Abstract
leverkreft (HCC) er en av de store malignitet over hele verden og er assosiert med dårlig prognose på grunn til den høye forekomst av metastasering og tumorresidiv. Vår tidligere studie viste at overekspresjon av p21-aktivert proteinkinase 1 (PAK1) blir ofte observert i HCC og er forbundet med en mer aggressiv oppførsel tumor, noe som tyder på at PAK1 er et potensielt terapeutisk mål i HCC. I denne studien, en allosterisk lite molekyl PAK1 inhibitor, IPA-3, ble evaluert for potensialet i å undertrykke hepatocarcinogenesis. I overensstemmelse med andre rapporter, inhibering av PAK1 aktivitet ble observert i flere humane HCC cellelinjer som ble behandlet med forskjellige doser av IPA-3. Ved hjelp av celleproliferasjon, kolonidannelse og BrdU-inkorporering analyser, viste vi at IPA-3 behandling signifikant hemmet veksten av HCC celler. Mekanismene gjennom hvilke IPA-3 behandling undertrykker HCC cellevekst er forbedring av apoptose og blokkering av aktivering av NF-kB. Videre våre data antydet at IPA-3 ikke bare hemmer HCC cellevekst, men også undertrykker den metastatiske potensialet i HCC celler. Nude mus xenograft analysen viste at IPA-3 behandling betydelig redusert tumorvekst og redusert tumor volum, noe som indikerer at IPA-3 kan undertrykke
in vivo
tumorvekst av HCC celler. Til sammen vår demonstrasjon av potensialet prekliniske effekten av IPA-3 i HCC gir begrunnelsen for kreftbehandling
Citation. Wong LL-Y, Lam IP-Y, Wong TY-N, Lai WL, Liu HF, Yeung LL, et al. (2013) IPA-3 hemmer veksten av leveren kreft celler ved å undertrykke PAK1 og NF-kB aktivering. PLoS ONE 8 (7): e68843. doi: 10,1371 /journal.pone.0068843
Redaktør: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, USA
mottatt: 15 februar 2013; Godkjent: 03.06.2013; Publisert: 19.07.2013
Copyright: © 2013 Wong et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Hong Kong forskningsfond for kontroll av smittsomme sykdommer (nr 09080782) og Hong Kong stipend Council (HKU 7 /CRF /09), The University of Hong Kong (Small prosjektmidler 201 109 176 021 til LLY Wong og YP Ching). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Dr. Yi-Pang Ching er en PLoS ONE Editorial styremedlem. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Som den sjette vanligste ondartet svulst og den tredje største årsaken til kreftdødelighet i verden, leverkreft (HCC) er ansvarlig for mer enn en million dødsfall årlig [1]. HCC er assosiert med dårlig prognose på grunn av høy forekomst av svulst tilbakefall og metastase [2]. Leverreseksjon er en av de store behandlinger i dag, men er fortsatt ikke tilfredsstillende på grunn av de høye tilbakefall [3]. Derfor er utvikling av nye behandlingsregimer for HCC nødvendig.
Overuttrykte p21-aktivert kinase 1 (PAK1) er hyppig i HCC [4]. Det er en nedstrøms effektor av den lille Rho GTPase, inkludert Rac1 og Cdc42, som regulerer diverse cellulære prosesser, inkludert cellesyklusutvikling, celle motilitet, celle polaritet og apoptose [5]. Aktivert Rho GTPase binder seg til PAKS på Cdc42 /Rac interaktiv binding (CRIB) domene, slik at lindring av autoinhibitory domene (AID), påfølgende autofosforylering av det katalytiske domenet og kinase-aktivering [6]. Blant de mange autofosforylering områder, treonin-423 (T423) er spesielt viktig for å motvirke autoinhibition og opprettholde den fullstendige aktiverte tilstand [7].
IPA-3 (2,2′- dihydroksy-1,1 « dinaphthyldisuifide) er en meget selektiv, ikke-ATP-konkurrerende allosterisk inhibitor av PAK1 hvis hyperaktivitet er blitt vist å være nært beslektet med tumorgenese [8]. Tidligere studier har vist at IPA-3 hindres Cdc42-indusert PAK1 autofosforylering på T423 og inhiberte signifikant PAK1 katalytisk aktivitet [8], [9]. Den hemmende virkning av IPA-3 oppnås blant annet ved å binde kovalent til den regulatoriske domenet av PAK1 som igjen hindret fysisk interaksjon med Cdc42 eller andre GTPase aktivatorer [9]. IPA-3-måls regulatoriske domenet er mindre bevart innenfor kinaser, utgjør således en bemerkelsesverdig høy selektivitet til dette hemmer [8].
In vitro
studier viste at IPA-3 behandling førte til lignende resultater som siRNA stanse av PAK1, der IPA-3 spesielt blokkerte membranen transport av WAVE2 og lamellipodia dannelse i menneskelige brystkreft celler [10], og inhiberte den endocytiske opptaket av human adenovirus serotype 35 i forskjellige cellelinjer [11]. Imidlertid er virkningen av IPA-3 i den terapeutiske behandling av human HCC fremdeles dårlig forstått. I denne studien ønsket vi å undersøke potensialet for IPA-3 i å undertrykke spredning og metastasering av menneskelig HCC celler gjennom en serie av
in vitro Hotell og
in vivo
eksperimenter. Vi viste at behandling av IPA-3 hadde en betydelig innvirkning på apoptose, spredning og bevegelighet av HCC celler. Videre IPA-3 var i stand til å undertrykke
in vivo
tumorvekst i naken mus xenografter. Derfor gir våre data støttende bevis for potensiell bruk av IPA-3 i å håndtere tumorigenesis og metastasering av HCC.
Materialer og metoder
Kjemi
2,2′- dihydroksy-1,1′-dinaphthyldisuifide (IPA-3) ble syntetisert og levert av Dr. LL Yeung i Hong Kong University of Science and Technology. Strukturen av IPA-3 ble bekreftet ved massespektrometri-analyse. En stamløsning av IPA-3 (100 mM) ble nylaget i DMSO. Andre kjemikalier med mindre definerte var fra Sigma-Aldrich på høyeste kvalitet.
Cell Kultur
Menneskelig HCC celler H2M, H2P og menneske ikke-tumorigent, udødeliggjort lever linje Miha var fra Dr. XY Guan, Department of Clinical Oncology, University of Hong Kong, Pokfulam, Hong Kong [12]. MHCC97L og MHCC97H celler var fra Liver Cancer Institute, Fudan University, Shanghai, Kina [13]. HepG2 og Hep3B celler ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC). SMMC-7721 og Bel-7402 var gaver fra Shanghai Institute of Biochemistry og cellebiologi, Chinese Academy of Sciences. Alle celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles minimale essensielle medium (DMEM) med høy glukose supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS), 1 mM natriumpyruvat og 100 U penicillin /streptomycin ved 37 ° C i fuktig 5% CO
2 inkubator.
MTT analysen
Fire tusen H2M celler per brønn ble sådd i 96-brønners plater og inkuberes i normal tilstand i 24 timer. Celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av IPA-3 til 1, og 2 dager. Celler ble behandlet med 100 ul av 5 mg /ml av (3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) (Invitrogen) oppløsning i 4 timer ved 37 ° C inntil krystaller var dannet. MTT-løsning ble fjernet fra hver brønn og 100 ul DMSO ble tilsatt til hver brønn for å oppløse krystallene. Fargeintensitet intensitet~~POS=HEADCOMP ble målt ved mikroplateleser (Bio-Rad) ved 570 nm. hvert eksperiment besto av fire gjennomkjøringer og minst tre uavhengige eksperimenter ble utført.
Cell Proliferation assay
fremgangsmåte for proliferasjonsanalyse ble beskrevet tidligere [4]. Den beste tilpasning vekstkurve og fordoblingstiden ble beregnet ved bruk av GraphPad Prism 5 (GraphPad Software , Inc., San Diego, California). Kort fortalt H2M (1 × 10
4), H2P (1 × 10
4), HepG2 (2 × 10
4), MHCC97L (1 × 10
4) eller Miha (2 x 10
4) celler ble sådd ut på 6-brønners plater inneholdende fullstendig medium på dag 0. Hver av bærerkontroll (DMSO) eller IPA-3 (5 eller 10 uM) ble tilsatt til det medium på dag 1. media med eller uten IPA-3 ble oppfrisket på dag 3 og 5. i tre paralleller, ble cellene trypsinzed og telt ved bruk av celleteller på dag 3, 4, 6 og 7 for bygging av vekstkurven.
Colony Forming assay
assayet ble utført som tidligere beskrevet [14]. I korthet ble cellene sådd ut på 200 celler per brønn i 6-brønners plater som inneholdt komplett DMEM på dag 0. DMSO eller IPA-3 (5 eller 10 uM) ble administrert til mediet, som ble oppdateres to ganger i uken. På dag 14 ble kolonier fiksert med 3,7% formaldehyd i 15 minutter og farget med 1% krystallfiolett før kvantifisering.
BrdU inkorporering Assay
Assayet ble utført som tidligere beskrevet [15]. Celleproliferasjon ble kvantifisert ved måling av BrdU-inkorporering i DNA-syntese med celleproliferasjon ELISA, BrdU Colorimetric sett (Roche Diagnostics). Analysen ble utført i henhold til produsentens manual. I korte trekk, likt antall H2M, H2P, Miha, HepG2 eller MHCC97L-celler ble sådd ut i 96-brønners plater og serum-sultet over natten. Serum sult indusert cellesyklus-synkronisering slik at de fleste av cellene holde seg i G1 /S overgang like før S-fasen oppføring. Cellene ble deretter behandlet med enten DMSO eller forskjellige konsentrasjoner av IPA-3 (10 og 20 uM) i 15 minutter, etterfulgt av FBS fylling og BrdU merking for 2, 4 eller 8 timer. Den BrdU merking signalet ble kvantifisert ved å måle den relative absorbans (Abs
370 nm-Abs
492 nm). Hver analyse ble utført i tre eksemplarer. Forsøkene ble utført minst tre ganger uavhengig av hverandre.
Annexin V-7ADD Farging analysen
Påvisning av apoptotisk celledød ble utført ved hjelp av PE Annexin V apoptose Detection Kit I (BD Pharmingen). I tre eksemplarer, ble H2M-celler sådd ut i 60 mm skål, serum-sultet over natten og deretter behandlet med DMSO eller IPA-3 (10 eller 20 uM) i medium inneholdende serum i 24 timer. Flytende celler ble vasket bort, mens de festede celler ble trypsinert, skylt og resuspendert i bindingsbuffer. Etter farging med annexin V-PE og 7-AAD ble prøvene umiddelbart analysert ved flow-cytometri. Eksitasjon: 488 nm (annexin V-PE og 7-AAD). Emisjon: 578 nm (annexin V-PE), 675 nm (7-AAD). Cellene ble telt per prøve og dataene ble analysert med WinMDI (versjon 2.8, Joe Trotter).
Konfokalmikroskopi
Etter behandling, H2M eller H2P celler ble fiksert i 4% paraformaldehyde for 15 minutt, vasket og permeabiliserte med 0,2% Triton X-100 i PBS i 15 minutter, [4], [15]. Lysbilder ble farget med TRITC-phalloidin (Invitrogen) i 10 minutter og immunfluorescens bildebehandling ble fanget i en Carl Zeiss LSM700 laser confocal scanning mikroskop.
Transwell migrasjon analysen
Transwell migrasjon Analysen ble utført som beskrevet tidligere [4]. I korte trekk H2M (1 x 10
5) celler ble sådd ut i serumfritt DMEM i det øvre kammeret og serum-supplert medium ble tilsatt til det nedre rom av Transwell kammeret (Corning). I nærvær eller fravær av IPA-3 (10 uM) ble serumfattige cellene tillatt å migrere i 24 timer. Cellene ble deretter fiksert med 3,7% formaldehyd, farget med 1% krystallfiolett og tellet under et mikroskopisk felt på forstørrelse på 40X. Tre forskjellige felt ble tilfeldig valgt for hvert innlegg.
Kvantitativ Reverse Transcription-PCR (QRT-PCR)
Serum-sultet H2M celler ble behandlet med eller uten IPA-3 forbehandling (10 eller 20 uM, 15 minutter), etterfulgt av TNF-α (10 eller 20 ng /ml, 24 timer), etterfylling FBS og over natten kultur. QRT-PCR ble utført som beskrevet tidligere [4]. I korthet, ble total RNA ekstrahert ved hjelp av Trizol (Invitrogen) i følge produsentens protokoll. Total RNA ble revers transkribert til første-cDNA ved hjelp PrimeScript RT reagent Kit (Takara, Japan). Real-time qPCR ble utført ved hjelp SYBR® Grønn Real Time system (Takara, Japan) i en My IQTM2 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad). β-aktin ble benyttet som en intern kontroll, og tillot normalisering av prøvene. DNA-sekvensene til de PCR-primere er oppført i tabell S1. QRT-PCR ble utført i triplikater og gjentatt tre ganger.
Western blotting-analyse
Protein ekstraksjon og Western blotting ble utført som beskrevet tidligere [4], [15]. Immunoblotting ble gjort for PAK1, P-PAK1 (T423), PARP1, Paxillin, P-Paxillin (S178), SAPK /JNK, P-SAPK /JNK (T183 /Y185), kløyvde caspase 3 (Cell Signaling Technology), NF- kB (Santa Cruz Biotechnology) og β-aktin (Sigma-Aldrich) etterfulgt av tilsvarende pepperrot-(HRP) konjugerte sekundære antistoffer (GE Healthcare). Signaler av målrettede proteiner ble oppdaget av Enhanced Chemiluminsence (GE Healthcare). Intensiteter av proteinbånd ble analysert ved hjelp av Adobe Photoshop CS4.
Nude Mouse Xenotransplantat
MHCC97L celler (1 x 10
6) ble injisert subkutant i høyre flanke av fire uker gammelt mannlige naken mus. Tumorstørrelse ble beregnet som beskrevet tidligere [4]. Mus med tumorer i en midlere størrelse på 100 mm
3 ble gruppert i behandlingskullene. Totalt 15 mus ble anvendt og delt i tre grupper (5 mus pr gruppe): Kontroll (DMSO), IPA-3 (2 mg /kg) og IPA-3 (4 mg /kg). IPA-3 ble formulert i DMSO og administrert tre ganger ukentlig (TIW) (2 mg /kg eller 4 mg /kg) ved intraperitoneal injeksjon (i.p.) i løpet av studien, og tumorstørrelse ble målt to ganger i uken. Dyrestudier har vært spesielt godkjent av Animal (kontroll av eksperimenter) forordningen kapittel 340, Department of Health, Hong Kong Special Administrative Region (Ref .: (11-786) i DH /HA P /8 /2/3 Pt. 33).
Statistical Analysis
Forsøk ble gjort i tre paralleller og data ble presentert som gjennomsnitt ± SD. Student «s
t
-test ble anvendt for statistisk analyse, og data fra mer enn to grupper ble analysert ved en-veis analyse av varians (ANOVA) i GraphPad Prism 6, etterfulgt av Dunnetts test. Resultatene ble betraktet som signifikant når
P
. 0,05
Resultatene
IPA-3 hemmer aktiviteten av PAK1
HCC celler har vist seg å ha en høy endogent PAK1 nivå, særlig i de høyt metastatiske HCC-cellelinjer [4], for eksempel H2M, men ikke i den ikke-tumorigen, udødeligleverceller Miha (fig. 1A). For å undersøke virkningen av IPA-3 på veksten av H2M-celler, ble MTT-analyse utført. MTT-analyse viste at IPA-3 trykt spredning av H2M celler i tids- og doseavhengig oppførsel (Fig. 1B). Den halv maksimal hemmende konsentrasjon (IC
50) av IPA-3 i H2M-celler var ca. 28 uM og 21 uM på dag 1 og 2, respektivt. For å bekrefte den hemmende effekten av IPA-3 på PAK1 aktivitet, H2M-celler ble serum-sultet og deretter behandlet med IPA-3 i fullstendig medium over natten. Western blotting-analyse viste at IPA-3 doseavhengig redusert fosforylering nivået av PAK1 (Fig. 1C). Gående, viste resultatene IPA-3 fører til en reduksjon i PAK1 fosforylering i forbindelse med en reduksjon i H2M celleviabilitet. I tillegg fosforylering av nedstrøms substrat av PAK1, c-Jun N-terminal kinase (JNK), ble også redusert, noe som ytterligere støtter reduksjonen av PAK1 kinaseaktivitet av IPA-3 (Fig. 1C). Lys mikroskopisk undersøkelse av IPA-3-behandlede celler viste tydelige morfologiske forandringer. Fig. 1D viste morfologiske forandringer i H2M celler etter å ha blitt behandlet med IPA-3. I høye doser av IPA-3 (20 og 40 mm), en betydelig bestand av H2M celler ble round-up og løsrevet fra fatet.
(A) Relative proteinnivåer PAK1 i ulike cellelinjer. Signalintensitetene for bånd ble kvantifisert og normalisert ved å ta det nivå av Miha som 1. (B) MTT-analyse på dag 1 og 2. H2M-celler (4 x 10
3) ble sådd ut på 96-brønners plater og behandles med forskjellige doser av IPA-3. Cellene ble høstet etter inkubasjon og MTT-analysen ble utført som nevnt i Materialer og metode. Grafen viser den prosentandel av levedyktige celler plottet mot dose av IPA-3 (C) Western blotting-analyse av P-PAK1, total PAK1, P-JNK og total JNK. Serum-sultet H2M-celler ble behandlet med enten DMSO eller IPA-3 ved den angitte konsentrasjon i 15 minutter og etterfulgt av FBS fylling og over natten kultur. (D) H2M-celler ble serum-sultet og behandlet med IPA-3 (10, 20 eller 40 uM) i fullstendig medium og tillatt å vokse over natten. Celle morfologi Bildene ble tatt med en forstørrelse på 40X. Scale bar, 0,4 mm.
IPA-3 hemmer proliferasjonen av HCC Cells
For ytterligere å evaluere effekten av IPA-3 på HCC celleproliferasjon, to primære HCC cellelinjer, HepG2 og H2P, to metastase HCC cellelinjer ,. H2M og MHCC97L, og den ikke-tumorigen, udødeliggjort levercellelinje, Miha, ble hver for seg behandlet med forskjellige doser av IPA-3. I celleproliferasjonsanalyse, behandling av IPA-3 betydelig redusert antall av metastatiske HCC celler (H2M og MHCC97L) og i mindre grad for de primære HCC celler (HepG2 og H2P), scoret på en doseavhengig måte (fig. 2A ). I motsetning til dette, Miha hadde den høyeste chemoresistance til IPA-3, noe som tyder på at IPA-3 kan hemme hepatom-celleformering med en liten effekt på normale hepatocytter. For å bekrefte virkningen av IPA-3, ble de totale cellelysatene av H2M cellene oppsamlet på dag 7 og testet for inhibering PAK1 ved Western blotting-analyse. Resultatet viste at IPA-3 behandling markert hemmet aktiverende fosforylering av PAK1, noe som tyder på at IPA-3 inhiberer celleproliferasjon ved å redusere PAK1 aktivitet (Supplementary fig. S1). Konsekvent, samtidig reduksjon av fosforylering av JNK, nedstrøms målene for PAK1, ble også observert (Fig. S1). For å belyse hvorvidt den anti-proliferative mekanisme av IPA-3 på HepG2, H2P, H2M og MHCC97L celler skyldes en nedgang i cellesyklus oppføring, ble BrdU merkingsassay utført. For å oppnå en fremtredende virkning av IPA-3, 10 pM og en høyere dose (20 uM) ble anvendt for undersøkelsen. Våre data viser at IPA-3-behandling på de synkroniserte H2M og MHCC97L celler resulterte i en betydelig reduksjon i frekvensen av BrdU-inkorporering, sammenlignet med DMSO kontroll i tids- og doseavhengig oppførsel (Fig. 2B). Men IPA-tre bare hadde en marginal effekt på BrdU inkorporering frekvensen av H2P og HepG2 celler, impliserer at IPA-3 er svært spesifikk for metastatisk HCC cellelinjer. For ytterligere å bekrefte effekten av IPA-3 på undertrykkelse av HCC cellevekst, ble kolonidannelse analyse utført ved hjelp av ikke-tumorigene (Miha), primær (HepG2) og metastatisk (H2M) HCC celler. Resultatet viste at IPA-3 i betydelig grad hemmet veksten av HepG2 og H2M-celler, men bare hadde en meget marginal effekt på Miha celler (Fig. 2C). Bemerkelsesverdig Miha celler, som har et meget lavt nivå av endogen PAK1, viste ingen forskjell i celleformering ved IPA-3-behandling. Samlet utgjør disse resultatene indikerte at IPA-3 behandling undertrykt HCC celleproliferasjon i synkende rekkefølge av preferanse, metastatisk HCC primære HCC . Non-transformert hepatocytter, og i en PAK1 avhengig måte
(A ) effekten av IPA-3 på celleproliferasjonsprosesser priser av Miha (øvre, venstre panel), HepG2 (øvre, midtre panelet) (øverst til høyre panel H2P,), H2M (nedre, venstre panel) og lavere, til høyre panel (MHCC97L ) -celler. Statistisk analyse ble utført ved å sammenligne med verdien for DMSO-kontroll. *
P
0,05, **
P
0,01 (ANOVA). (B) BrdU merking analyser av Miha (øvre, venstre panel), HepG2 (øvre, midtre panelet), H2P (øverst til høyre panel,), H2M (nedre, venstre panel) og MHCC97L (nedre, høyre panel) celler. *
P
0,05 (ANOVA) sammenlignet med DMSO kontroll. Feilfelt, middelverdi ± SD av triplikate prøver. (C) Representative plater av kolonidannelse analysen av Miha (venstre panel), HepG2 (i midten panel) og H2M celler (panel høyre). Bar diagram av kolonidannelse analysen (nedre panel). *
P
0,001, **
P
0,01 (ANOVA) sammenlignet med DMSO kontroll. Feilfelt, gjennomsnitt ± SD av triplikate prøver.
IPA-3 induserer apoptose av HCC Cells
For å undersøke om IPA-3 påvirker apoptose i HCC celler, en annexin V-7ADD farging analysen ble utført. Siden 10 uM IPA-3-hemmer proliferasjon hastighet og en høyere konsentrasjon, dvs. 20 uM fører til et signifikant resultat på BrdU-inkorporering i analysen H2M-celler, ble 10 uM og 20 uM brukes til å undersøke den fremtredende virkningen av IPA-3. Resultatet viste at inkubasjon av H2M-celler med 20 pM IPA-3 førte til en høyere prosentandel av celler som viser et positivt signal av annexin V flekker, sammenlignet med DMSO kontroll, noe som tyder på at celler som gjennomgikk apoptose under behandling med IPA-3 ( fig. 3A). I tillegg ble den potensielle pro-apoptotiske aktivitet av IPA-3 ytterligere undersøkt ved spalting av PARP1 og caspase 3. Behandling av IPA-3 i H2M-celler resulterte i en svekket grad av PARP ved 20 uM og spaltingen form av PARP1 kunne påvises ved 40 uM (fig. 3B). Dette ble fulgt med en doseavhengig reduksjon av PAK1 fosforylering nivåer av PAK1 (Fig. 3B). I tillegg var nivået av spaltede caspase 3 økte på en doseavhengig måte. Tatt sammen, disse resultatene antydet at IPA-3 induserer apoptose gjennom PAK1 inhibering ved en høy konsentrasjon.
(A) Annexin V-7ADD farging analysen. Fluorescens-signaler med annexin V-PE og 7-AAD ble påvist med PE-A og Per-Cy5-5-A-kanaler, henholdsvis (øvre panel). Prosentandelen av H2M celler farget med annexin V-PE bare under forskjellige behandlinger ble vist i et stolpediagram (nedre panel). *
P
0,001 (ANOVA) sammenlignet med DMSO kontroll. (B) i serum-sultet H2M-celler ble behandlet med økende doser av IPA-3 sammen med serum fylling i 24 timer. Western blotting analyse av PARP1 ble P-PAK1 (T423), total PAK1 og kløyvet caspase 3 utført.
IPA-3 undertrykker HCC Cell Migration
PAK1 har en fremtredende rolle i cellemigrering, særlig ved regulering av spenning fibre dannelse og fokal adhesjon omsetning. Således ble immunofluorescens farging utført for å undersøke hvorvidt IPA-3 kan påvirke disse prosessene. IPA-3 ble funnet å forbedre dannelsen av stress fibre og fokal adhesjon både H2M og H2P celler, som ble visualisert ved phalloidin og paxillin immuno-positive signaler av stress fibre og fokal adhesjon, mens DMSO-kontroll viste en svak og spredt farging. I tillegg viste resultatene at behandling av IPA-3 betydelig forbedret antall kontakt adhesjons komplekser i H2M og H2P celler som avsløres ved paxillin farging (fig. 4A). Fosforylering av paxillin ved serin-178 (S178) er viktig for PAK1-mediert cellemigrering, som er blitt vist å bli fosforylert av JNK [4], [16]. I H2M-celler, ble fosforylering av paxillin ved S178 betydelig redusert sammen med en over natten behandling av IPA-3 (Fig. 4B). Således IPA-3 inhiberer signalisering av den PAK1 /JNK /paxillin veien. Dessuten ble en Transwell migrasjonsanalyse utført for å studere effekten av IPA-3 på
in vitro
migrering evne H2M celler. Vi fant at IPA-3 undertrykte betydelig migrering av H2M celler som antallet migrerte celler ble bemerkelsesverdig redusert med 79%, sammenlignet med DMSO kontroll (Fig. 4C). Samlet utgjør disse dataene illustrert at IPA-3 reduserer PAK1 avhengige celle mobilitet av HCC celler betydelig.
(A) Paxillin protein uttrykk ble oppdaget av immunfluorescens analyse i henhold til IPA-3 behandling. H2M og H2P (øvre panel) celler ble serum-sultet natten over og behandlet med enten DMSO kontroll eller IPA-3 (20 uM) i 15 minutter, etterfulgt av FBS fylling i 10 minutter. Immunofluoresence signaler om phalloidin (Red), paxillin (grønn) og DAPI (blå) representerer stresset fiber, brennvidde heft og kjernen, henholdsvis (forstørrelse 40X). Antallet fokale adhesjon (paxillin) ble talt i H2M (nedre, venstre panel) og H2P (nedre, høyre panel), og er representert i stolpediagram. Feilfelt, middelverdi ± SD av triplikate prøver. *
P
0,01 (
t
-test) sammenlignet med DMSO kontroll. (B) Western blotting analyse på fosforylering nivåer av PAK1 og paxillin. Serum-sultet celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av IPA-3 som indikert i 15 minutter, etterfulgt av FBS fylling i 10 minutter. (C) Representative bilder av Transwell migrasjon analysen av H2M celler. Celler ble behandlet med enten DMSO eller 10 uM IPA-3, og ble tillatt å migrere i 24 timer. Bilder viser de celler som har migrert til den nedre kammer (øvre panel). Antallet migrerte celler ble talt opp og representert i stolpediagram (nedre panel). Feilfelt, middelverdi ± SD av triplikate prøver. *
P
. 0,01 (
t
-test) sammenlignet med DMSO kontroll
IPA-3 undertrykker NF-kB Nuclear Trans
Tidligere rapporter har vist at PAK1 stimulerer aktiviteten og subcellulære translokasjon av nukleær faktor lettkjedeforsterkeren av aktiverte B-celler (NF-kB), og fremmer celleoverlevelse [17], [18]. Således undersøkte vi hvorvidt IPA-3 er i stand til å inhibere aktiviteten av NF-kB. H2M med et høyt endogen ekspresjon nivå av PAK1 og udødeliggjorte hepatocytter, Miha-celler ble serum-sultet og deretter hver for seg behandlet med IPA-3, fulgt av tumor nekrose faktor-alfa (TNF-α). Som vist i fig. 5A, NF-kB positiv farging ble hovedsakelig funnet i cytoplasma i DMSO kontroll, mens NF-kB farging ble akkumulert i kjernen etter TNF-α induksjon. Interessant, H2M-celler forbehandlet med IPA-3 førte til en cytoplasmisk farging av NF-kB, noe som indikerer at IPA-3 trykkes den TNF-α-indusert kjernefysiske målretting av NF-kB. I motsetning til H2M-celler, gjorde IPA-3 ikke undertrykke TNF-α-indusert NF-kB-aktivering i Miha celler som mangler endogen PAK1. Dette resultatet antydet at hemmingen av NF-kB-aktivering av IPA-3 er PAK1 avhengig. For ytterligere å undersøke hvorvidt PAK1 inaktivering er involvert i IPA-3-indusert undertrykkelse av NF-kB trans, fosforylering av PAK1 ble bestemt (fig. 5B). I samsvar med en tidligere undersøkelse som viste at PAK1 ble straks aktivert av TNF-α i forskjellige cellelinjer [19], ble det fosfo-PAK1 nivå forhøyet i celler stimulert med TNFa-α (20 ng /ml). Fosforyleringen nivået var høyest på 0,5 timer og deretter gradvis redusert etterpå. På den annen side ble fosforyleringen av PAK1 fullstendig undertrykt i IPA-3-forbehandlede celler. Dette resultatet antydet at IPA-3 er i stand til å oppheve PAK1 aktivering indusert av TNF-α, som korrelerer godt med IPA-3-inhibering på TNF-α-indusert NF-kB translokasjon. Induksjon av metalloproteinase (MMP) -9 av TNF-α ble vist å være formidlet av PAK1 [19]. For å belyse virkningen av IPA-3 på TNF-α-indusert aktivitet av MMP-9 og COX-2, som er nedstrøms mål for NF-kB [20], [21], utførte vi QRT-PCR for å kvantifisere mRNA produksjon av MMP-9 og COX-2. Etter normalisering med β-aktin, H2M-celler reagerte på TNF-α med en økende mRNA produksjon av MMP-9 og COX-2 (fig. 5C). Men resultatene viser at behandling av IPA-3 undertrykte betydelig ekspresjon av MMP-9 og COX-2-transkripsjoner i en doseavhengig måte.
(A) Virkning av IPA-3 på subcellulære lokalisering av NF-kB kB ble vurdert ved immunofluorescens farging. Etter over natten serum sult, ble H2M (venstre panel) og Miha (høyre panel) celler behandlet med enten DMSO eller IPA-3 (20 uM, 15 minutter), etterfulgt av tilsetning av TNF-α (20 ng /ml, 15 minutter) . NF-kB ble påvist med et spesifikt antistoff (grønn) og kjerne ble farget med DAPI (blå). (B) Western blotting-analyse av P-PAK1 (T423) og total PAK1 ble påvist i H2M celler stimulert av TNF-α (20 ng /ml) med eller uten IPA-3-forbehandling (20 uM, 15 minutter). TNF-α ble inkludert i dyrkningsmediet i 0, 0,5, 1, 2 eller 4 timer. (C) Ekspresjon av kvantitativ real-time PCR ble utført for å analysere mRNA nivå av MMP-9 (venstre panel) og COX-2 (høyre panel). Serum-sultet H2M-celler ble behandlet med eller uten IPA-3-forbehandling (10 eller 20 uM, 15 minutter), etterfulgt av TNF-α (10 eller 20 ng /ml, 24 timer). Kvantitative resultater av MMP-9 og COX-2-mRNA-nivåer ble normalisert til p-aktin. Verdiene representerer gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. *
P
0,001 (ANOVA), ***
P
. 0,05 (ANOVA) sammenlignet med TNF-α-kontroll
IPA- 3 undertrykker tumorigenesis i Nude Mouse xenotransplantat modell
bredden i IPA-3 antitumor aktivitet
in vivo
ble evaluert med en naken mus xenograft modell. Siden H2M cellelinjen var ikke i stand til å utvikle solide svulster i nakne mus, ble et annet menneske HCC tråd MHCC97L med lignende PAK1 nivå (Fig. 1a). Etter tumor anlegget (100 mm
3), ble fem mus pr gruppene behandlet med enten DMSO eller forskjellige doser av IPA-3 (2 mg /kg og 4 mg /kg) TIW ved i.p. injeksjon. Mens behandlingen ble godt tolerert som bevist av noen betydelig vekttap, IPA-3 undertrykte betydelig tumorvekst (Fig. 6A) og resulterte i lavere tumorvekt (Fig. 6B). I tillegg, Western blotting-analyse viste at IPA-3 redusert fosforylering av PAK1 og dens nedstrøms mål JNK (Fig. 6C). Samlet utgjør disse resultatene indikerte at IPA-3 kan undertrykke tumorigenesis
in vivo
ved å redusere PAK1 aktivitet.
(A) MHCC97L celler ble brukt til xenograft modell. Mus ble behandlet tre ganger ukentlig, enten med DMSO eller IPA-3 (2 mg /kg eller 4 mg /kg, i.p.). *
P
0,001 (ANOVA) sammenlignet med DMSO kontrollgruppen. (B) Tumorvekter ble målt ved slutten av studien. *
P
0,001, **
P
0,01, (ANOVA) sammenlignet med DMSO kontrollgruppen. (C) Representative resultater av Western blotting-analyse. P-PAK1 (T423), total PAK1, ble P-JNK og total JNK oppdaget. ***
P
0,05 (ANOVA) sammenlignet med DMSO kontroll. Feilfelt, gjennomsnitt ± SD av 5 dyr per gruppe.
Diskusjoner
PAK1 er involvert i et komplekst signaloverføring nettverk som er knyttet til ulike cellulære prosesser, herunder cytoskjelettet modellering, celle motilitet, overlevelse og proliferasjon, og cellesyklusprogresjon [5]. Deregulert eller hyper-aktivert PAK1 er vanligvis forbundet med HCC [19]. Dermed har PAK1 bli en potensiell terapeutisk mål for å kontrollere tumordannelse og metastasering av HCC [22]. IPA-3 har blitt identifisert til å være en allosterisk inhibitor av lite molekyl PAK1 [8]. Med lite eller mindre rapporter om IPA-3 i behandlingen av menneskelige HCC, vi benyttet ulike
in vitro Hotell og
in vivo
eksperimenter for å undersøke den anti-tumorigen evne til IPA-3 behandling på menneskelige HCC cellelinjer.
i denne studien, viste vi at IPA-3 kan hemme spredning rate av HepG2, H2P, H2M, og MHCC97L celler i dose- og tidsavhengige oppførsel.
