Abstract
Kreftceller aktivere biosyntesen av mettede fettsyrer (SFA) og enumettet fettsyrer (MUFA) for å opprettholde en økende etterspørsel etter fosfolipider med passende acylsammensetningen under cellereplikasjon. Vi har tidligere vist at et stabilt knockdown til stearoyl-CoA-desaturase 1 (SCD1), den viktigste Δ9-desaturase som konverterer SFA til MUFA, i kreftceller senker frekvensen av lipogenese, reduserer proliferasjon og in vitro invasivitet og dramatisk hemmer tumordannelse og vekst. Her kan vi rapportere at farmakologisk inhibering av SCD1 med en ny lite molekyl i kreftceller fremmet aktivering av AMP-aktivert kinase (AMPK) og den etterfølgende reduksjon av acetylCoA karboksylase aktivitet, med en samtidig inhibering av glukose-mediert lipogenese. Den farmakologiske hemming av AMPK ytterligere redusert spredning av SCD1-utarmet celler, mens AMPK aktivering gjen proliferasjon til kontrollnivåer. Tilsetning av suprafysiologiske konsentrasjoner av glukose eller pyruvat, sluttproduktet av glykolyse, ikke reversere den lave formeringshastigheten av SCD1-ablated kreftceller. Våre data tyder på at kreftceller krever aktiv SCD1 som regulerer graden av glukose-mediert lipogenese, og at når SCD1 aktiviteten er svekket celler downregulate SFA syntese via AMPK-mediert inaktivering av acetyl-CoA karboksylase, og dermed hindre de skadelige effektene av SFA opphopning.
Citation: Scaglia N, Chisholm JW, Igal RA (2009) Hemming av StearoylCoA desaturase-en inaktiverer acetyl-CoA karboksylase og svekker spredning i kreftceller: Role of AMPK. PLoS ONE 4 (8): e6812. doi: 10,1371 /journal.pone.0006812
Redaktør: Marcelo Bonini, National Institutes of Health (NIH) /National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS), USA
mottatt: 5 mai 2009; Godkjent: 04.08.2009; Publisert: 27 august 2009
Copyright: © 2009 Scaglia et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Charles og Joanna Busch Foundation og SEBS /NJAES, Rutgers University. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreftceller celler~~POS=HEADCOMP vise et radikalt endret metabolisme som fremmer deres kontinuerlig spredning. Som en del av den metabolske skiftet mot makromolekylær syntese for å støtte cellereplikasjon, kreftceller aktiverer biosyntesen av mettede fettsyrer (SFA) og monoumettede fettsyrer (MUFA) for å opprettholde et økende behov for fosfolipider av passende acyl-preparat for membran biogenese. Således har flere viktige enzymer som er involvert i de novo-syntesen av fettsyrer har vist seg å være overuttrykt i maligne celler: ATP-citrat-lyase, som kreves for fremstilling av cytosolisk acetylCoA [1] acetylCoA karboksylase (ACC), enzymet som katalyserer syntesen av malonylCoA, [2], [3], og fettsyre syntase (FAS), som syntetiserer det første engasjerte trinn i syntesen av fettsyrer SFA [2]. Betydningen av fettsyresyntese for kreftcelle proliferasjon og overlevelse fremheves ved det faktum at inhiberingen av noen av disse enzymer leder til en stans i celleproliferasjon og økt celledød [4] – [9]. Men på tross av den overaktivering av tandem for biosyntetiske enzymer som til slutt gjør SFA, rikelige mengder av MUFA finnes vanligvis i kreftceller [10] – [13], som tyder på at biosyntesen av MUFA er nødvendig for å sikre cancer celleproliferasjon og overlevelse.
Pattedyr stearoylCoA desaturasene (SCD) er mikrosomale enzymer som katalyserer Δ9-desaturation mettet acylCoAs å danne enumettede derivater [14]. Ekspresjonen av SCD1, hoved SCD isoform, blir øket i flere humane kreftformer, kjemisk induserte tumorer, så vel som i onkogen-transformerte celler [1], [13], [15] – [18]. Vi har vist at SCD1 modulerer ikke bare innholdet av MUFA i kreftceller, men også den totale prosess for lipogenese [19]. Bemerkelsesverdig, ablasjon av SCD1 uttrykk reduserer kreftcelle proliferasjon og in vitro invasivitet og dramatisk hemmer tumordannelse og vekst [19], [20]. Vi har også funnet at aktiv SCD1 kan være nødvendig for neoplastiske celler for å overleve en lipotoxic stresset siden SCD1 knockdown øker basal apoptose og sensitizes cellene til den cytotoksiske effekten av overskytende SFA [19]. SCD1 har også blitt identifisert fra en siRNA bibliotek som et gen hvis undertrykkelse svekker menneskelig kreft celle overlevelse, ytterligere støtte en funksjonell kobling mellom SCD1 og kreft celle vekst [21]. Likevel, til tross for denne økende mengde informasjon, de intrikate mekanismer som SCD1 samtidig modulerer lipidmetabolisme og de biologiske funksjonene i kreftceller er ikke kjent.
Prosessen med lipogenese i pattedyrceller er regulert av Akt og AMP- avhengig protein kinase (AMPK), to store signalproteiner som kontrollerer flere kritiske biosyntetiske og katabolske reaksjoner. Akt er en kraftig induserer glukose-mediert lipogenese i kreftceller, i hovedsak å regulere aktiviteten og transkripsjon av flere enzymer for glykolyse og fettsyresyntese [22], [23]. Som en del av en feedback loop, er aktiviteten til Akt modulert av nivåene av FAS og SCD1. Det ble observert at blokade av FAS-aktivitet og ablasjon av SCD1 uttrykk reduksjon Akt fosforylering og aktivitet i kreftceller [20], [24]. I motsetning til dette, AMPK aktivering ved fosforylering fremmer nedregulering av flere lipogenic veier og aktiverer energi-tilførsel reaksjoner slik som fettsyreoksidasjon [25]. Ett viktig mål aktivert AMPK er ACC. Ved fosforylering av AMPK, blir ACC aktivitet redusert som resulterer i inhibering av de novo syntese fettsyrer [26]. Samtidig reduksjon av malonylCoA nivåer fremmer β-oksidasjon av fettsyrer. SFA er også potente allosteriske hemmere av ACC, som gir en negativ feedback loop for fettsyre biosyntesen [27] – [29]. Vi hypotese at forhøyede SCD1, ved å konvertere SFA til MUFA, er i stand til å opprettholde banen til syntesen av fettsyrer og lipogenese fullt aktivert. Denne tilstanden favoriserer kreft celle vekst og spredning, og dermed redusere SCD1 aktivitet bør svekke disse to biologiske prosesser
Nylig, flere serier av romanen Δ9-desaturase selektive små-molekyl-hemmere har blitt publisert [30] -. [32] . En av disse SCD-inhibitorer, CVT-11127 (N- (2- (6- (3,4-diklorbenzylamino) -2- (4-metoksyfenyl) -3-oxopyrido [2,3-b] pyrazin-4 (3H) -yl) etyl) acetamid), er en potent og spesifikk hemmer av mikrosomal rotte og HepG2-celle Δ9-avmetning [30], og vil kunne være et verdifullt verktøy for å studere reguleringen av cellulær metabolisme og signalveier ved SCD1 aktivitet.
i vår nåværende studier, viser vi at den akutte hemmingen av SCD1 aktivitet med CVT-11127, så vel som kroniske mangel på SCD1 ved stabil gen knockdown, svekker de novo syntesen av fettsyrer vesentlig fra glukose i humane lunge carcinoma-celler. Vi rapporterer også at farmakologisk inhibering av SCD-aktivitet drastisk redusert cellulær proliferasjon i kreftceller, noe som bekrefter at SCD1 aktivitet er en avgjørende forutsetning for kreftcellevekst. Videre observerte vi at blokaden av SCD1 aktivert AMPK og inaktivert ACC resulterer i redusert lipogenese. I eksperimentelle betingelser som induserer lipogenese, for eksempel stimulering av ACC med citrat og hemming av AMPK, ble en ytterligere reduksjon i celleformering observert i SCD1-manglende celler. I motsetning til dette, den farmakologiske aktivering av AMPK reverseres celleproliferasjon til kontrollnivåer. Som helhet, våre data tyder på at nedregulering av fettsyrer når SCD1 aktiviteten er lav kan være en adaptiv sikkerhetsmekanisme for å hindre de skadelige effektene av overflødig SFA når konvertering til MUFA er svekket. Videre disse resultatene markere betydningen av SCD1 i reguleringen av neoplastiske spredning og metabolisme.
Materialer og metoder
Materialer
A549 human lunge adenokarsinom celler og WS-en menneskelig fibroblaster ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). H1299 humane lungekreftceller og MCF-7 menneskelige brystkreft celler ble sjenerøst gitt av Dr. C. S. Yang og Dr Wendie Cohick, Rutgers University, NJ, henholdsvis. Dulbeccos modifikasjon av Eagles medium (DMEM) med L-glutamin, MEM vitaminblanding og MEM ikke-essensiell aminosyre løsning var fra Mediatech Cellgro (Manassas, VA, USA). Minimum Essential Medium (MEM) inneholdende Earls salter og L-glutamin, glukose fritt DMEM, fenol rød fri MEM, trypsin-EDTA-oppløsning og Lipofectamine ™ 2000 transfeksjon av reagens ble innkjøpt fra Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA). Varmeinaktivert føtalt bovint serum, krystallfiolett, protease og fosfatase-inhibitor cocktail 2, fettsyrefri bovint serumalbumin, monoklonale anti β-aktin-antistoff, AICAR, koenzym A, ATP, NADH og dimetylsulfoksyd (DMSO) var fra Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA). Nitrocellulosemembran, HPLC grad av løsningsmidler, fosfat-bufret løsning uten kalsium og magnesium og andre cellekultur forsyninger ble oppnådd fra Thermo Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA). Anti fosfor-AMPKα (Thr172) og fosfor-ACC (Ser79) antistoffer ble oppnådd fra Cell Signaling Technology Inc (Danvers, MA, USA). HRP-konjugert anti mus og anti kanin IgG var fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA, USA). D- [U
14C] glukose, ble [1-
14C] stearinsyre, og [1-
14C] natriumacetat kjøpt fra amerikanske Radiomerket Chemicals, Inc (St. Louis, Missouri, USA ). [Metyl-
3H] tymidin, [2-
3H] deoxyglucose og full-range regnbue molekylvekt markør var fra GE Healthcare Bio-Sciences Corp (Piscataway, NJ, USA). Laktat analysesett var fra Eton Biosystems Inc (San Diego, California, USA). BCA Bradford protein assay kit og super signal West pico kjemiluminescenssubstrat var fra Pierce (Rockford, IL, USA). Forbindelse C var fra Calbiochem (San Diego, CA, USA).
Cell kultur
WS-1, A549 og MCF-7 celler ble dyrket i MEM og H1299, H460 og MDA-MB -231 celler ble dyrket i DMEM. Mediet ble supplert med 10% FBS, penicillin (100 U /ml), streptomycin (10 ug /ml), 1% ikke-essensielle aminosyrer og 1% MEM vitaminløsning (vekstmedium). Celler ble dyrket ved 37 ° C, 5% CO
2, og 100% fuktighet.
Celle modeller av SCD1 inhibering
A stabilt transfektert klonal populasjon av A549-celler som bærer en antisens sekvens av det humane SCD1 genet (hSCDas) er blitt beskrevet tidligere [20]. I tillegg ble farmakologisk inhibering av SCD-aktivitet vurderes med ny kjemisk SCD-inhibitor, CVT-11127 (N- (2- (6- (3,4-diklorbenzylamino) -2- (4-metoksyfenyl) -3-oxopyrido [2, 3-b] pyrazin-4 (3H) -yl) etyl) acetamid), hvis syntese og struktur ble beskrevet andre steder [30]. CVT-11127 ble benyttet i konsentrasjoner hvori inhibering av SCD1 var større enn 95%. Den totale Inkubasjonstiden med SCD inhibitor var, i det minste til 24 timer i rekkefølge gir mulighet for en cellepopulasjon dobling.
SCD-aktivitet og de novo syntesen av fettsyrer
Δ9 desaturase aktivitet i hele -celler ble bestemt som tidligere beskrevet [19]. Kort sagt ble subsammenflytende cellemonolagene inkubert med den angitte konsentrasjon av SCD-inhibitor eller DMSO kjøretøy i dyrkingsmedia i 24 timer. Seks timer før høsting ble cellene pulset med [
14C] stearinsyre (0,25 uCi /60 mm petriskål) i kulturmedium inneholdende 0,5% bovint serumalbumin. Totale cellulære lipider ble ekstrahert i samsvar med Bligh Dyer [33] og omforestret med BF
3 i metanol i 3 timer ved 64 ° C under nitrogenatmosfære. Metylesterne ble separert ved argentation tynnsjiktskromatografi (TLC) ved å følge fremgangsmåten beskrevet av Wilson og Sargent [34] under anvendelse av en løsningsmiddelfase bestående av heksan: etyleter (90:10 på volumbasis). De radiomerket stearin og oljesyre ble oppdaget med en Storm scanner (Molecular Dynamics) og den optiske tettheten kvantifisert med Imagequant programvare. For de novo syntesen av fettsyrer, ble cellene inkubert i 6 til 24 timer med [U-
14C] glukose, eller i 24 timer med [
14C] natriumacetat i nærvær eller fravær av SCD-inhibitor. Cellulære lipider ble ekstrahert som beskrevet, og mengden av [
14C] sporstoffet inkorporeres i lipider ble normalisert til cellulære proteininnholdet i celler dyrket i parallelle petriskåler. Aliquoter av [
14C] glukose-merkede celle lipider ble forestret og nivåene av radiomerket SFA og MUFA ble bestemt ved hjelp av TLC som beskrevet ovenfor.
Bestemmelse av glukoseopptak
Preconfluent H1299 cellene ble inkubert med 1 pM CVT-11127 eller bærer i glukose-manglende DMEM i 24 timer. Cell ble deretter pulset i 7 minutter med 0,5 pCi /tallerken [
3H] deoxyglucose i DMEM inneholdende 0,5% BSA, 25 mM HEPES og 100 mikrometer glukose. Merket medium ble raskt fjernet og gjenværende merking på monolagene ble fjernet ved tre vaskinger med iskald PBS. Total radioaktivitet av cellehomogenater ble talt i en scintillasjonsteller og [
3 H] DPM ble normalisert til celleproteininnhold.
Total cellulær fettsyresammensetning
Totalt cellulære lipider fra A549 og H460 kreftceller behandlet med 10 uM eller 1 uM CVT-11127, respektivt, eller vehikkel i 24 timer ble ekstrahert som beskrevet ovenfor. Heptadecansyre (C17: 0) ble tilsatt som intern standard ved begynnelsen av lipidet ekstraksjonsprosessen. Transforestring og metylering av fettsyrer fra de totale lipider ble utført som beskrevet av Lepage og Roy [35]. Fettsyremetylester sammensetning ble bestemt ved gass-kromatografi ved anvendelse av et Varian 3800 GC (Varian Inc., Palo Alto, CA), som er utstyrt med en DB-23-kolonne (J W Scientific Inc., Folsom, CA) og FID. Fettsyremetylester identifikasjon og responsfaktorer ble bestemt ved hjelp av standard løsninger (NuChek Prep Inc., Elysian, MN). Kromatografiske topper ble identifisert ved sammenligning av deres retensjonstider med de av rene fettsyre standarder og prosentfordeling ble beregnet.
[
3H] tymidin inkorporering inn i celle-DNA
frekvensen av DNA syntesen ble estimert ved å bestemme nivået av [
3H] tymidin inkorporering i DNA etter pulsering av cellene med det radioaktivt merkede sporstoff for 2 timer, etterfulgt av utfelling av total DNA og scintillasjonstelling som beskrevet [36]. Grupper av celler ble inkubert med glukose fritt DMEM supplert med forskjellige konsentrasjoner av glukose i 22 t før tilsetning av [
3H] tymidin. I andre eksperimenter, ble den voksende media supplert med 10 mM natrium-pyruvat eller natriumsitrat i 22 timer. For SCD hemning, CVT-11127 har lagt ved de angitte doser til de voksende medier for 22 timer tidligere merkingsperioden. I alle tilfeller er den totale inkubasjonstid med metabolitter eller inhibitoren var 24 timer.
Bestemmelse av cellevekstkurver
Cellene ble sådd ut i 12 brønners plater (14.000 celler per brønn). Tjuefire timer senere, ble monolagene vasket med PBS og grupper av celler ble inkubert med 0,5 eller 5,5 mM glukose i vekstmediet. Mediene ble skiftet hver 48 timer etterpå. For noen eksperimenter ble celler inkubert i 24 timer og 48 timer med økende konsentrasjoner av natriumoleat opp til 100 uM. Cellulær proliferasjon ble beregnet ved krystallfiolett farging ved å følge prosedyren beskrevet av Menna et al. [37], med modifikasjoner. I korthet ble cellene fiksert med metanol, farget med 0,1% krystallfiolett i destillert vann og skylles tre ganger med vann. Fargestoffet i de fargede celler ble oppløst i 10% metanol, 5% eddiksyre-oppløsning og kvantifiseres ved hjelp av spektrofotometri ved 580 nm. Verdien av en tom brønn ble subtrahert i hvert enkelt tilfelle. Verdiene på ulike tidspunkt ble normalisert til dataene i 24 timer etter seeding for å unngå forskjeller på grunn av ulikhet i celle adhesjon effektivitet eller celledød.
laktat måling
For å bestemme produksjonen av laktat , 9 x 10
4-celler ble utsådd i 6-brønners plater og dyrket inntil monolag nådde 80% sammenflyting. Cellene ble deretter vasket med PBS, og dyrket i 10% FBS, fenol-fritt MEM med de indikerte konsentrasjoner av SCD-inhibitor eller vehikkel i 24 timer. For enkelte bestemmelser, ble cellene som gjennomgår en blokade av SCD aktivitet inkubert med 10 mM natriumcitrat i 24 timer. Innholdet av laktat i det kondisjonerte medium ble kvantifisert med en laktat analyse (Eton Biosciences Inc), i henhold til produsentens instruksjoner og normalisert til totalt cellulært protein.
Immunoblotting
Preconfluent celler ble behandlet som beskrevet, skyllet med iskald PBS, skrapet i kaldt hypotonisk lyseringsbuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM NaF, 1 mM EDTA, i tillegg til protease og fosfatase-inhibitor cocktail), og ultralydbehandlet. Femti mikrogram total cellulære proteiner ble oppløst ved SDS-PAGE og overført på en nitrocellulosemembran. Etter blokkering, ble membranene inkubert med polyklonalt kanin-fosfo-AMPKα (Thr172) og fosfo-ACC (Ser79) over natten eller monoklonalt mus anti β-actin i 2 timer i 1:1,000 fortynninger. Pepperrot-peroksidase-konjugerte sekundære antistoffer ble anvendt i 1:10,000 fortynninger. Proteiner på membranen ble oppdaget ved hjelp av en West pico chemiluminescence deteksjon kit og kvantifisert med en ChemiDoc (BioRad) digitalt bilde systemet med en QuantityOne programvare. Alle analyser av proteinbånd tetthet ble utført på den lineære delen av metningskurvene og normalisert til den β-aktin innhold av de samme prøvene.
Bestemmelse av celleprotein
Total cellulær proteininnhold var målt ved Bradford-metoden, ved hjelp av BSA som standard.
Statistisk analyse
Resultatene fra et representativt eksperiment med minst 3 prøver pr eksperimentelle gruppen er presentert som gjennomsnitt ± S. D. Statistisk signifikans av dataene ble bestemt ved t-test.
Resultater
Farmakologisk hemming av SCD aktivitet svekker spredning av kreftceller
Vi har tidligere rapportert at kronisk uttømming av SCD1 reduserer hastigheten av celleproliferasjon i onkogen-transformerte celler og kreftceller [19], [20]. For å evaluere den potensielle bruken av nyutviklede SCD-inhibitorer som nye anticancermidler, testet vi den potensielle veksthemmende virkning av CVT-11127, en ny små-molekyl-inhibitor av SCD-aktivitet, ved flere lungecancercellelinjer. Denne forbindelsen ble funnet å være en effektiv og desaturase-selektiv blokkering av SCD-aktivitet i rottelever-mikrosomale preparater og humane HepG2 celler [30]. Disse forfatterne rapporterte at CVT-11127 ikke hemmer aktiviteten av rotte mikrosomal Δ5 og Δ6 desaturaser ved konsentrasjoner opp til 30 uM, hvilket indikerer at CVT-11127 er selektiv for Δ9 desaturaser. Således inkuberes vi A549, H1299 og H460-celler med økende konsentrasjoner av SCD-inhibitoren i 24 timer og fant en progressiv reduksjon i frekvensen av cellereplikasjon av kreftceller i forhold til kjøretøyet (DMSO)-behandlede celler (figur 1). H1299-celler viste ~55% og 65% reduksjon i celleformering hastighet i nærvær av 1 pM og 5 uM henholdsvis CVT-11127, (figur 1A). A549-celler var mindre følsomme overfor celleveksthemmende virkning av CVT-11127, siden disse cellene redusert deres replikasjon frekvensen med 20% og 40% når de ble behandlet med 5 uM og 10 uM CVT-11127, respektivt (figur 1B). Videre er formeringshastigheten av H460-celler behandlet med CVT-11127 var 60% lavere enn vehikkelbehandlede kontroller (figur 1C), som indikerer at disse cellene er så følsom for den antivekst effekten av SCD-inhibitor som H1299 celler.
A549 (A) og H1299 (B) celler ble inkubert med med forskjellige konsentrasjoner av CVT-11127 (CVT) eller DMSO kjøretøy i 24 timer, som beskrevet, og celleformering ble bestemt ved krystallfiolett analyse. For en lignende analyse, ble H460-celler (C) behandlet med 1 um CVT-11127 i 24 timer. For bestemmelse av DNA-syntese, A549 (D) og H460 (E) celler ble inkubert med 10 pM og 5 uM CVT-11127 eller bærer i 24 timer og pulsert med [
3H] tymidin (1 pCi /skål) etter 2 timer ved 37 ° C. Total [
3H] -merket DNA ble utfelt, radioaktivitet ble kvantifisert i en scintillasjonsteller og normalisert til proteinkonsentrasjon. F, MCF-7 og MDA-MB-231 brystcancerceller, og WS-1 humane hudfibroblaster ble inkubert med 10 pM CVT-11127 (CVT) eller DMSO kjøretøy i 24 timer og celleformering ble bestemt ved krystallfiolett farging metode. E, H460-celler ble inkubert i 48 timer med 1 uM CVT i nærvær av 1, 10, 50 og 100 uM natriumoleat kompleksdannet med BSA (1:02 BSA: fettsyre-forhold). Celle inkubert med DMSO kjøretøy ble vurdert med kontrollgruppen. Cellevekst ble bestemt ved krystallfiolett farging metode. Verdier representerer gjennomsnitt ± S.D. av tre bestemmelser. *, P. 0,05 eller mindre vs kontroll av Student t test
inkubasjon med SCD hemmer også resulterte i en dyp nedgang (-60%) i inkorporering av [
3H ] tymidin inn i nylig syntetisert DNA, en tidlig markør av cellulær proliferasjon hastighet, både i A549 og H1299 cancercellelinjer (figur 1D og E). For å verifisere at den antivekst effekten av SCD kjemiske inhibitoren ikke ble celletype-spesifikk, MCF-7 og MDA-MB-231 brystcancer-celler, så vel som i normale humane WS-1-fibroblaster, ble inkubert med CVT-11127 i 24 timer og celleformering ble bestemt ved krystallfiolett farging (figur 1F). Det ble funnet at de brystkreftceller var tilsvarende følsomme overfor den cytostatiske virkning av de lite molekyl SCD-inhibitor. Imidlertid spredning av WS-1-normal hud-fibroblaster ble ikke påvirket av behandling, noe som tyder på at den antivekst effekten av SCD blokade kan være avhengig av graden av cellereplikasjon. Videre økende konsentrasjoner av oleat i cellekulturmedium som helt eller delvis reversert inhibering av celleproliferasjon i H460-celler inkubert med lite molekyl SCD-inhibitor (figur 1G). Lignende resultater ble oppnådd med H1299-celler (data ikke vist). Disse funnene tyder på at oljesyre i det vesentlige er nødvendig for fullt ut aktive replikasjon av kreftcellene.
Som ventet, ble den bakteriehemmende virkning av CVT-11127 positivt korrelert med en signifikant inhibering av SCD-aktivitet i lungekreftceller . Som vist på figur 2A-C, behandling av A549 og H1299-celler i 24 timer med 10 uM og 5 uM av CVT-11127, respektivt, reduseres SCD-aktivitet mer enn 95%, som analysert ved fremstilling av [
14C ] oljesyre fra dets radiomerkede forløper, stearinsyre. Dette bekrefter at CVT-11127 er svært effektiv til å undertrykke meget høy SCD aktivitet finnes i disse kreftcellelinjer.
For bestemmelse av Δ9-desaturating aktivitet i kreftceller, A549 (A, B) og H1299 cellene (A, C) ble behandlet i 24 timer med 10 uM og 5 uM CVT henholdsvis, eller DMSO kjøretøy. Seks timer før høsting, ble cellene pulset med [
14C] 18: 0 (0,25 pCi /parabol). Etter konvertering til metylestere, ble fettsyrer separert på sølvnitrat-impregnert TLC-plater. De radioaktive flekker svarende til SCD substrat og produkt ([
14C] 18:01), ble visualisert med en fosforavbilder (A) og kvantifisert ved densitometrisk analyse (B og C). Verdier representerer gjennomsnitt ± S.D. av tre bestemmelser. *, P. 0,05, ved Students t test
Som et resultat av reduksjonen av SCD1 aktivitet ved den lille molekyl-inhibitor, fordeling av SFA og MUFA i totale cellulære lipider av A549-celler var betraktelig endres (figur 3A og B). Forholdene MUFA til SFA både i n-7 og N-9 fettsyre serien ble redusert med 25% og 35%, henholdsvis, i celler behandlet i 24 timer med CVT-11127 i forhold til bærer-behandlede kontroller. I tillegg ble forholdene MUFA /SFA i H460-celler syntes redusert med 47% (n-7MUFA /SFA) og 60% (n-9MUFA /SFA) i celler som gjennomgår en tilsvarende behandling med CVT-11127 i forhold til DMSO-behandlede celler (figur 3C og D). Forstyrrelser i cellen MUFA innholdet av inkubasjoner med lite molekyl-inhibitor ble observert så tidlig som 1 time etter behandling (data ikke vist). Disse observasjoner viser klart at den totale fett acylkjede sammensetningen av lipidene i kreftceller er under kontroll av SCD1 aktivitet, selv når disse cellene ble dyrket i medium med FBS, som inneholder betydelige mengder av MUFA.
A549 cellene (A, B) og H460-celler (C, D) ble inkubert med 10 uM og 1 pM CVT-11127 (CVT), respektivt, eller DMSO i 24 timer. Cellulære lipider ble ekstrahert og fettsyrer ble omdannet til sin metylester form ved transforestring, som beskrevet i Materialer og Metoder. Fettsyremetylester sammensetning ble bestemt ved gasskromatografi og prosent fordeling av fettsyrer ble beregnet. Verdier uttrykker forholdet 18: 1n-9/18: 0 (A, C) og 16:01-n7 + 18: 1n-7/16: 0 (B, D), og representerer gjennomsnitt ± S.D. 4-5 prøver. *, P. 0,01 eller mindre, av Student t test
Hemming av SCD1 reduserer de novo fettsyntese fra glukose
Kreftceller har endret et sett av signal- og metabolske veier til øke bruken av glukose som hoved substrat for makromolekylære biosyntese og for energigenererende reaksjoner [38]. Tidligere viste vi at kronisk utarming av SCD1 undertrykker den generelle hyppigheten av lipogenese [19], [20]. For å dissekere mekanismene for metabolske regulering av SCD1, undersøkte vi effekten av akutt inhibering av SCD-aktivitet med den nye lite molekyl CVT-11127 på lipogenic veier. For å dokumentere effekten av akutt SCD inaktivering på glukose-formidlet lipid-biosyntesen, ble A549 og H1299-celler behandlet med SCD-inhibitor eller bærer i 6 timer og 24 timer henholdsvis, og dannelsen av det totale cellulære lipider fra [
14C] glukose var fast bestemt. Som vist i figur 4A og B, ble inkorporering av radioaktivt merket glukose i totale cellulære lipider signifikant nedsatt (30%) i SCD-inhibitor-behandlede H1299 og A549-celler i forhold til bærer-behandlede kontroller. Som tidligere observert [20], inkorporering av radioaktivt merket glukose i totale lipider ble redusert med ~ 20% i stabil SCD1-knockdown A549 (hSCDas) celler (figur 4C), som bekrefter at tilstedeværelsen av en fullstendig aktiv SCD1 er avgjørende for å opprettholde den akselererte glukose-mediert lipogenese i kreftceller. Endringen i dannelsen av [
14C] glukose-merkede lipider ble ikke forårsaket av en mangelfull opptak av glukose fordi vi ikke observert noen endringer i frekvensen av [
3H] deoxyglucose opptak i celler behandlet med CVT eller kjøretøy ( Figur 4D). Inkorporering av radioaktivt merket glukose inn i fettsyrer av kreftcellelipider, ble redusert ved behandling med CVT (figur 4E), noe som tyder på at den unormale dannelsen av lipider i cellene som gjennomgår inhibering av SCD1 kan være forårsaket av en defekt de novo biosyntesen fettsyre. Som forventet ble produksjonen av glukose-merket MUFA nesten fullt trykt i H1299 celler med en blokk i SCD aktivitet (figur 4E, øvre panel). Videre synes den biokjemiske forandring i lipogenese i celler med kjemisk blokkering av SCD for å bli plassert nedstrøms dannelsen av acetylCoA siden en redusert dannelse av [
14C] acetat-merkede lipider ble observert i CVT-behandlede H1299-celler i forhold til kjøretøyet -behandlede kontroller (figur 4F).
A549-celler (A) og H1299-celler (B) ble inkubert med 10 uM og 1 pM CVT-11127 (CVT), respektivt, eller DMSO i 24 timer. Cellene ble deretter pulset med 1 uCi D- [U
14C] glukose i opptil 24 timer. C, A549 celler med en stabil knockdown i SCD1 uttrykket (hSCDas) og mock-transfekterte kontrollceller ble utsatt for en tilsvarende inkubering med [
14C] glukose. Cellulære lipider ble ekstrahert og inkorporering av [
14C] glukose i totale lipider ble kvantifisert ved scintillasjonstelling og normalisert til proteinkonsentrasjon. D, basal glukoseopptak ble analysert i H1299 celler behandlet med 1 mikrometer CVT eller kjøretøy i 24 timer ved å estimere opptaket av [
3H] deoxyglucose. E, H1299-celler ble inkubert med [
14C] glukose i nærvær eller fravær av 1 pM CVT i 6 timer, og nivåer av total [
14C] fettsyrer, så vel som radiomerket SFA og MUFA (øvre panel), ble bestemt ved argentation TLC som beskrevet i Materialer og metoder. F, frekvensen av lipidsyntese i H1299-celler ble bestemt ved inkubasjon med 1 mM CVT eller kjøretøy og 0,5 uCi /skål av [
14C] acetat i 24 timer. Lipider ble ekstrahert og radioaktiviteten av de totale lipider ble bestemt ved scintillasjonstelling. Verdier representerer gjennomsnitt ± S.D. av tre bestemmelser. *, P. 0,05 eller mindre, av Student t test
Stimulering av glykolyse /lipogenese ikke reversere redusert spredning av SCD1-mangel celler
Som beskrevet ovenfor, både akutte farmakologiske blokade av SCD aktivitet og stabil genet knockdown av SCD1 vesentlig endre satsene for glukose-mediert lipogenese og celle replikering. Vi antok at en forstyrrelse i aerob glykolyse kan være den primære årsaken til nedsatt proliferasjon og overlevelse av SCD1-manglende celler ([19], [20] og figur 1). Vi så bestemt frekvensen av glykolyse i A549 og H1299 celler ved å vurdere nivået av laktat i de betingede media, en indikator på aerob glycolytic sats i kreftceller [39], og fant en økning på 30-60% i cellene gjennomgår farmakologisk hemming av SCD sammenlignet med kjøretøy-behandlede kontroller (figur 5A). For å bekrefte at en endring i fluksen av glykolytiske metabolitter var ikke ansvarlig for mangelfull replikering av SCD1-ablated celler inkubert vi cellene i medium som inneholder svært lave (0,5 mm), normal (5,5 mm) eller høy (25 mm) nivåer av glukose og bestemmes graden av DNA-syntese og cellevekst. Som vist for andre cancercellelinjer, A549-celler viste streng glukose avhengighet for proliferasjon (figur 5B). Når dyrket i det vesentlige glukosefritt MEM (inneholdende ~0.5 mM glukose fra 10% FBS-tilskudd) i 24 timer, inkorporering av radioaktivt merket tymidin i DNA i SCD1-manglende (hSCDas) og kontrollceller ble redusert med 70% når sammenlignet med celler som vokser under dyrkningsbetingelser som standard (5,5 mM glukose). Imidlertid er betydelig redusert hastighet av DNA-syntese ble observert i SCD1-ablateres celler vedvarte uavhengig av glukosenivået i kulturmedier.
