Abstract
innen kreftforskning og behandling har gjort betydelige fremskritt, men vi er langt fra å ha helt trygge, effektive og spesifikke behandlinger som er rettet mot kreftceller og overs sunne vev. Naturlige forbindelser kan redusere problemene i forbindelse med kreftbehandling. For tiden er mange planteprodukter som brukes for å behandle kreft. I denne studien ble Rohitukine, en naturlig forekommende alkaloid kromon ekstrahert fra
dysoxylum binectariferum
, ble undersøkt for cytotoksiske egenskaper mot spirende gjær, så vel som mot lungekreft (A549) celler. Vi forsøkte å spesifikt studere Rohitukine i
S
.
cerevisiae
i sammenheng med MAPK trasé som gjær representerer trolig den eksperimentelle modellen hvor organisasjonen og regulering av MAPK trasé er best forstått. MAPK er evolusjonært konserverte proteinkinaser som overfører ekstracellulære signaler til maskiner kontrollere viktige cellulære prosesser som vekst, migrasjon, differensiering, celledeling og apoptose. Vi tar sikte på å gjennomføre hypotese drevet studier mot målretting viktig nettverk for mobil kommunikasjon, en kritisk prosess som får forkjært i kreft. Ansette mutantstammer av genetisk modellsystem
Saccharomyces cerevisiae
.
S
.
cerevisiae
koder for fem MAPK er involvert i kontroll av forskjellige cellulære responser som vekst, differensiering, migrasjon og apoptose. Vår studie innebærer genet knockouts av
Slt2 Hotell og
Hog1
som er funksjonelle homologer av menneskelig ERK5 og pattedyr p38 MAPK, hhv. Vi utførte cytotoksisitet assay for å evaluere effekten av Rohitukine på cellenes levedyktighet og også bestemmes effekten av medikamentet på generering av reaktive oksygenforbindelser, induksjon av apoptose og ekspresjon av
Slt2
og
Hog1
gen ved mRNA-nivå i nærvær av medikament. Resultatene av denne studien viser en differensiell effekt på aktiviteten av stoffet mellom WT,
Slt2 Hotell og
Hog1
genet sletting belastning indikerer involvering av MAPK veien. Videre undersøkte vi Rohitukine indusert cytotoksiske effekter i lungekreft celler og stimulert produksjoner av ROS etter eksponering i 24 timer. Resultater fra Western-blotting tyder på at Rohitukine utløste apoptose i A549-cellelinjen ved oppregulering av p53, caspase9 og nedregulering av Bcl-2-protein. Omfanget av denne studien er å forstå mekanismen av anticancer aktivitet av Rohitukine å øke repertoaret av kreftmedisiner, slik at problemet skapt av utvikling av resistens mot standard kreft forbindelser kan lindres
Citation:. Safia, Kamil M, Jadiya P, Sheikh S, Haque E, Nazir A, et al. (2015) The kromon Alkaloid, Rohitukine, gir Anti-Cancer aktivitet via moduler apoptose Pathways i A549-cellelinje og gjær Mitogen Aktivert protein kinase (MAPK) Pathway. PLoS ONE 10 (9): e0137991. doi: 10,1371 /journal.pone.0137991
Redaktør: Muzamil Ahmad, Indian Institute of Integrative Medicine, INDIA
mottatt: 13 april 2015; Godkjent: 24 august 2015; Publisert: 25.09.2015
Copyright: © 2015 Safia et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. forfatterne er finansiert av Integral University og University Grant Commission India. Ms Safia er takknemlig for Universitetet Grants Commission (UGC), Government of India for Maulana Azad National Fellowship, (F1-17.1 /2011 /MANF-MUS-UTT-5405). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
den stadig utvikling lidelse av kreft er montering sine utfordringer på forskere og klinikere som sykdommen fortsetter å pålegge enorm mengde helsebelastning på en ødeleggende global skala. Betydelig forståelse av mekanistiske signaler har blitt oppnådd gjennom forskningsarbeidet som nå har vist at denne sykdommen finner en sterk årsak i endret kommunikasjon mellom og innen celler [1]. Hittil effektive ikke-kirurgiske behandlinger mot sykdommen inkluderer kjemoterapi og strålebehandling baserte behandlingsregimer. Men en rekke potensielle anti-kreft terapier, basert på molekyler fra naturlig opprinnelse, har vist lovende i behandling av kreft, mens utøver minimal uønskede effekter (anemi, kvalme og håravfall) og møte utfordringen med legemiddelresistens [2]. I tillegg til bivirkning og medikamentresistens, er kostnaden for kjemoterapi medikament også meget høy sammenlignet med den naturlige forbindelsen fra den medisinske planter
Rohitukine (C16H19NO5;. 5, 7-dihydroksy-8- (3- hydroxy-1-metyl-4-piperidinyl) -2-metyl-4H-kromen-4-en), isolert fra
Amoora rohituka
,
dysoxylum binectariferum Hotell og
Schumanniophyton problematicum
, er kjent for å ha anti-inflammatorisk, anti-implantasjon, anti-fruktbarhets, anti-proliferative og immunmodulerende egenskaper [3]. Men anticancer virkningsmekanismen til Rohitukine ikke er kjent og som per vår forståelse for første gang det har blitt evaluert i genetisk modellsystem av spirende gjær samt i lunge kreftceller. Hundrevis av gjær gener viser en kobling til menneskelige sykdomsgener som nesten 30% av beryktede gener involvert i menneskelige sykdommer har gjær ortologer [4]. Det er interessant å merke seg at 47% av gjærgener kunne full humaniseres [5].
S
.
cerevisiae
hjelper også i å avsløre viktige aspekter av mange sykdommer som Nevrofibromatose type l, tykktarmskreft [6].
Vi forsøkt å spesielt studere Rohitukine i
S
.
cerevisiae
i sammenheng med MAPK trasé som gjær representerer den eksperimentelle modellen hvor organisasjonen og regulering av MAPK trasé er best forstått [7]. MAPK er evolusjonært konserverte proteinkinaser som overfører ekstracellulære signaler til maskiner kontrollere viktige cellulære prosesser som vekst, migrasjon, differensiering, celledeling og apoptose. Derfor er mutasjon i noen av kinaser av disse banene direkte knyttet til kreft [8]. Det er derfor hensiktsmessig å konsentrere ytterligere forskningsinnsatsen mot utforme mekanismebaserte anti-cancer forbindelser som virker på spesifikke molekylære mål knyttet til etiologien av sykdommen [9]. Derfor kinase kaskade presenterer nye muligheter for utvikling av nye kreftbehandlinger designet for å være mindre giftige enn konvensjonelle cellegifter [10]. Studiene ble utført ved å anvende genetisk modellsystem
Saccharomyces cerevisiae
som det har vært med fordel utnyttet for å belyse den kreftbehandling i forbindelse med eksponering for 5-fluorouracil [11]. Gjær er også verdsatt som et slående modell for kreft narkotika forskning [12] som det har vist seg nyttig i å avdekke de cellulære mål av forskjellige stoffer, inkludert dyrebare anti-kreft narkotika KP1019 [13]. Den spirende gjær har fem typer MAPK inkludert: Fus3, Kss1, Smk1, Hog1 og Slt2. Slt2 er MAPK av celleveggen integritet reaksjonsvei og funksjonell homolog av human ERK5 som blir aktivert i respons til vekstfaktorer og stressbetingelser [14]. Hog1 er funksjonell homolog av pattedyr p38 MAPK og er hovedsakelig aktivert i respons til osmotisk stress [15].
De rapporterte her studiene, gjøre bruk av den genetiske modellsystemet
S
.
cerevisiae
mot tyde effekten av Rohitukine på alle viktige prosessen med mobil kommunikasjon formidles av MAP kinase vei, og dermed påvirke cellular overlevelse og død via apoptose. Studien undersøker også effekten av Rohitukine på apoptose innen human lungekreft cellelinje og utforsker de mulige mekanismene som er involvert via studier på viktige modulatorer av prosessen.
Materialer og metoder
Utvinning av Rohitukine
Rohitukine ble isolert fra stammen av
dysoxylum binectariferum
som beskrevet tidligere [16]. I korthet, ble lufttørket stammen bark av planten ekstraheres med 95% etanol og deretter konsentrert ved redusert trykk. Det er videre fraksjoneres i fire fraksjoner (kloroform, oppløselig n-butanol, n-heksan og uoppløselig n-butanol fraksjon). Fra kloroform fraksjon, en kjent alkaloid rohitukine {5,7-dihydroksy-2-metyl-8- [4- (3-hydroksy-1-metyl) piperidinyl] -4H-1-benzopyran-4-on)} ble isolert ved gjentatt kolonnekromatografi over silikagel og ytterligere rensing ved HPLCLC- 20AD bruk av metanol oppløsningsmiddel 55:45 volum /volum, strømningshastighet 1,0 ml /min. Karakteriseringen av forbindelsen ble utført ved hjelp av IR, NMR, masse, derivatisering, og sammenlignet med tilgjengelige litteratur. Renheten av rohitukine var 99,6%, og utbyttet var 1%.
Gjær kultur og vedlikehold
I denne studien, Wild type belastning BY4741 (Mata his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) og knockout stamme av
Slt2 Hotell og
Hog1
genet (gave fra Dr. A. Chakrabarti og Dr. RC Meena fra Forsvarets institutt for fysiologi og allierte Sciences, DRDO, India) ble ansatt. Gjærcellene ble dyrket i YPD medium (1% gjærekstrakt, 2% Bactopeptone, 2% glukose) i henhold til fremgangsmåten som er beskrevet tidligere [17].
Bestemmelse av minste inhiberende konsentrasjon
Minimum hemmende konsentrasjon (MIC) av stoffet ble bestemt både spektrofotometrisk (ved å måle OD ved 600 nm ved hjelp av flere brønner mikroplateleser: Multi Skan, Thermo Scientific) og visuelt. Rohitukine ble oppløst i dimetylsulfoksyd. MIC for Rohitukine ble bestemt ved å plotte O.D. ved 600 nm versus konsentrasjon av medikament (20 ug /ml til 100 ug /ml) [18]. Konsentrasjonen ved MIC av medikamentet ble anvendt i alle forsøk.
Evaluering av vekstinhibering ved å fange opp assay
Etter behandling vekstinhibering av gjærcellene ble bestemt ved å fange opp assay. Celler ble dyrket på standard gjærekstrakt-pepton-dekstrose (YPD) media. For Spotting analyser, ble 5-fold serielle fortynninger i YPD media fremstilt fra eksponentielt voksende kultur av de ulike stammene. 2 ul av hver fortynning ble deretter flekket på YPD-plate i fravær og nærvær av medikamentet [19] .De vekst forskjeller ble registrert etter inkubering av platene for 24 timer ved 30 ° C.
Påvisning av reaktive oksygenarter (ROS ) i spirende gjær
påvisning av reaktive oksygenforbindelser ble utført ved å bruke 2 «7» Dichlorofluoresceindiacetate (H2-DCF-dA;. Cat No.-D399, Invitrogen) flekker som tidligere beskrevet med noen modifikasjoner [ ,,,0],20]. Kort fortalt ble nivåer av ROS målt etter 24 timers behandling ved å legge 0,5 pm av H2-DCF-DA til celler i 15 minutter i mørket. Cellene ble vasket tre ganger med 1 x PBS. Fluorescens mikroskopi ble utført ved anvendelse av et Zeiss Axioplan-2 mikroskop ved bruk av en eksitasjonsbølgelengde på 485 nm og en emisjonsbølgelengde på 520 nm. ROS produksjonen ble kvantifisert ved hjelp av image J programvare (Bilde J, National Institutes of Health og Bethesda, MD). Totalt 50 celler fra hver gruppe ble kvantifisert for fluorescens intensitet og statistisk signifikans ble beregnet i forhold til ubehandlet kontrollgruppe.
Evaluering av mitokondrie innhold ansette MitoTracker Deep Red farging
For å kontrollere effekten av narkotika på mitokondrie innhold, ble Mito Tracker Deep Red farging (Cat. No.-22426, Invitrogen) gjort som beskrevet tidligere med noen endringer [20]. Kort sagt ble 100 pl gjærceller inkubert med 100 nM Mito Tracker flekk i 50 minutter ved 30 ° C i mørket, etterfulgt av vasking tre ganger i 1 x PBS. Avbildning av celler ble utført ved anvendelse av fluorescens-mikroskop med en eksitasjonsbølgelengde på 637 nm og en emisjonsbølgelengde på 660 nm. Fluorescens intensitet av mitokondrieinnhold ble kvantifisert ved hjelp av Image-J programvare.
analyse for apoptotisk celledød ved hjelp Acridine Orange (AO) farging
Acridine oransje farging ble gjort for å sjekke induksjon av tidlig stadium apoptose . Akridinorange (Hi-media- 116) ble oppløst i PBS (pH = 7). Et 100 ul volum av gjærceller ble farget med 1 ul av 2,5 mg /ml AO for å få arbeidskonsentrasjon på 25 ug /ml. Farging ble utført i 30 minutter i mørket og cellene ble vasket med PBS [21]. Avbildning av fargede celler ble utført ved anvendelse av fluorescens-mikroskop med en eksitasjonsbølgelengde på 502 nm og en emisjonsbølgelengde på 520 nm. Fluorescensintensiteten av fargede celler ble kvantifisert ved Bilde J programvare.
Assay for å studere DNA-fragmentering
DNA-fragmentering ble bestemt ved Nuc blå levende celle Stain (R37605 Liv Technology Corporation) i henhold til produsentens instruksjoner . Avbildning av fargede celler ble utført ved fluorescens mikroskop med en eksitasjonsbølgelengde på 352 nm og en emisjonsbølgelengde på 460 nm og fluorescens-intensiteten av fargede celler ble kvantifisert ved Bilde J programvare.
Semi-kvantitativ revers transkripsjon PCR for det analyse av mRNA nivåer av
Slt2 Hotell og
Hog1
genet i nærvær av Rohitukine
Total RNA ble ekstrahert og revers transkribert ved hjelp av Tilbakestill Aid ™ First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas life Sciences, Cat- K1622). cDNA ble forsterket ved bruk av spesifikke primere er oppført i tabell 1 og PCR-produkter ble separert på 1,5% agarosegel og visualisert ved etidiumbromidfarging.
Protein-ligand interaksjoner ansette dataverktøy
3-dimensjonale (3D) struktur av p38 og ERK5 brukes for docking studien ble hentet fra Protein databank med PDB ID-er: 1WFC og 4IC8 hhv. Strukturen av ligand (Rohitukine) (CID: 13422573) ble åpnet fra «pubchem sammensatte «. Bruke Autodock verktøy avgjørende hydrogenatomer, Kollman forent atom typen kostnader, og solvatisering parametere ble lagt til. Affinity (grid) kart over 60 × 60 × 60 et rutenett poeng og 0.375 Å mellomrom ble generert ved hjelp av Autogrid program rettet mot målretting grid koordinater i nærhet med det aktive området av mål. Følgelig verdiene av x, y og z-koordinater som brukes for målretting Hog1 og ERK5 aktive området var henholdsvis 18,783, 35,698, 30,394 for Hog1 og 15,928, -17,057, 1,101 for ERK5. Dokkingsimuleringer ble utført ved hjelp av Lamarckian genetiske algoritmen (LGA) og Solis Wets lokale søkemetode. Ti forskjellige forsøk ble utført for hver dokking. De endelige tallene ble generert ved hjelp av Discovery Studio Visualizer (Accelrys).
Cell Culture
A549 celler (human kreft cellelinje lunge) ble hentet fra Nasjonalt senter for Cell Sciences (NCCer) Pune, India, og dyrket i DMEM (Dulbeccos modifiserte Eagles Media) F-12 (1: 1) (HiMedia AL187A) supplert med 10% føtalt bovint serum, 0,2% natriumbikarbonat og 1% antibiotisk og antimykotisk løsning. Kulturer ble holdt ved 37 ° C og 5% CO2 og 95% fuktig atmosfære.
MTT-analysen
MTT (HiMedia-TC191) -analyse er basert på reduksjonen av MTT av mitokondriell dehydrogenase til en lilla formazanprodukt, gir en indikasjon av mitokondriell integritet, som blir tolket som vurdering av prosent cellelevedyktighet [22]. I korthet ble cellene sådd ut i 96-brønners vevkulturplater (10
4 celler /brønn) i fullstendig DMEM F-12-medium, fulgt av inkubering i 5% CO2, 95% atmosfære i 24 timer ved 37 ° C. Etter 24 timer eksponering av medikament (10 uM-60 uM), MTT (5 mg /ml lager i PBS) ble tilsatt (10 ml /brønn i 100 ml cellesuspensjon), og platene ble inkubert i 4t. Etter inkubering ble reaksjonsblandingen forsiktig tatt ut, og 200 ul dimetylsulfoksid (DMSO) ble tilsatt til hver brønn, innholdet ble godt blandet ved å pipettere opp og ned flere ganger. Platene ble holdt på vipperisteapparat i 10 min ved romtemperatur og deretter avlest ved 550 nm ved bruk av flere brønner mikroplateleser (Multi Skan, Thermo Scientific). Ubehandlede celler ble utført under identiske betingelser, og tjente som basal kontroll. Hvert eksperiment ble gjentatt tre ganger og standardavvik ble utledet fra tre uavhengige eksperimenter.
Fastsettelse av reaktive oksygen arter (ROS) i lungekreftceller
ROS generasjon ble beregnet ved hjelp av 2 «, 7» -diclorodihydrofluorescein di-acetat (H2-DCF-dA;. Cat No.-D399, Invitrogen) som beskrevet tidligere [23]. I korthet ble cellene sådd ut i sort 96-brønns plate ved en densitet på 10
4 celler /brønn ble inkubert med 1 mM H2-DCF-DA; i 30 minutter ved 37 ° C, etterfulgt av inkubasjon med forskjellige konsentrasjoner av medikament i 24 timer. Målingen av ROS ble utført i løpet av behandlingsperioden ved 485 nm eksitasjon og 535 nm emisjonsbølgelengder. ROS generasjon ble også bekreftet av fluorescens mikroskopibilde av mobilnettet ROS. I korthet ble cellene sådd ut i 48-brønners vevkulturplate og behandlet med 1 mM H2-DCF-DA; i 30 minutter etterfulgt av inkubasjon med forskjellige konsentrasjoner av Rohitukine i 24 timer ved 37 ° C. Fluorescens bildene ble tatt med en Zeiss Axioplan-2 mikroskopet med FITC filteret under 20X objektiv.
Isolering av totalt celleprotein fra A549 celler
Rohitukine behandlede og ubehandlede celler ble pelletert, vasket med kald PBS og lysert i RIPA-lyseringsbuffer inneholdende 1 mM EDTA, 50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,25% natrium-deoksycholat, 0,1% SDS, 1 mM NaF, 1 mM Na
3VO4, 1 mM PMSF og 1 ug /ml leupeptin [24]. Cellelysat ble forsiktig blandet i 30 sek etter 1 time inkubasjon i lyseringsbuffer. Supernatanten ble samlet opp ved sentrifugering ved 14 000 x g i 15 minutter og lagret i alikvoter ved -20 ° C. Proteininnhold ble kvantifisert ved hjelp av Bradford-proteinanalysen.
Western Blot Analyse Detecting apoptose-relaterte proteiner
Cellelysater ble denaturert og tyve mikrogram av proteinet ble separert på 12% SDS-polyakrylamid-gel-elektroforese. Det ble elektro-overført til PVDF-membran. Membranene ble blokkert ved romtemperatur med 5% skummet melk i Tris-bufret saltvann (TBS) med 0,05% Tween-20 (TBS-T) i 2 timer. Etter vasking med TBS-T-membraner ble inkubert med primære antistoffer mot p53 (1: 3000), caspase9 (1: 3000), Bcl-2 (1: 5000) og β-aktin (1: 4000) for over natten ved 4 ° C. Etter vasking, ble membranen inkubert med HRP-konjugert sekundært antistoff (anti-kanin eller anti-mus, 1: 10000; Invitrogen, USA) ved romtemperatur i 1 time. Western blot bånd ble påvist ved anvendelse av kjemiluminescens substrat (Millipore) ved hjelp av Chemidoc (GE). β-aktin ble benyttet som intern kontroll for lik belastning og normalisering av protein. Protein Stige (3B BlackBio Biotech-3B75) (3.5-245kDa) ble anvendt for å bestemme molekylvekten av proteinbåndene. Densitometry av bandene som oppnås ble gjort ved NIH programvare Bilde J versjon 1.41 (USA).
Statistisk analyse
Alle resultater er presentert som gjennomsnitt ± SEM Statistisk signifikans mellom ulike grupper ble gjennomført ansette Student t-test ved hjelp av Graph Pad prisme 5-programvaren. For
in vitro
studiedata ble uttrykt som gjennomsnitt ± S.D. og statistisk signifikans av resultatene ble bestemt ved hjelp av enveis ANOVA av Tukey multippel sammenligningstest.
Diskusjon
ΔSlt2 og ΔHog1 stammer
Resultater og er overfølsom mot Rohitukine behandling
I denne studien, bestemt vi cytotoksisitet av Rohitukine i spirende gjær og også undersøke om MAP kinase pathways er involvert i Rohitukine indusert celledød, så vi bestemt effekten av Rohitukine på cellelevedyktigheten til ΔSlt2 og ΔHog1 stammer. Rohitukine viser cytotoksisitet mot all slags gjærstammer. MIC
50 for Rohitukine ble bestemt ved å plotte O.D. ved 600 nm versus konsentrasjoner av stoffet. MIC
50 verdi for WT ble funnet å være 80 ug /ml og for begge gen knock-out-stammer ble funnet å være 60μg /ml. Alle forsøk ble utført ved doser under MIC
50 verdi (40μg /ml). Figur 1 viser at Rohitukine utøver cytotoksiske effekter på gjær. Selv om konsentrasjonen av Rohitukine som dreper ca. 50% av gjærceller som er høyere enn IC
50 verdiene rapportert for kreftceller in vitro [25] dette resultatet er ikke overraskende, gitt at gjær ofte vise høyere nivåer av resistens mot antineoplastiske midler [ ,,,0],26] det er sannsynlig at nærværet av gjærcelleveggen kan være obstruksjon av medikamentet inntreden i cellen, og mange eksport transporter som vil interferere med oppføring av medikamentet inne i cellen og gjærceller er også meget effektive for å redusere intracellulære konsentrasjonen av giftige små molekyler ved hjelp av et stort antall transportproteiner [27].
(a) gjærceller levedyktighet ved forskjellig konsentrasjon av Rohitukine etter 24 timers behandling, 5-gangers seriefortynninger fra eksponentielt voksende kulturer av WT, ΔSlt2 og ΔHog1 stammene ble prikket på YPD-medium inneholdende 40 ug /ml, 80 pg /ml og 100 ug /ml medikament. (B) Prosentandelen av overlevende celler i forhold til ubehandlede kontroller.
Resultatene viste at genet knockout-stammer var mer følsom for medikamentet, sammenlignet med WT-stamme på samme MIC (40μg /ml) som vist av tettheten av flekker i spotting assay for celle-levedyktighet (fig 1 A) og av OD ved 600 nm (figur 1B) Resultat av spotting analyse bekreftet at gjærcellene når behandlet med Rohitukine tapt cellelevedyktighet på doseavhengig måte. Ved WT celler kontroll stedet ble scoret som 0, 40μg /ml Rohitukine behandlede celler stedet ble scoret som en, celler ble scoret som to på 80 ug /ml stoff, og på 100 ug /ml celler sted scoret som 3 etter 24 timer med medikamentell behandling. For begge typer genet knockouts (Δslt2, Δhog1) belastning kontroll stedet ble scoret som 0, 40μg /ml legemiddelbehandlede celler scoret så to, 80 ug /ml legemiddelbehandlede celler scoret som 3 og 100 ug /ml legemiddelbehandlede celler scoret som 4 etter 24 timer med medikamentell behandling. ΔSlt2 stammen var overfølsom til ulike gentoksiske stoffer med forskjellig virknings inkludert methylmetanosulfonate, UV-stråling og phleomycin [28]. Slt2 aktivering etter induksjon av en enkelt DSB (double-strand brudd) i GAL1: HO-stamme, som har en spesifikk effekt på integriteten av DNA, som viser en ekte rolle for Slt2 i respons på belastning genotoksiske [29]. Følgelig blir disse genene aktivert i nærvær av medikament i WT-celler slik at det kan være mulig at ΔSlt2 og ΔHog1 stammer viste overfølsomhet overfor medikamentet [30].
Rohitukine utløser celledød ved å indusere oksidativt stress og reduserende mitokondrielle innhold i ΔSlt2 og ΔHog1 stammer
ROS produksjon ble målt til å analysere rollen ROS i gjær celledød mediert av Rohitukine. Vi fant ut at Rohitukine indusert betydelig mengde ROS etter 24 timer med behandling i WT og i genet knockout stammer (Fig 2A). Kvantifisering av fluorescensintensitet av H2-DCF-DA-farging (figur 2B) viste også at Rohitukine behandlede gjærceller som produseres forhold økte nivåer av ROS sammenlignet med ubehandlede celler, øker blir 1,3 (P 0,001), 2,0 (P 0,001) og 1,7 (P 0,001) fold for WT, ΔSlt2 og ΔHog1 stammer henholdsvis etter Rohitukine behandling sammenlignet med ubehandlede kontrollceller. Men ΔSlt2 og ΔHog1 stammer produsert mer ROS i forhold til WT celler etter behandling og øke være 1,4 (P 0,001) og 1,2 (P 0,001) fold for ΔSlt2 og ΔHog1 stammer henholdsvis i forhold til WT etter behandling, noe som ytterligere forsterker overfølsomhet for både mutante stammer til stoffet. Dette avviket kan være på grunn av fravær av MAPK som er kjent for å bli aktivert av oksidativt stress. I tillegg MAPK manglende gjærceller akkumulerer ROS i en høyere grad enn WT-celler i løpet av stasjonær fase [31]. MAP-kinase-trasé påvirkes ikke bare av reseptor-ligand interaksjoner, men også ved forskjellige stressfaktorer som oksidativt stress indusert potensial aktivering av MAPK veier. Vanligvis økes ROS produksjon i cellene fører til aktivering av MAPK men de mekanismer som ROS kan aktivere disse kinaser er uklare [32]. Disse mutantene kan bli svekket i autofagi sti som er nødvendig for å hindre overdreven ROS akkumulering. Manglende evne til å øke ekspresjonen av respiratoriske kjede-komponenter og ROS fjerningsmidler sannsynligvis fører til opphopning av ROS i Autophagy-defekte celler.
S
.
cerevisiae
Hog1 MAPK blir aktivert som respons på høy osmolaritet, og er nødvendig for celleoverlevelse under disse betingelser [33]. Som svar på flere påkjenninger, blir Hog1p fosforylert og translocates til kjernen. Hog1 null mutanter ble funnet å være overfølsom for de stressbetingelser som fører til Hog1p aktivering, i særdeleshet til ekstracellulære oksydasjonsmidler [34].
(a) DCFDA farging (b) Grafisk fremstilling av Relativ dannelse av reaktive oksygen arter (ROS) målt ved H2DCFDA flekker i WT og genet knockout stammer av gjær som kvantifisert ved hjelp av Image J programvare *** p 0.001 (c) Mitotracker Deep Red farging (d) Grafisk representasjon for fluorescens intensitet av mitokondrieinnholdet i den spirende gjær som kvantifisert ved hjelp av Image J programvare *** p .. 0.001
Vi har også sjekket enten Rohitukine eksponering påvirker mitokondrie innhold. Vi har observert at mitokondrie-innhold redusert til en større grad i ΔSlt2 og ΔHog1 belastning etter 24 timers behandling Rohitukine men WT celler som viste økning i mitokondriene innhold etter medikamentbehandling (figur 2C). Kvantifisering av fluorescens intensitet av mitokondrieinnhold (Fig 2D) viste at Rohitukine behandlet WT celler som viser en 1,6 (P 0,001) dobling mens Rohitukine behandlet ΔSlt2 og ΔHog1 stammer stiller 1.2 (P 0,001) og 2,0 (P 0,001) fold reduksjon henholdsvis sammenlignet med deres ubehandlet kontroll. Men viste ΔSlt2 2,3 (P 0,001) og ΔHog1 belastning utstilt 2,2 (P 0,001) fold reduksjon sammenlignet med WT i nærvær av narkotika
mitokondriene spiller også en svært viktig rolle i reguleringen av mange mekanismer. kontrollerende celle overlevelse og død [35]. Endringer i mitokondriene er knyttet til aldring, redusert syntese av mitokondrielle proteiner og redusert aktivitet av oksidative enzymer føre til nedgang i mitokondriell ATP syntese [36]. MAP-kinase-reaksjonsveier er involvert i apoptose iboende i nærvær av isoorientin i humane hepatoblastoma cancerceller [37]. Flavopiridol (Rohitukine derivat) forårsaker celledød ved reduksjon i mitokondriemembranen potensialet i humane leukemiceller [38]. Flavopiridol fører også STI571 (Bcr /abl kinase inhibitor) indusert apoptose og skader av mitokondrier og apoptose i BCR-ABL-positive humane leukemiceller [39]. Følgelig MAPK mutanter viser økt produksjon av ROS som kanskje den sannsynlige årsaken som fører til mitokondriene dysfunksjon.
Rohitukine forårsaker induksjon av tidlig stadium apoptose og DNA-skader i gjær
Data AO farging viste at Rohitukine fører til induksjon av apoptose i genet knockout-stammer sammenlignet med WT-stammen etter 24 timers medikamentbehandling (figur 3A). Kvantifisering av fluorescens intensitet av AO farging (figur 3B) viste at WT, ΔSlt2 og ΔHog1 flekker av gjær viser en 1,3 (p 0,001), 2,0 (p 0,001) og 1,7 (p 0,001) gangers økning på henholdsvis etter behandling som sammenlignet med deres ubehandlet kontroll. Imidlertid ΔSlt2 stamme viste 1,7 (p 0,001) og ΔHog1 belastning oppviste 1,2 (p 0,001). Ganger økning sammenlignet med WT-stamme når de ble behandlet med Rohitukine
(a) på bl.a. farging (b) Grafisk representasjon for fluorescensintensitet av apoptotisk død av gjærcellene som kvantifiseres ved hjelp av Image software J *** p 0,001 (c) DNA-skade åpenbart av Nuc blå levende celle Stain (d) Grafisk representasjon for fluorescensintensitet av nukleinsyre av gjærcellene som kvantifiseres ved hjelp av Image software J *** p 0,001.
Vi har også observert DNA-fragmentering etter 24 timer med behandling på MIC etter NucBlue levende celle Stain for DNA. Resultat av DNA-farging (figur 3C) viste klart DNA-fragmentering i WT, så vel som i begge typer av genet knockout-stammer etter medikamentbehandling som indikerer en apoptotisk fenotype. Vi kvantifisert bilder for fluorescens-intensiteten av DNA-farging (figur 3D). Det var 1,5 (p 0,001), 3,0 (s 0,001) og 3,9 (s 0,001) fold økning i Rohitukine behandlet WT, ΔSlt2 og ΔHog1 belastning henholdsvis sammenlignet med ubehandlet kontroll. Imidlertid ΔSlt2 viste 1,1 (p 0,001) og ΔHog1 belastning oppviste 1,3 (p 0,001) ganger økning sammenlignet med den Rohitukine behandlede WT celler
DNA fragmentering, et kjennetegn på apoptose [40] ble observert i. alle typer gjærstammer etter medikamentbehandling som sett av DAPI farging. Valproinsyre induserer apoptose av ROS generasjon og DNA-fragmentering uavhengig av Yca1p ved konsentrasjoner som mildt påvirke spredning av gjær [41].
Rohitukine interaksjon påvirker uttrykk for
Slt2 Hotell og
Hog1
genet i villtypestammen
mRNA nivåer av
Slt2 Hotell og
Hog1
ble funnet å være 3,7 og 2,8 ganger økt henholdsvis i WT belastningen behandlet med Rohitukine sammenlignet den for kontrollgruppen (figur 4A). Men mRNA uttrykk for
Slt2
genet i ΔHog1 belastning og uttrykk for
Hog1
genet i ΔSlt2 stamme forble un-påvirket etter Rohitukine behandling. Figur 4B viser brette endringer i mRNA-nivåer i løpet av forskjellige behandlingsgrupper normalisert mot den av kontroll. Den selektive økning på Slt2 og Hog1 i villtype forhold og ikke i knockouts enten genet kan være et resultat av kryss samtaler mellom ulike MAPK mekanismer, som er veldig vanlig [42]. De over uttrykk for
Hog1
genet etter Rohitukine behandling kan være avhengig av tilstedeværelsen av
Slt2
gen eller vice-versa.
Zymolyase aktiverer både MAPKs og Slt2 aktivering avhenger Sho1 gren av HOG pathway. Begge MAPK veier er avgjørende for celle overlevelse i nærvær av stress fordi mutantstammer som mangler ulike komponentene i begge banene er overfølsom mot Zymolase [43]. Således kan en sekvensiell aktivering av MAPK to baner være nødvendige for cellulær tilpasning til stress tilstand og celleveggskader etter Rohitukine behandling.
Fra tidligere studier er det kjent at Hydroksyurea behandling øker fosforylering av MAP-kinase Slt2 [28 ]. Slt2 er ansvarlig for cellevegg integritet og aktiveres ved cellevegg skade, så det kan være mulig årsak til overfølsomhet for slt2 mutant til medikamentell behandling. Nyere studier har implisert rolle Hog1 MAPK i formidling toleranse til en rekke stressbetingelser, inkludert osmotisk, oksydativ, varme, arsen, og sitronsyre spenning [44]. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll lasting.
