Abstract
CD44 som en av de mest mulige stamcellemarkører spiller en sentral rolle i mange cellulære prosesser, blant annet kreft cellevekst og migrasjon. Funksjonelle enkeltnukleotidpolymorfi (SNPs) i
CD44
kan modulere sine genet funksjoner og dermed risikoen for kreft. I denne studien har vi undersøkt om polymorfismer i 3′-utranslaterte område (UTR) av
CD44
er assosiert med økt mottakelighet for tykktarmskreft (CRC) ved å gjennomføre en case-control studie av 946 CRC pasienter og 989 kreftfrie kontroller. Tre polymorfismer (rs13347C /T, rs10836347C /T, rs11821102G /A) i 3′-UTR av
CD44
ble genotypet. Vi fant at variant genotyper (CT og TT) av rs13347 (justert odds ratio (OR) = 1,79, 95% konfidensintervall (KI) = 1,50 til 2,17) økte en persons mottakelighet for CRC, sammenlignet med rs13347CC homozygote genotyper. Vi fant også at CRC pasienter med CT /TT genotype hadde en 1,6 ganger økt risiko for å utvikle avansert (stadium III + IV) CRC. Videre funksjonelle analyser viste at C til T baseendring på rs13347C /T forstyrrer bindingssetet for mikroRNA HSA-mir-509-3p, og dermed øke
CD44
transkripsjonen aktivitet og uttrykk nivå. Disse funnene tyder på at rs13347C /T i mikroRNA bindingssetet kan være potensielle biomarkører for genetisk mottakelighet for CRC
Citation. Wu XM, Yang HG, Zheng BA, Cao HF, Hu ZM, Wu WD (2015) funksjonelle genetiske variasjoner på mikroRNA Binding-Site i
CD44
Gene er forbundet med risikoen for tykktarmskreft i kinesiske pasientgrupper. PLoS ONE 10 (5): e0127557. doi: 10,1371 /journal.pone.0127557
Academic Redaktør: Yifeng Zhou, Medical College of Suzhouuniversitetet, KINA
mottatt: 13 februar 2015; Godkjent: 16 april 2015; Publisert: May 26, 2015
Copyright: © 2015 Wu et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Zhejiang Provincial Natural Science Foundation (No. 2013C33106). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er den tredje vanligste diagnosen mage-tarmkanalen i verden [1], og dens forekomst og dødelighet har vært raskt økende de siste tiårene i Kina [2]. Epidemiologiske studier har vist at miljømessige risikofaktorer samt livsstilsrelaterte faktorer som kosttilskudd, røyking og drikking av alkohol regnes som bidragsytere i etiologien av CRC [3, 4]. Flere og flere studier har allerede erkjent at genetiske faktorer kan betydelig modulere mottakelighet for tykktarmskreft. Spesielt enkle nukleotid (SNP) i gener som endrer dets ekspresjon eller aktivitet ved å endre aminosyresekvensen kan predisponere til CRC tumorgenesis [5-7].
Kreft er en klasse av sykdommer karakterisert ved ukontrollert cellevekst og dele. Som en liten populasjon av celler i en svulst, kan kreft stamceller (CSC) bidra til de mest aggressive former av sykdommen med stand til å initiere tumorvekst og deres resistensegenskaper. Samler studier har fokusert på eksistensen av kolorektal kreft stamceller i human kolorektal kreft [8-10]. Dermed kan presis identifisering av tykktarms CSC og deres egenskaper bidra til vesentlig fremme effektiv kreftbehandling. Antatte kolon CSC populasjoner kan bli identifisert ved uttrykket av spesifikke CSC markører. CD44 er en av de velkjente stamcelle markør for CRC [11].
CD44
gen kodet for et celleoverflate-glykoprotein som er involvert i mange biologiske prosesser, inkludert lymfocyttaktivering, hematopoiesis, homing og embryonal utvikling [12]. I mellomtiden
CD44
spiller en uunnværlig rolle i tumorcellevekst, differensiering, invasjon og motilitet i respons til en mobil mikromiljøet, for derved å øke cellulær aggregering og bidra til utvikling og progresjon av tumorer [13-15]. Nyere studier har vist signifikant korrelasjon mellom nivået av
CD44
ekspresjon og brystkreftceller høyere tumorgenisitet og metastatisk potensiale [13, 16], for derved å markere en viktig rolle
CD44
i tumorprogresjon og metastasering. Tilsvarende knockdown av
CD44
med spesifikke siRNA (small interfering RNA) i humane tykktarmskreftceller kunne dramatisk suppresse cellevekst og tumorprogresjon
in vitro Hotell og
in vivo
, sterkt antyde en potent regulator av
CD44
i utviklingen av CRC [17, 18]. I tillegg har flere studier også uttalt at genetiske varianter i
CD44
genet ble forbundet med kreftrisiko og prognose [19, 20]. 3′-UTR (uoversatt regioner) av gener er de viktigste områdene målrettet av microRNAs og har en sentral rolle rolle i genets mRNA stabilitet og eventuell modulerer regulering av relaterte proteiner. SNPs ligger på mikroRNA-bindingsseter kan påvirke binding evne mikroRNA og teoretisk forstyrre uttrykk for
CD44 Hotell og dermed kan predisposite til sykdommen mottakelighet. Vi hypotese at SNPs i
CD44
3′-UTR er forbundet med CRC risiko ved å påvirke genet uttrykk.
I dagens sykehusbasert case-control studie, vi genotypet tre polymorfismer (rs13347C /T, rs10836347C /T, rs11821102G /A) i 3′-UTR av
CD44 Hotell og analysert sammenhengen mellom genetiske variasjoner og CRC risiko. Deretter funksjonelle analyser ble videre utført for å undersøke betydningen og biologiske funksjoner av disse SNPs.
Materialer og metoder
Study befolkningen
Studiepopulasjonen besto av 946 Han-kinesisk CRC pasienter og 989 etnisk matchet kreftfrie kontroller. I studien ble pasienter med kolorektal kreft eller friske kontroller som nylig hadde blodoverføringer ekskludert. De kreftpasienter med histopatologiske bekreftet CRC fortløpende rekruttert ved Zhejiang Provincial Folkets sykehus (Hangzhou). Dessuten var det ingen alder, scene og histologi begrensning for pasienter med kolorektal kreft. I mellomtiden, alle friske individer tilfeldig rekruttert i studien hadde ingen dokumentert historie av kreft og kjønnsfrekvens matchet kreftfrie kontroller basert på deres alder (± 5 år). De ble også tilfeldig rekruttert fra en 3500 individuell ernæringsundersøkelse i Zhejiang-provinsen i nesten samme periode, der kreft pasienters blodprøver ble samlet inn, med en svarprosent på 90%. Svulsten, node, metastase (TNM) klassifisering og svulst staging ble evaluert i henhold til 2002 amerikanske Joint Committee on Cancer staging system. Informert samtykke ble signert fra hver deltaker for analyse av molekylære korrelater, og hver deltaker ble planlagt for et intervju med utvalgt informasjon som røyk status, alkoholforbruk, familiehistorie og andre potensielle konfunderende faktorer. Fordelinger av utvalgte kliniske funksjoner av case-control status er oppsummert i tabell 1. 5 ml blodprøver ble samlet inn ved påmelding for hvert av fagene. Denne studien ble godkjent av medisinsk etikk komité av Zhejiang Provincial Folkets sykehus.
Genotyping analyse
Genomisk DNA ble ekstrahert fra hver blodprøve innhentet fra alle deltakere ved hjelp av en Blood Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) og lagret ved -80 ° C. Tre polymorfismer (rs13347C /T, rs10836347C /T, rs11821102G /A) i 3′-UTR av
CD44
ble valgt ut og genotypet ved Allele spesifikke MALDI-TOF massespektrometri analyse som tidligere beskrevet [21]. Grunning parene og multipleks reaksjoner ble designet av Reals NP.com Nettstedet. Omtrent 10% MALDI-TOF massespektrometri analyserte prøvene ble tilfeldig valgt for en blindet gjenta. For kvalitetskontroll, ble 50 prøver analyseres på nytt ved direkte sekvensering og resultatene var i 100% enighet.
Bygging av luciferase journalister
Genotyping for
CD44
SNPs viste at rs13347C /T var signifikant assosiert med CRC risiko. Basert på bioinformatikk analyse (SNPinfo webserver: https://snpinfo.niehs.nih.gov/), den rs13347C å rs13347T overgang fått en ny binding av mikroRNA HSA-mir-509-3p. Derfor hypotese vi at SNP rs13347C /T på mikroRNA-bindingsseter kan påvirke binding evne HSA-mir-509-3p, og dermed hadde noen effekt på
CD44
uttrykk. For å teste denne hypotesen, den 358bp 3′-UTR fragment av den menneskelige
CD44
genet flankerer rs13347C eller rs13347T allelet ble syntetisert ved Genewiz Company (Suzhou, Kina), og ble deretter klonet inn i psiCHECK2 basisvektoren (Promega, Madison, WI, USA) med Renilla og firefly luciferase gensekvenser (fig 1A). De to konstruksjoner (psiCHECK2-
CD44
-rs13347C og psiCHECK2-
CD44
-rs13347T) ble sekvensert for å bekrefte allel og integriteten til hver innsatsen.
(A) Representant grafen av luciferase-aktivitet av variant allel på luciferase-rapportørgener bærer 358bp av 3′-UTR-fragmentet av det humane
CD44
-genet som flankerer rs13347C /T-polymorfisme. Relativ luciferase aktiviteten i psiCHECK2-
CD44
-rs13347C og psiCHECK2-
CD44
-rs13347T konstruksjoner kotransfektert med eller uten 40pmol HSA-mir-509-3p eller 40pmol HSA-mir-509-3p hemmer, henholdsvis utført i SW260-celler (B) og SW116-celler (C). Seks replikater ble utført for hver gruppe, og forsøket ble gjentatt minst tre ganger. Stjerne indikerer en betydelig endring (
P
0,05). Dataene er gjennomsnitt ± SEM. (D)
CD44
uttrykk nivå i 37 CRC vev fra personer med forskjellig rs13347C /T genotyper (15 rs13347CC, 16 rs13347CT og 6 rs13347TT);
CD44
uttrykk var normalisert til
GAPDH
genet og presentert som gjennomsnitt ± SEM. Dataene som vises, er representative for minst tre uavhengige eksperimenter. (E) Uttrykket nivået av HSA-MIR-509-3p i 37 CRC vev gruppert etter rs13347C /T genotyper. HSA-MIR-509-3p mRNA uttrykk ble beregnet i forhold til uttrykk for
U6
mRNA ved å beregne de relative uttrykk nivåer. Dataene er gjennomsnitt ± SEM,
P
= 0,579. Forskjellene i uttrykket nivåer ble analysert med enveis ANOVA test.
Forbigående transfections og luciferase analysene
To menneskelige kolorektal cellelinjer SW116 og SW620 ble opprettholdt i L-15 medium (Gibco, Los Angeles, California, USA) med 10% føtalt bovint serum (Sigma-Aldrich, MO) ved 37 ° C i en fuktet atmosfære med 5% CO
2. 1 × 10
5 celler per brønn ble sådd i 24-brønners plater (BD Bio Sciences, Bedford, MA, USA) før transfeksjon. Etter 24 timer ble cellene deretter transient transfektert som beskrevet tidligere [22, 23] med 1.5μg rapportør plasmider (rs13347C eller rs13347T allel) med eller uten 40pmol har-mir-509-3p etterligner eller 40pmol inhibitorer av Lipofectamine 2000 i henhold til protokollen (Invitrogen, Carlsbad, California). For luciferase analysene ble cellene høstet etter transfeksjon for 24 timer, og Renilla luciferase aktivitet ble kvantifisert med Dual-luciferaserapportørplasmid analysesystem (Promega, Madison, WI).
Real-time PCR
RNA fra 37 CRC vev med ulike rs13347C /T genotyper ble hentet ut og revers-transkribert til cDNA ved hjelp av oligo-dT primer. Allel diskriminering av rs13347 polymorfismer av
CD44
genet ble utført med ABI Prism 7500 sekvens deteksjonssystem for å evaluere
CD44 Hotell og
GAPDH
mRNA nivåer basert på SYBR-grønne metode. Al l quantifications ble utført med
GAPDH
som intern standard. I tillegg ble det TaqMan mikroRNA Analyser (Applied Biosystems) brukes til å oppdage bakgrunnen uttrykk for har-mir-509-3p i CRC vev i henhold til produsentens protokoll. Uttrykk av universelt uttrykt
U6
liten kjernefysiske RNA ble også brukt for en intern kontroll. Den relative kvantifisering av
CD44
uttrykk ble analysert av 2
-ΔΔCT metode. Hver analyse ble gjort i tre eksemplarer.
Statistisk analyse
To-sidige chi-kvadrat tester ble brukt for å sammenligne forskjeller i fordelingene av clinicopathological funksjoner mellom sakene og kreftfrie kontroller. For case-control studie ble Hardy-Weinberg likevekt (HWE) testet for å sammenligne de forventede genotypefrekvensene med observerte genotypefrekvensene i kontrollene av en godhet-of-fit chi-kvadrat test. Korrelasjonen mellom genetiske varianter og kliniske parametre ble undersøkt ved hjelp av khikvadrattest som passer. De odds ratio (ORS) og 95% konfidensintervall (CIS) ble estimert til å vurdere sammenhengen mellom rs13347C /T polymorfisme og CRC risiko ved bruk av en ubetinget logistikk regresjonsmodeller. Stratifisert analyse ble også utført for å vurdere mulig interaksjon mellom
CD44
polymorfismer og utvalgte variablene på CRC risiko. Statistiske sammenligninger av mer enn to grupper ble evaluert ved en-veis ANOVA tester. Den statistiske styrken ble beregnet ved å bruke PS-programvaren (https://biostat.mc.vanderbilt.edu/twiki/bin/view/Main/PowerSample-Size). De statistiske analysene ble utført ved bruk av STATA (versjon 10, STATA Corporation). Foreningen ble betraktet som signifikant når
P
-verdi var mindre enn 0,05.
Resultater
genotyper og risiko for CRC
Det er totalt 946 CRC tilfeller og 989 friske kontroller ble rekruttert i vår analyse og genotypet for å vurdere sammenhengen mellom
CD44
rs13347C /T, rs10836347C /T, rs11821102G /A og CRC risiko. Genotypen fordelingene til de tre polymorfismer mellom de tilfellene og styringer er oppsummert i tabell 2. De observerte genotypefrekvensene av disse SNPs studert hos friske kontroller ble funnet å være konsistent med HWE. Genotyping Resultatene viste at bare rs13347 var statistisk signifikant assosiert med CRC risiko, ble ingen signifikante assosiasjoner nevnt i andre SNPs. Pasienter med
CD44
polymorfi rs13347TT genotyper var assosiert med økt risiko for tykktarmskreft mellom saker og kontroller. Videre bærer med den kombinerte varianten genotype CT /TT viste en betydelig høyere risiko for CRC (OR = 1,79, 95% (KI) = 1,50 til 2,17),
P
10
-4) sammenlignet med genotype CC.
Vi utførte videre stratifisert analyse for rs13347C /T av kliniske eller patologiske egenskaper som alder, kjønn, røykestatus, alkoholforbruk og familiens historie av kreft. Som vist i tabell 3, var det en signifikant interaksjon mellom polymorfisme rs13347C /T og tumorstadiet. Vi observerte at sammenlignet med rs13347CC genotype, pasienter med CT /TT genotype hadde over 1,6 ganger økt risiko for å utvikle avansert (stadium III + IV) CRC (
P
= 0,004). Det ble imidlertid ingen forskjeller i andre undergrupper funnet.
Effekt av SNP rs13347C /T på reporter gen aktivitet
To luciferaserapportørplasmid konstruksjoner som inneholder rs13347C eller rs13347T allelet forbigående ble ko-transfektert med etterligne eller hemmer av HSA-mir-509-3p som ble betinget binding til rs13347C /T polymorfe sete av bioinformatikk analyse for å undersøke effekten av SNP rs13347C /T på
CD44
3′-UTR transkripsjon aktivitet. Som vist i figur 1B og 1C, er mikroRNA HSA-mir-509-3p ligne transfekterte CRC-celler kan i betydelig grad redusere den luciferaseaktiviteten av reportergen med den rs2735383C allelet sammenlignet med rs2735383T allel (
P
= 0,007 for SW620 og
P
= 0,02 for SW116). I kontrast til aktiviteten av reportergen med den rs13347C allelet betydelig tendert til å reversere etter forbigående transfeksjon av celler med HSA-mir-509-3p etterligne og den tilsvarende inhibitor. Imidlertid ble ingen signifikant effekt på de reporter gener med rs2735383T allelet med behandling av HSA-mir-509-3p ligne og hemmer observert. Resultatene indikerte at C til T baseendring av rs13347C /T forstyrrer bindingssetet for HSA-mir-509-3p, og dermed økte transkripsjonen aktivitet av
CD44
genet.
Association mellom rs13347C /T genotyper og
CD44
uttrykk
Vi har gjennomført real-time PCR for å evaluere effektene av rs13347C /T på
CD44
uttrykk ved hjelp av 37 tumorvev fra ubehandlet CRC pasienter med ulike genotyper. Som illustrert vist i figur 1D, og resultatene viste at pasienter med rs13347T genotyper (CT og TT) hadde en vesentlig høyere
CD44
mRNA-nivåer (gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet (SEM): 0,565 ± 0,057), sammenlignet med bærere av rs13347CC genotypene (gjennomsnitt ± SEM: 0,305 ± 0,050, ANOVA test:
P
= 0,003). Og vi deretter analysert sammenhengen mellom HSA-mir-509-3p uttrykk og
CD44
rs13347C /T genotyper. HSA-mir-509-3p er konstitutivt uttrykt i de 37 tumorvev fra ubehandlede CRC pasienter med ulike genotyper; Det var imidlertid ingen signifikant sammenheng mellom bakgrunnen uttrykk for HSA-mir-509-3p og
CD44
rs13347C /T genotyper (0,037 ± 0,008 for CC, 0,027 ± 0,005 for CT og 0,029 ± 0,011 for TT ; ANOVA test.
P
= 0,579) (fig 1E)
Diskusjoner
i denne aktuelle molekylær epidemiologisk studie undersøkte vi de sammenslutninger av tre SNPs i 3 « -UTR av
CD44
genet med risiko for tykktarmskreft i kinesiske befolkningen og fant at rs13347C /T var signifikant assosiert med økt risiko for CRC. Vi har også observert en betydelig forhøyet risiko for CRC svulst scenen forbundet med rs13347T variant i et allel-dose måte. Videre funksjonelle eksperimenter viste at rs13347T variant kan vesentlig endre HSA-mir-509-3p-mediert
CD44
transkripsjonen aktivitet og uttrykk aktivitet. Resultatene tyder på at varianter i
CD44
genet kan være verdifulle for risikovurdering, diagnostikk og genetisk epidemiologisk analyse av CRC.
CD44
genet ligger til kromosom locus 11p13 og koder for et vidt uttrykte celleoverflate transmembran-glykoprotein i en rekke forskjellige celletyper. Proteinet omfatter hovedsakelig med N-terminus (rester 38-46) og C-terminale del av det ekstracellulære området (rester 150-162), som er kjent for å være nødvendig for binding av et mangfoldig repertoar av ligander slik som hyaluronsyre (HA), osteopontin og matriksmetalloproteinase [24]. Det er flere linjer med eksperimentelle bevis som støtter en rolle for
CD44
involvert i et stort spekter av cellulære prosesser, inkludert lymfocyttaktivering, apoptose, hematopoiesis, resirkulering og målsøkende [25-27].
CD44
har en godt dokumentert tumor-fremme aktivitet som inkluderer fremme tumorcellevekst, differensiering og metastasering [28]. Mange molekylærbiologiske studier har identifisert at
CD44
uttrykk er nært knyttet til de ulike maligniteter forekomst, progresjon og prognose [29-32]. Unexceptionally,
CD44
ble også funnet å spille en viktig rolle i CRC utvikling. En nylig studie basert på 234 CRC-pasienter har vist at den økte
CD44
ekspresjon i CRC er korrelert med metastase, øket tidlig tumorresidiv og chemoresistance [33]. Nyere eksperimentelle bevis fra begge
in vitro
klonogene og
in vivo
tumorigent analysen viste at CD44 (+) CRC celler vise egenskapene for kreft stamcelle [18], noe som indikerer en funksjonell betydning
CD44
i CRC initiering og utvikling. Konsekvent, har vi etablert genetisk sammenheng mellom uttrykk for
CD44 Hotell og risiko for CRC. I tillegg funksjonelle analyser viste at
CD44
rs13347C /T SNP kan påvirke
CD44
uttrykk ved å endre HSA-mir-509-3p binding til 3′-UTR av
CD44
genet. Tidligere studier har rapportert at HSA-mir-509-3p kan spille en viktig rolle som en tumor suppressor gen under kreftdannelsen [34, 35]. Og ingen signifikant sammenheng mellom bakgrunnen uttrykk for HSA-mir-509-3p og
CD44
rs13347C /T genotyper ble observert i studien, noe som indikerer at noen resultatførte mekanismer modulerende effekten av HSA-mir-509- 3p på rs13347T genotyper kan eksistere. Vår Resultatet viste at C til T baseendring av rs13347C /T muligens forstyrrer bindingssetet for HSA-mir-509-3p, øker transkripsjonen aktivitet av
CD44
genet og dermed var mer utsatt for CRC.
i denne studien, må vi først vist at
CD44
rs13347C /T variasjon bidrar til en økt risiko for CRC. Denne studien er basert på en forholdsvis stor, tilfeldig, etnisk homogen prøve, noe som betyr at det er mulig å unngå enhver skjevhet forvirrende. Av notatet, ble den statistiske strømmen økes til å være 0,91 (tosidige test, α = 0,05) ved påvisning av en ELLER-N for de rs13347CT + TT genotyper (som opptrer ved en frekvens på 41,56% blant kontrollene) i forhold til rs13347CC genotype . I tillegg er biologisk plausibel foreningen, tyder dette funnet er bemerkelsesverdig.
I konklusjonen, er dette den første rapporten for å finne sammenhengen mellom polymorfisme rs13347C /T ligger i HSA-mir-509-3p bindingssetet, som kan påvirke
CD44
mRNA uttrykk nivå og risiko for CRC. I tillegg vår studie viste at sammenlignet med CD44 rs13347CC genotype, variant genotyper (CT + TT) overfører en økt risiko for CRC populasjoner. Videre er risikoen effekten av denne polymorfisme er mer åpenbar i tumor trinn (III + IV) av CRC pasienter. Større, helst populasjonsbasert case-control studier er nødvendig for å bekrefte sammenhengen mellom
CD44
polymorfismer med ulike menneske maligniteter i ulike etniske grupper.
Takk
Denne studien var støttet av Zhejiang Provincial Natural Science Foundation (No. 2013C33106).
