrevet som spytt MIR-3679-5p og MIR-940, to nylig preget mirnas som ikke ble undersøkt i dette arbeidet, kan være spesifikke for pasienter med resectable PDAC , med rimelig spesifisitet og sensitivitet [24]. På den annen side har spytt bruk for miRNA deteksjon ikke blitt evaluert hittil i unresectable PDAC pasienter som representerer de aller fleste (85%) av pasienter diagnostisert med denne kreftformen.
I dagens proof-of-concept studie, var samlet spytt fra pasienter med inoperabel kreft i bukspyttkjertelen (n = 7), pankreatitt (n = 4), IPMN (n = 2), og kreft-frie pasienter (n = 4) som gjennom endoskopisk undersøkelse. Av mer enn 90 mirnas testet, 4 ble identifisert som blir betydelig deregulert i spyttet til kreft i bukspyttkjertelen pasienter sammenlignet med kontroll (HSA-MIR-21, HSA-MIR-23a, HSA-MIR-23b og HSA-MIR-29C). I tillegg HSA-MIR-21, HSA-MIR-23a og HSA-Mir-23b var strengt spesifikke for kreftpasienter, med utmerket følsomhet (71,4% og 85,7%, henholdsvis). På den annen side, la-7c og HSA-MIR-210 var fraværende i spyttet hos kontrollpasientene, men lett påvisbar i spyttet hos pasienter med pankreatitt, med utsøkt spesifisitet og selektivitet (HSA-MIR-210).
imidlertid på dette stadium av prosjektet, spytt testing mislyktes i å skille mellom pankreatitt og PDAC, som hSA-MIR-216 blir detektert bare i pankreatitt og ikke i kreft, men med dårlig følsomhet. Tatt sammen, vi viser for første gang at spytt miRNA er tegn på sykdom i bukspyttkjertelen og kan brukes til å diagnostisere unresectable PDAC (HSA-MIR-21, HSA-MIR-23a, HSA-MIR-23b) eller pankreatitt (HSA-MIR -210). Hsa-MIR-21, ble HSA-MIR-23a og HSA-Mir-23b funnet betydelig deregulert i spyttet til resektable PDAC pasienter i forhold til friske kontroll under discovery fasen, men ble ikke videre undersøkt som de ikke stille ut på minst fire ganger endring i uttrykket mellom de to gruppene [24].
i dette arbeidet har vi startet å utforske om spytt mirnas kan bidra til diagnostisering av befolkningen i fare for å utvikle kreft i bukspyttkjertelen, og dermed kunne brukes som markør for å forhindre tumor forekomst. Intraductal papillær mucinkjertler svulster (IPMNs) er ikke-invasiv forstadier av kreft i bukspyttkjertelen. Nylig mirnas i cyste væske har vist seg å identifisere høy klasse IPMN som krever reseksjon og for å utelukke ikke-mucinkjertler cyster antyde konservativ behandling med høy sensitivitet og spesifisitet [25]. Vi har fått foreløpige resultater tyder på at HSA-MIR-23a og HSA-Mir-23b er også til stede i spytt fra pasienter diagnostisert med IPMN, og kunne brukes til beslutningsprosesser i IPMN ledelse.
Men vår studien har en tendens til å vise at hSA-MIR-21, hSA-MIR-23a og hSA-MIR-23b er tilstede i spyttet hos pasienter med pankreatitt, mens hSA-MIR-210 blir detektert i spyttet til en brøkdel av pasienter med PDAC . I tillegg, HSA-MIR-23a og HSA-MIR-23b er tilstede i spyttet hos pasienter med IPMN. Dette kan enkelt forklares som pankreatitt og IPMN er to godt karakteriserte PDAC forstadier, noe som indikerer at PDAC positivt for HSA-MIR-210, eller HSA-MIR-23a og HSA-MIR-23b, kan ha kommet fra pankreatitt eller IPMN, henholdsvis. Tvert imot pasienter diagnostisert med pankreatitt og forhøyet spytt HSA-MIR-21, HSA-MIR-23a og HSA-MIR-23b, eller pasienter diagnostisert med IPMN og forhøyet spytt HSA-MIR-23a og HSA-Mir-23b kan være i risikosonen for å utvikle PDAC og kan kreve grundig klinisk oppfølging. Vi er klar over at den foreliggende studien lider av liten prøve dimensjonering og krever en ekstern validerings befolkning. Derfor har vi nylig konstituert den første klinisk kommenterte kohort av kreft i bukspyttkjertelen pasientprøver fra forskjellige institutter (den BACAP initiativ, https://www.chu-toulouse.fr/-projet-bacap-). Slike kohorten vil være svært informativ for ytterligere validering og fremtidig klinisk anvendelse av vår metode, fordi den representerer en unik kilde til PDAC prøver, men også fordi det er rekapitulere den «naturlige historie» av denne sykdommen. En slik kohort kan bidra til å etablere spytt mirnas, sammen med ytterligere kliniske variabler, som nye biomarkører for kreft i bukspyttkjertelen pasientenes ledelse. I tillegg har vi ennå til å utføre komparative studier mellom ulike kreftpasienter for å rettferdiggjøre at biomarkørene vi identifisert her er spesifikke for kreft i bukspyttkjertelen.
I denne artikkelen har vi identifisert HSA-MIR-21, HSA-MIR -23a og HSA-Mir-23b som ble annerledes uttrykt mellom spyttprøver av pasienter med ondartet svulst og kreftfrie pasienter, med utmerket spesifisitet og sensitivitet. Mens HSA-MIR-21 er også forbundet med mange fysiologiske tilstander inkludert men ikke begrenset til kardiovaskulære og pulmonale sykdommer, inklusive hjerte- og lungefibrose, så vel som myocardialt infarkt, men også med immunologiske og utviklingsprosesser [26], HSA-MIR-21 er en av de mest siterte miRNA i onkologi [27], inkludert kreft i bukspyttkjertelen [4]. Vi har tidligere vist at HSA-MIR-21 er tidlig uttrykk under bukspyttkjertelkreftutvikling [28], og at målretting HSA-MIR-21 provoserer tumorregresjon i eksperimentelle modeller av bukspyttkjertelkreft [17]. Påfallende, vises HSA-MIR-21 til å være konstant opp reguleres i kreft i bukspyttkjertelen, og for å være et tegn på dårlig overlevelse, respons på behandling og /eller metastatisk sykdom [4]. I tillegg er en fersk metaanalyse nylig demonstrert sirkulerende HSA-MIR-21 prognostisk stedet for diagnostisk verdi i ulike kreftformer [29]. I denne studien, spekulerer vi at spytt HSA-MIR-21 kan også være av interesse for kreft i bukspyttkjertelen diagnose, og fullføre forrige karakterisering av spytt HSA-MIR-21 for påvisning av spiserørskreft [10]. Så vidt vi vet, gir vi her den første demonstrasjonen som HSA-MIR-23a og HSA-Mir-23b kunne påvises i spytt av pasienter diagnostisert med kreft; imidlertid, er spesifisiteten av begge kandidat mirnas for PDAC ennå ikke demonstrert. Hsa-MIR-23a har nylig vært forbundet med KRAS [30] og C-MYC [31] mediert signalveien, og beskrives som en kandidat kjører miRNA i bukspyttkjertelkreft [30]. HSA-MIR-23a har også vært knyttet til nedsatt NK-celle-cytotoksisitet [32], emt [33] og motstand mot behandling [34-36]. Interessant, HSA-MIR-23b ble nylig vist å regulere autofagi forbundet med radioresistance av kreft i bukspyttkjertelen celler [37].
Vi neste undersøkt kinetisk for påvisning av spytt miRNAs i en eksperimentell modell for kreft i bukspyttkjertelen. Mens HSA-MIR-23a og HSA-Mir-23b ble sterkt uttrykt i humane kreft i bukspyttkjertelen celler-avledet xenografter, de var knapt synlig i spytt i denne modellen av tumorbærende mus. På den annen side ble HSA-MIR-21 lett påvises i tumorer og i spytt hos mus xenopodet med humane kreft i bukspyttkjertelen-avledede celler, mens påvises i kontrolldyrene. Dette siste funnet sterkt at spytt HSA-MIR-21 stammer fra eksperimentelle tumorer, sannsynligvis
via
tumor-avledet exosomes, som nylig beskrevet [38]. I tillegg viser vi her at spytt HSA-MIR-21 deteksjon forut påvisning av kreft-celle spesifikt tumor markør i denne eksperimentelle modellen av PDAC. Dette tyder på det sterkeste at spytt miRNA, inkludert HSA-MIR-21, er mer følsomme enn systemiske-baserte protein markører for diagnostisering av PDAC.
Konklusjon
Til sammen viser vi her for første gang at spytt miRNA kan være verdifulle biomarkører for å skille pasienter med inoperabel PDAC fra friske kontroller, og at spytt MIR-210 kan bidra til å oppdage pankreatitt. Mens multisenterstudier med større utvalgsstørrelser er nødvendig, dette arbeidet stammer for bruk av spytt miRNA som nye biomarkører for diagnostisering av unresectable PDAC.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Table. miRNA kvantifisert i denne studien
doi:. 10,1371 /journal.pone.0130996.s001 plakater (XLSX)
S2 Table. mirnas CQ verdier i hele spytt fra pasienter uten kreft (n = 4), begning pankreatitt (n = 4), bukspyttkjertelen adenokarsinom (n = 7) eller IPMN (n = 2)
doi:. 10,1371 /journal.pone. 0130996.s002
(XLSX)
S3 bord. Kandidat mirnas CQ verdier fra Mia PACA-2 Lucia celler (n = 3)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0130996.s003 plakater (XLSX)
S4 tabell. Kandidat mirnas CQ verdier fra n = 6 eksperimentelle pankreastumorer (ET)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0130996.s004 plakater (XLSX)
S5 Table. Utskilt luciferase og spytt kandidat mirnas CQ verdier fra n = 6 mus med eksperimentelle pankreastumorer
doi:. 10,1371 /journal.pone.0130996.s005 plakater (XLSX)
Takk
forfatterne ønsker å takket legene Geneviève Tavernier og Jean-José Maoret for sine nyttige råd.
