Abstract
Formål
For å undersøke den biologiske funksjonen til HOXB5 i human blærekreft og undersøke om HOXB5 3′-UTR SNP (1010A /G), som ligger innenfor mikroRNA -7 bindingssetet, ble korrelert med kliniske blærekreft.
Metoder
uttrykk av HOXB5 i 35 menneskelige blærekreft vev og 8 cellelinjer ble undersøkt ved hjelp av real-time PCR og immunhistokjemi. Neste, vi utforsket den biologiske funksjonen til HOXB5
in vitro
bruker celle spredning, migrasjon og kolonidannelse analyser. Ved hjelp av bioinformatikk, en SNP (1010A /G) ble funnet ligger innenfor mikroRNA-7 bindingsstedet i 3′-UTR av HOXB5. Real-time PCR ble brukt til å teste HOXB5 uttrykk påvirkes av ulike alleler. Til slutt ble multivariat logistisk regresjonsanalyse brukes til å bestemme forholdet mellom SNP (1010A /G) frekvens og kliniske trekk i 391 tilfeller.
Resultater
HOXB5 ble ofte over uttrykt både i blærekreft vev og cellelinjer. Inhibering av HOXB5 trykkes den onkogene funksjon av kreftceller. Deretter demonstrerte vi at en SNP (1010A /G), som ligger innenfor den mikroRNA-7-bindingssete i 3′-UTR av HOXB5, kan påvirke HOXB5 ekspresjon i blærekreft hovedsakelig ved differensiell bindingsaktiviteten til mikroRNA-7 og SNP-relaterte mRNA stabilitet. Til slutt viste vi også hyppigheten av 1010G genotype var høyere i kreft gruppen sammenlignet med normale kontroller og korrelert med risiko for høy klasse og høy scene.
Konklusjon
HOXB5 er overuttrykt i blærekreft . En miRNA bindende SNP (1010A /G) som befinner seg innenfor 3′-UTR av HOXB5 er forbundet med genekspresjon og kan være en lovende prognostisk faktor for blærekreft
relasjon:. Luo J, Cai Q, W Wang Huang H, Zeng H, han W, et al. (2012) En mikroRNA-7 bindingssetet polymorfisme i HOXB5 leder til variable Gene Expression i blærekreft. PLoS ONE 7 (6): e40127. doi: 10,1371 /journal.pone.0040127
Redaktør: Lorenzo Chiariotti, Università di Napoli Federico II, ITALIA
mottatt: 21 mars 2012; Godkjent: 01.06.2012; Publisert: 29 juni 2012
Copyright: © 2012 Luo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (81071688, 30972983, 81172431, 91029742), Guangdong-provinsen Natural Scientific Foundation (07117366, 6104605), Yat-sen-stipend for unge forskere (for Tianxin Lin), klinisk Key Prosjekt of Public Health Departementet (for Jian Huang), og Program for New Century gode talenter i University (NCET-10-0852, for Tianxin Lin). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i urinblæren er den vanligste urologisk svulst i Kina [1]; Men mekanismene for blærekreft tumorigenesis har ikke blitt godt illustrert. Dataene viser at de fleste av blærekreft induseres av karsinogener som skader DNA. Følsomheten av overgangs epitelet er mikromiljøet kan være en annen viktig faktor i tumorgenese [2]. Onkogener og tumor dempere er også rapportert å spille viktige roller i blærekreft [3]. Nylig har genetiske endringer, inkludert SNPs, slettinger, innsettinger og endringer av DNA kopiantall er funnet å være involvert i blæren kreftutvikling.
En homeobox (HOX) er en sekvens av ca 180 nukleotider i gener som koder for et protein domene som heter homeodomain. Undersøkelser viste at HOX-gener utgjøre så mye som 0,1 til 0,2% av hele genomet hos virveldyr [4]. Hox-gener er høyt konservert over store evolusjonære avstander og kode kjernefysiske proteiner som fungerer som transkripsjonsfaktorer (TF) ved normal organutvikling [5]. I de senere årene har HOX genfamilien har også blitt assosiert med humane sykdommer, spesielt kreft. For eksempel tap av HOXA5 i brystkreft [6], over-uttrykk for HOXA10 i akutt myelogen leukemi (AML) [7], genmutasjoner av HOXD4 i nyre- og tykktarmskreft [8] og overekspresjon av HOXC4 i human blærekreft [ ,,,0],9] er blitt rapportert. HOXB5 (NM_002147.3), som ligger på menneskelig kromosom 17, er medlem av HOX-genet familien som er involvert i normal lunge og tarm utvikling i mus og menneske [10]. HOXB5 har blitt rapportert å være relatert til menneskelige sykdommer, inkludert AML [11], medfødt cystisk adenomatoid misdannelse (CCAM) [12] og bronkopulmonal deponering (BPS) [13]. Dessuten ble det HOXB5 genet funnet å være sterkt uttrykt i eggstokk-kreft og ble ansett for å være et viktig potensielle mål for behandling av eggstokkreft [14]. Den biologiske funksjonen til HOXB5 i urologiske karsinomer er ikke rapportert. I en pilotstudie, har vi funnet at HOXB5 var ofte over-uttrykt i humane blærekreft vev og cellelinjer, noe som tyder på at det kan være en kandidat onkogen i blærekreft.
I de siste ti årene, involvering av microRNAs (mirnas) i kreft hos mennesker har blitt mye studert. Mirnas undertrykke ekspresjon av mål-mRNA ved å binde seg til det 3′-ikke-translaterte region (3′-UTR) av mRNA. I human blærekreft, hadde mirnas vist seg å være viktige faktorer i løpet tumorigenesis. I en tidligere studie rapporterte vi at miRNA-143 og miRNA-125b handlet som tumor suppressors i human blærekreft [15], [16]. I en annen studie ble det rapportert at MIR-7 ble nedregulert i blærekreft og kan undertrykke tumorvekst ved å hemme vekstfaktor-reseptor ekspresjon og ved å nedsette den anti-apoptotiske reaksjonsvei Akt [17].
Single-nukleotid (SNP), den mest vanlige form av genetiske variasjoner i det humane genom, bidrar til ulike humane fenotyper. SNP’er har vært forbundet med mange humane sykdommer, særlig kreft. I de senere år SNP som befinner seg innenfor miRNA-bindingssete av en miRNA mål (også kalt miRNA bindende SNP) er blitt funnet å være viktig i tumorgenese. I en tidligere studie, vår gruppe foreslo at SNP (1805C /T) i MIR-181a bindingssetet av Mel-18 genet var knyttet til noen kliniske trekk ved prostatakreft [18]. I en pilotstudie, har vi funnet en mulig miRNA-bindende SNP (1010A /G) i 3′-UTR av HOXB5 genet bruker NCBI SNP database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/) og miRbase (https://www.mirbase.org/).
i denne studien, viste vi at HOXB5 genet var over-uttrykt og fungerte som et onkogen i human blærekreft. Vi har også funnet en SNP (1010 A /G) i det 3′-UTR av HOXB5 genet som er innenfor miRNA-7-bindingssetet. Vi har vist at denne SNP kan påvirke ekspresjon av HOXB5 hovedsakelig ved å forstyrre funksjonen av miRNA-7 og SNP-relatert mRNA stabilitet; Videre er hyppigheten av 1010G genotype var høyere i kreft gruppen sammenlignet med normale kontroller, og ble funnet å være korrelert med risikoen for høy grad og høy trinn. Så vidt vi vet, er dette den første studien av involvering av polymorfismer i miRNA bindende stedet av HOXB5 i human blærekreft.
Materialer og metoder
Pasienter og vev
391 pasienter med blærekreft ble inkludert i vår studie. Denne studien ble godkjent av Institute forskningsetikk, Sun Yat-sen-universitetet, Kina. Informert samtykke ble skrevet og hentet fra alle fag i vår studie. Alle pasientene hadde primær blære kreft; ingen tidligere behandling hadde blitt utført før operasjonen. Kreftprøver ble oppnådd fra pasienter som gjennomgikk reseksjon av blærekreft. Prøvene ble samlet inn mellom 2007 og 2010 ved Institutt for Urologi, Sun Yat-sen Memorial Hospital, Sun Yat-sen-universitetet, Guangzhou, Kina og Department of Urology, Southwest Hospital, Chongqing, Kina. Alle blære prøvene ble umiddelbart hurtigfrosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C. Histologi av vev ble uavhengig evaluert av to patologer, og den kliniske stadium av blærekreft ble bestemt ved bruk av 2002 tumor-node-metastaser (TNM) klassifiseringssystem.
Cellelinjer og cellekultur
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP som brukes i vår studie ble oppnådd fra American Tissue Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA); de inkluderer T24, 5637, TCCSUP, HT-1376, UM-UC-3, J82, RT4, EJ og SV40-transformert nyrecellelinje 293T. Cellene ble dyrket i en fuktet luft atmosfære av 5% CO2 ved 37 ° C, og alle media ble supplert med 10% føtalt bovint serum (Hyclone, Logan, UT, USA). T24 ble dyrket i McCoys 5a medium (modifisert); 5637 ble dyrket i RPMI 1640 medium; J82, UM-UC-3, TCCSUP og HT-1376 ble dyrket i Eagle minimums viktig medium (EMEM) (Hyclone); og RT4, EJ og SV40-transformert nyrecellelinje 293T ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) (Hyclone).
RNA Utvinning og kvantitativ real-time PCR
Total RNA ble ekstrahert fra pasientenes blæreprøver eller cellelinjer som bruker TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) i henhold til produsentens protokoll. Kvantitativ real-time PCR (qPCR) ble gjort ved hjelp av SYBR grønn analysen (Takara Biotechnology, Dalian, Kina) på en Roche LightCycler 480 maskin (Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland). qPCR ble utført som følger: en innledende predenaturation trinn i 30 sekunder ved 95 ° C, etterfulgt av amplifisering av 40 sykluser ved 95 ° C i 5 sekunder og ved 60 ° C i 20 sekunder, var smeltet kurve analyse utført på slutten. Alle reaksjoner ble utført i en 20 ul reaksjonsvolum i tre eksemplarer. Ekspresjonsnivået av HOXB5 ble evaluert ved den komparative Ct-metoden. GAPDH ble anvendt som en intern kontroll. Primerne benyttet for HOXB5 var: forstand, 5′-TGAAGCACAGGGTTATAACGACCA-3 «, antisense, 5′- GCAGCGGGATCCCTGTAAGA-3′; og for GAPDH primerne var:. forstand, 5»- GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3 «, antisense, 5′- GAAGATGGTGATGGGATTTC-3»
Immunhistokjemi
parafininnstøpte, formalin-fikserte vev ble kuttet i 5-mikrometer delen, plassert på en polylysin-belagt lysbilde, deparaffinized i xylen, rehydrert bruker gradert etanol, behandlet for endogen peroxydaseaktivitet i 0,3% hydrogenperoksid og behandlet for antigen gjenfinning av mikrobølgeoppvarming i 10 mM citratbuffer (pH 6,0) . Seksjoner ble inkubert ved 4 ° C over natten med HOXB5 kanin polyklonalt antistoff (1:100, Abcam, Cambridge, MA, USA). Immunfarging ble utført ved anvendelse av ChemMate ™ DAKO EnVision ™ Detection Kit (DakoCytomation, Glostrup, Danmark), som resulterte i et brunt bunnfall på antigen-området. Deretter deler ble kontra med hematoksylin (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, USA) og montert i ikke-vandig monteringsmedium. Det primære antistoff var utelatt for de negative kontrollene.
Western Blot
Protein ble ekstrahert fra blærekreft vev og cellelinjer som beskrevet [19]. I korthet ble 30 ug av protein fra hver prøve ble separert ved elektroforese i en natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel før de ble overført til polyvinylidenfluorid membraner (Millipore, Billerica, MA, USA) i 2 timer. Deretter ble membranene blokkert i 1 time ved værelsestemperatur med 5% bovint serumalbumin (BSA), og inkubert i TBST (Tris bufret saltvann med 0,05% Tween) inneholdende kanin-polyklonalt anti-IgG2a HOXB5 (1:1000, Abcam) eller GAPDH (1:1000, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) over natten ved 4 ° C. Membranene ble inkubert med peroksidase-konjugert geite-anti-kanin-immunoglobulin (1:5000, Cell Signaling Technology) som sekundær antistoff og deretter visualisert ved anvendelse av en kommersiell ECL-kit (Pierce, Rockford, IL, USA).
Cell transfeksjon med si-HOXB5 og miRNA-7
sirnas utformet for å HOXB5 og miRNA-7 ligner ble transfektert inn i blæren kreftceller T24, 5637 og TCCSUP hjelp Lipofectamine-RNAiMAX (Invitrogen). Sekvensene som benyttes for si-HOXB5 var, sense: 5′-GGAUGGACCUCAGCGUCAATT-3 «, antisense: 5′-UUGACGCUGAGGUCCAUCCTT-3′; Mir-7 ligner, følelse: 5»-CAACAAAUCACAGUCUGCCAUA-3 «, anti: 5′-UAUGGCAGACUGUGAUUUGUUG-3′; og for den negative kontrollen, sense: 5»-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 «, antisense: 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3». Alle RNA oligonukleotider ble kjøpt fra Genepharma (Shanghai, Kina). En dag før transfeksjon, 2 x 10
5-celler ble sådd ut på en seks-brønns plate. Den neste dag, når cellene nådde 70-80% konfluens, ble de transfektert med RNA i en sluttkonsentrasjon på 100 nM i henhold til Lipofectamine-RNAiMAX protokoll. Transfeksjonseffektiviteten målt ved qPCR, var 70% for T24, 72% for 5637 og 75% for TCCSUP (data ikke vist).
celleproliferasjonsanalyse
Menneskelig blære kreft cellelinjer T24, 5637 og TCCSUP ble sådd ut på 6-brønners plater og inkubert ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator én dag før transfeksjon. Etter transfeksjon med sirnas (100 nM) eller en negativ kontroll i 24 timer, ble cellene samlet og sådd ut på 96-brønners plater for cellenes levedyktighet evaluering ved hjelp av en CCK8 assay (Celletelling leder-8) (Dojindo Laboratories, Japan) ifølge protokollen [20].
In vitro
Cell Migration analysen
Etter blærekreft cellelinjene T24, 5637 og TCCSUP ble transfektert med SI-HOXB5 (100 nM) eller uspesifikk kontroll (NC) siRNA i 24 timer, ble cellene høstet og suspendert i 100 ul serumfritt medium og deretter belagt (1 x 10
4 celler) i det øvre rom av Transwell-plater (Corning, NY, USA ). De Transwell innskudd ble deretter plassert i det nedre kammeret av en 24-brønners plate inneholdende 600 ul av mediet med 20% FBS som chemo-lokkemiddel. Etter en 24-timers inkubasjonsperiode ble cellene igjen på den øvre overflate av membranen fjernes, og cellene på den nedre overflate ble fiksert i 100% metanol i 30 minutter, etterfulgt av farging med 0,1% krystallfiolett oppløsning i 30 minutter. Celler som farget lilla ble definert som positiv, og bildene ble tatt med et mikroskop (10 ×) (Olympus, Center Valley, PA, USA).
Colony Forming analyse
Etter transfeksjon med si -HOXB5 (100 nM) eller NC siRNA i 24 timer, ble de humane blærecancerceller T24, 5637 og TCCSUP samlet og plassert på ei ny seks-brønns plate (500 celler for T24 og 1000-celler for 5637 og TCCSUP). Cellene ble dyrket i ca. 2 uker for å danne kolonier. Kolonier ble fiksert med 100% metanol og farget med 0,1% krystallfiolett i 20% metanol i 15 min. Kolonidannende effektivitet ble beregnet som kolonier /belagt celler × 100%.
Bioinformatikk
NCBI SNP database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/) ble benyttet for å finne SNP’er som befinner seg i 3′-UTR av HOXB5 genet. Fire offentlig tilgjengelige algoritmer, PicTar (https://pictar.mdc-berlin.de/), TargetScan (https://www.targetscan.org/), Miranda (https://www.microrna.org/) og Diana mikrotiterplater (https://diana.pcbi.upenn.edu/) ble brukt til å forutsi hvilken av de menneskelige miRNAs i miRbase (https://www.mirbase.org/) kan binde til 3′-UTR av HOXB5. De mirnas som ble spådd av minst to av de algoritmer til å binde ble akseptert som kandidater for videre studier. MRNA-sekundærstruktur prediksjon verktøy MFOLD (https://mfold.rna.albany.edu/) ble anvendt for å forutsi den sekundære strukturen til HOXB5 mRNA. Liten minimal fri energi (MFE) indikerer høy stabilitet av den anslåtte mRNA sekundær struktur.
luciferaserapportørplasmid analysen
Vi konstruerer luciferaserapportørplasmid plasmider med HOXB5 3′-UTR fragment som inneholdt den antatte binding områder for kandidaten miRNA og subklonet dem inn i psiCHECK-2 vektor (Promega, Madison, WI, USA) for å fremstille den psiCHECK-2-3′-UTR-WT plasmid. Mutanten HOXB5 3′-UTR ble generert ved hjelp av fusjons PCR-metoden, og da det også subklonet inn i psiCHECK-2 vektor for å produsere den psiCHECK-2-3′-UTR-MUT plasmid. DNA-sekvensanalyse ble benyttet for å bekrefte sekvensen av de konstruerte plasmider.
For luciferase reporter analysen, HEK-293T-celler (2 x 10
4) ble anbragt på en 24-brønners plate en dag før transfeksjon. Neste dag 0,5 mikrogram av enten psiCHECK-2-3′-UTR-WT eller psiCHECK-2-3′-UTR-MUT, og enten miRNA eller negativ kontroll ble transfektert inn i HEK-293T celler ved hjelp Lipofectamine2000 ( Invitrogen). Analyser ble utført 48 timer etter transfeksjon ved bruk av dual-luciferase reporter Assay System (Promega). Luciferase aktivitet ble oppdaget ved hjelp av GloMax-Multi Detection System (Promega). De Renilla luciferase-signaler ble normalisert til den indre ildflue luciferase transfeksjon kontroll. Transfections ble gjort i tre eksemplarer i uavhengige eksperimenter.
DNA Extraction og HOXB5 Genotyping analyse
Totalt DNA ble ekstrahert fra pasientenes blærekreftprøver og cellelinjer ved hjelp QIAamp reagens (Qiagen, Germantown, MD , USA) i henhold til produsentens protokoll. HOXB5 genotyping ble utført ved anvendelse av en DNA-sekvenseringsanalyse. Et 334 bp DNA-fragment inneholdende SNP i det 3′-UTR av HOXB5 genet ble amplifisert fra genomisk DNA. PCR-primere som ble anvendt var, frem til 5′-GCGCATGAAGTGGAAGAAGG-3 «, revers 5′-TTGGGACAAGCAGAAGGGAG-3». Det amplifiserte DNA-fragmentet ble sekvensert ved hjelp GENESCAN programvare (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
Måling av Expression of HOXB5 mRNA
HOXB5 mRNA nivå ble målt i tre blærekreft -cellelinjer (5637, J82 og RT4) og 13 blærekreft vev. Regionspesifikke TaqMan prober ble konstruert for å detektere SNP i det 3′-UTR av HOXB5 mRNA. CDNA fra cellelinjer og kreftvev ble utsatt for qPCR og fluorescens (VIC for 1010A, FAM for 1010G) ble målt ved anvendelse av LightCycler 480 Probes Master (Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland).
Genomisk DNA Det ble også utvunnet fra cellelinjer og cancervev som nevnt. Som en intern kontroll, ble qPCR utført for å bestemme de genomiske DNA-nivåer av HOXB5 å bruke de samme regionsspesifikke TaqMan prober.
HOXB5 mRNA Half-life
qPCR ble også brukt til å måle halv -livet av HOXB5 mRNA. 1 x 10
6 T24 og TCCSUP blærecancerceller ble platet ut på en 10 cm plate en dag før Actinomycin D (5 ug /ml), som hemmer transkripsjon genetisk, ble tilsatt til cellene. Etter å ha behandlet med actinomycin D, ble cellene lysert ved hjelp av TRIzol ved forskjellige tidspunkter, 0-h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h og 48 h. Total RNA ble ekstrahert, og det HOXB5 mRNA-nivået ble kvantifisert ved qPCR hjelp av Taqman-analyse som beskrevet ovenfor.
Statistisk
Alle data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM fra minst tre separate forsøk . Forskjellene mellom grupper ble analysert ved anvendelse av Students t test når bare to grupper ble sammenlignet, eller, ved en-veis analyse av varians (ANOVA) når mer enn to grupper ble sammenlignet. Den aldersjusterte odds ratio (AOR) og 95% konfidensintervall (KI) for forholdet mellom de HOXB5 3′-UTR genotypefrekvensene og kliniske eller histologiske funksjoner ble bestemt av multivariate logistisk regresjonsanalyse i SPSS 17.0 med alderen betraktet som en faktor . Alle statistiske tester var tosidig. Forskjeller ble vurdert som statistisk signifikant på p. 0,05
Resultater
HOXB5 var over-uttrykt i Human blærekreft vev og cellelinjer
RNA ble ekstrahert fra 35 pasienter med blærekreft og 8 blærecancercellelinjer og ekspresjonen av HOXB5 ble målt ved bruk qPCR. Som vist i figur 1A, av 35 prøver, 23 (~70%) utviste høyere ekspresjon av HOXB5 sammenlignet med vanlig tilstøtende vev (NAT). Uttrykket av HOXB5 var også høyere i seks av åtte blærekreft cellelinjer (TCCSUP, 5637, T24, RT4, HT-1376, og J82) enn i normale blære celler (Figur 1b). Immunhistokjemiske studier ved hjelp av den HOXB5-spesifikt antistoff bekreftet at ekspresjonen av HOXB5 er høyere i blærecancer vev enn normale blære vev (figur 1C). Imidlertid var det ingen korrelasjon mellom ekspresjonen av HOXB5 og svulsten trinn eller trinn (data ikke vist). Disse resultatene antydet at overekspresjon av HOXB5 kan være vanlig i noen blærekreft vev og i cellelinjer.
A. Uttrykk av HOXB5 i 35 blærekreft vev i forhold til normale tilstøtende vev (NAT). Kolonner over x-aksen viser overekspresjon av HOXB5; de under x-aksen indikerer ned-uttrykk for HOXB5 forhold til NAT. B. Uttrykk av HOXB5 i åtte blærekreft cellelinjer i forhold til normal blæreceller. Kolonner over x-aksen viser overekspresjon av HOXB5; de under x-aksen indikerer ned-uttrykk for HOXB5 forhold til normale celler. Brett endringer 1 ble ansett å være positiv. C. HOXB5 uttrykk i grunnskolen overgangs celle blære kreft vev oppdaget av immunhistokjemi. C1 og C2, blære kreft vev, G2 karakteren. C3, Blærekreft vev, G3 klasse. C4, Normal blæren vev. Alle bilder er × 100. Farging: brun, HOXB5
HOXB5 Fremmer celleproliferasjon og migrasjon av blærekreft Cells
Vi fant at HOXB5 ble over uttrykt i blærekreft vev og i cellelinjer, noe som indikerer at. HOXB5 kan virke som et onkogen. For å undersøke onkogene funksjon HOXB5, transfektert vi si-HOXB5 og NC siRNA til T24, 5637 og TCCSUP celler. 48 timer etter transfeksjon, viste en CCK8 analyse som cellevekst ble betydelig redusert i SI-HOXB5 transfektert grupper sammenlignet med NC gruppe eller håne gruppe (Lipofectamine only) (figur 2A, p 0,05). Vi fant også at migreringen evnen til si-HOXB5 transfekterte celler ble signifikant hemmet sammenlignet med NC gruppe eller uekte gruppe (figur 2B). Resultatene indikerte at HOXB5 kan fremme celleproliferasjon og migrering av blæren kreftceller, i samsvar med en rolle i en onkogen.
A. Spredning av blærekreft cellelinjer T24, 5637 og TCCSUP. En CCK8 assay ble anvendt for å undersøke cellevekst av blærecancerceller. B. Migrering av blære kreft cellelinjer. Venstre kolonne, si-HOXB5 transfektert gruppe; høyre kolonne, NC siRNA transfekterte gruppe. Alle bilder er × 10. Farging: lilla, migrasjonsceller. C. Colony dannelse (C1) og kolonidannende effektivitet (K2) av blærekreft celler etter transfeksjon med SI-HOXB5 eller NC siRNA. Kolonidannende effektivitet = kolonier /belagt celler × 100%. * P 0,05, ** p 0,01. NC, uspesifikke kontroll. Spottes Lipofectamine bare.
si-HOXB5 undertrykker Clonogenicity
in vitro
For å undersøke mulighetene rolle HOXB5 i tumorigenesis videre undersøkte vi effekten av HOXB5 på koloni dannelsen av kreftceller
in vitro
. Tre blærecancercellelinjer (T24, 5637 og TCCSUP) ble transfektert med en Si-HOXB5 eller NC duplex, og tillatt å vokse ved svært lav tetthet (500 celler for T24, 1.000 celler for 5637 og TCCSUP) i omtrent 14 dager. Spesielt, si-HOXB5 hemmet, både i størrelse og antall, evne til blærecancerceller til å danne kolonier (figur 2 C1). Videre SI-HOXB5 transfekterte celler viste lavere koloni-dannende effektivitet enn NC-transfekterte celler (figur 2 C2, p 0,01). Disse data støttes videre onkogene effekten av HOXB5 i blæren kreftceller.
SNP-1010A /G ligger innenfor miRNA-7 Binding Site i HOXB5 3′-UTR
Vi fant SNP rs9299 ( 1010 A /G) ligger innenfor det 3′-UTR av HOXB5-genet ved hjelp av NCBI-databasen SNP. HOXB5 ble også anslått til å være en av de målgener av miRNA-7 i henhold til tre av de forskjellige systemiske bioinformatikk programvare som vi brukt, og SNP (1010 A /G) ble plassert inne i miRNA-7-bindingssete (figur 3A) .
A. HOXB5 ble spådd som en direkte mål av MIR-7 av Miranda, PicTar og TargetScan. B. Luciferase analyse i HEK-293T celler. WT, vill type. MUT, mutant type. C. Effekt av MIR-7 overekspresjon på uttrykket nivåer av endogen HOXB5 i T24, 5637 og TCCSUP celler. Endogene HOXB5 mRNA og proteinnivåer ble analysert ved qPCR (C1) og Western blot (C2) henholdsvis. p-aktin, intern kontroll. ** P 0,01, sammenlignet med NC transfektanter. NC, uspesifikke kontroll.
For å validere HOXB5 som en bona fide mål av MIR-7, et menneske HOXB5 3′-UTR fragment som inneholder enten villtype eller mutant MIR-7-bindende sekvensen ble subklonet nedstrøms for Renilla luciferase reporter-gen, som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Den relative luciferaseaktivitet av reporterinneholdende villtype HOXB5 3′-UTR ble signifikant undertrykt når MIR-7 ble ko-transfektert (p 0,01). I motsetning til dette luciferaseaktiviteten av reporter som inneholder den mutante MIR-7-bindingssete var nesten upåvirket (p 0,05). (Figur 3B)
For ytterligere å undersøke reguleringen av HOXB5 ekspresjon ved MIR-7, vi transfektert MIR-7 ligner og NC i cellelinjene T24, 5637 og TCCSUP. Etter 48 timer, vi undersøkte HOXB5 mRNA og proteinnivåer ved hjelp av qPCR og western blot. Vi fant at HOXB5 mRNA og proteinnivåer ble nedregulert i MIR-7 transfektert grupper sammenlignet med NC gruppene (figur 3 C1 C2).
Resultatene indikerte at Mir-7 kan regulere HOXB5 uttrykk både på post-transkripsjon og mRNA nivåer.
SNP 1010A /G påvirker HOXB5 Expression
for å undersøke virkningen av SNP 1010A /G på uttrykk for HOXB5, vi undersøkte mRNA nivåer av HOXB5 for 1010A og 1010G alleler i heterozygot GA genotype blærecancer vev (13 tilfeller) og cellelinjer (5637, RT4 og J82), ved hjelp av Taqman-analyse som beskrevet ovenfor. Vi har funnet at ekspresjonen av mRNA HOXB5 med 1010G allelet var betydelig høyere enn det mRNA med den 1010A allelet i både kreft vev og cellelinjer (figur 4A1 og A2). Med uttrykket forholdet mellom 1010G til 1010A i det genomiske DNA fra disse heterozygot cancer vev og cellelinjer var lik (figur 4B1 og B2). Disse resultatene viste at 1010A /G SNP i HOXB5 3′-UTR påvirket ekspresjonen av HOXB5 mRNA.
A1. Uttrykk av mRNA for hvert allel i heterozygote GA genotype cellelinjer (5637, RT4 og J82) og vev (13 tilfeller). A2. Ekspresjon av mRNA (Mean) for hvert allel i heterozygot GA genotype cellelinjer og vev. Y-aksen, ekspresjon av HOXB5 mRNA. Ct: syklus terskel, beregnet fra Realtime-PCR maskin. B1. Ekspresjon av heterozygot genomisk DNA som en intern kontroll. B2. Ekspresjon av heterozygot genomisk DNA (Mean) som en intern kontroll. Y-aksen, ekspresjon i genomisk DNA. *** P. 0,001
De forskjellige alleler påvirker mRNA Stabilitet og HOXB5 uttrykk nivåer
For å forutsi mulige mekanismer hvordan 1010A /G SNP resulterer i differensial HOXB5 uttrykk nivåer, vi anvendes mRNA-sekundærstruktur prediksjon verktøy MFOLD for å forutsi den sekundære strukturen til mRNA med A og G-alleler. Vi fant at den antatte minimale frie energi (MFE) fra den sekundære struktur av mRNA med G-allelen var lavere enn den til mRNA med A-allelen (-5,4 -3,0 vs). Dette resultat indikerte at strukturen av mRNA med G allel kan være mer stabile enn for mRNA med A-allel (Figur 5A).
For ytterligere å utforske hvilken allele (A eller G) overdratt mer stabil målte vi mRNA halveringstid, fordi det har vist seg at den stabile tilstand av mRNA er nært knyttet til mRNA halveringstid [21]. Vi undersøkte halveringstiden til mRNA HOXB5 i homozygot T24 og TCCSUP blærekreftceller (GG for T24 og AA for TCCSUP) etter behandling med actinomycin D, ved hjelp av qPCR. Resultatene viste at halveringstiden til HOXB5 mRNA i cellene med den GG genotype var 3,5 ganger (11 h) enn det mRNA halveringstid (3,4 h) i cellene med AA genotype (figur 5B), noe som indikerer at mRNA med G-allelen var mer stabilt enn det mRNA med A-allelen. Dette forskjellig stabilitet på de to mRNA kan være mulig mekanisme som forklarer den annen effekt av SNP på HOXB5 uttrykk.
A. Sekundære konstruksjoner av HOXB5 mRNA spådd av MFOLD. Minimal fri energi (MFE) kan reflektere mRNA stabilitet. B. halveringstiden til mRNA i HOXB5 T24 (GG genotype) og TCCSUP (AA genotype) celler. Halveringstiden for mRNA med G-allelen var ca 11 timer, og omtrent 3,7 timer med en allel. C. HOXB5 uttrykk nivå etter transfeksjon med MIR-7 i forhold til NC i 5637 celler (GA genotype). Både A og G alleler av mRNA transfektert med MIR-7 viste nedregulering i forhold til NC-gruppen. Nivået av HOXB5 mRNA med den A-allelen redusert mer enn mRNA med den G-allelet. D. Luciferase analyse i HEK-293T celler av MIR-7 aktivitet. Vector, psiCHECK-to Vector. * P 0,05, ** p 0,01, *** p. 0,001
bindingsaktiviteten til MIR-7 for forskjellige alleler av mRNA påvirker HOXB5 Expression nivå
transfektert MIR-7 til en blærekreft cellelinje (5637) med heterozygot GA genotype i 48 timer og målte HOXB5 mRNA nivå med Taqman assay. Vi har observert at overekspresjon av MIR-7 kan i betydelig grad hemme ekspresjonen nivået av HOXB5 mRNA sammenlignet med NC gruppe? Interessant, ekspresjonsnivået av HOXB5 mRNA med A-allelen minsket mye mer enn nivået av mRNA med den G-allelet (figur 5C), noe som indikerer at bindingen av MIR-7 til HOXB5 mRNA med A-allelen var større enn mRNA med G-allelet.
For å validere vår hypotese, gjennomførte vi en luciferase assay. Den relative luciferaseaktivitet ble undertrykket mye mer i rapportørinneholdende 1010A transfektert med MIR-7 enn det inneholdende 1010G allelet (figur 5D). Resultatene viste at bindingsaktiviteten av MIR-7 med enten 1010A eller 1010G allel kan være en annen viktig mekanisme involvert i de ulike HOXB5 uttrykk nivåer berørt av SNP.
Foreningen mellom 1010A /G HOXB5 Genotype frekvens og blærekreft
Deretter undersøkte vi sammenhengen mellom 1010A /G HOXB5 genotype frekvens og kliniske kjennetegn blærekreft. DNA ble ekstrahert fra 391 pasienter med blærekreft som ble bekreftet av patologer, og fra 391 normale kontroller, og SNP (1010A /G) genotyper for hver prøve ble analysert. Vi fant ut at G allel (AG + GG) genotyper var assosiert med risiko for høy grad (grad 2 og 3, AOR = 4,25, p 0,001, Tabell 1) og høy stadium (T2-T4, muskel invasiv type, AOR = 2,25, p = 0,003, Tabell 2) kreft som mot lav karakter (Grade1) og lav scenen (T1, ikke-muskel invasiv type) kreft. Vi viste også at hyppigheten av G genotyper (AG + GG) var høyere i blærekreft gruppen sammenlignet med normale kontroller (AOR = 1,48, p = 0,017) (Tabell 3).
