Abstract
Nåværende genome-wide mikroRNA (miRNA) uttrykk signaturanalyse ved hjelp av dype sekvense teknologier kan kjøre oppdagelsen av nye kreft pathways regulert av onkogene og /eller kreft undertrykkende miRNAs. Vi er fast bestemt på genom-wide miRNA uttrykk signatur i blærekreft (BC) ved dyp sekvenseringsteknologi. Totalt ti små RNA bibliotekene ble sekvensert (fem Bachelor og fem prøver av histologisk normal blære epitel (NBE)), og 13.190.619 til 18.559.060 rent lite RNA leser ble oppnådd. Totalt 933 kjente miRNAs og 17 nye miRNA kandidater ble påvist i denne analysen. Blant de kjente mirnas, ble totalt 60 mirnas betydelig nedregulert i BC i forhold til NBE. Vi fant også at flere mirnas, for eksempel
MIR-1 /133a
,
MIR-206 /133b
,
la-7c /MIR-99a
,
MIR-143/145 Hotell og
MIR-195/497
, var plassert tett sammen på fem forskjellige loci og utgjorde klynge miRNAs. Blant disse gruppert mirnas fokuserte vi på
MIR-195/497
klynge fordi dette gruppert miRNA hadde ikke blitt analysert i BC. Transfeksjon av modne
MIR-195
eller
MIR-497
i to BC cellelinjer (gutt og T24) betydelig hemmet kreft celle spredning, migrasjon og invasjon, noe som tyder på at
speil 195/497
klynge fungert som tumor suppressors i BC. Angående gener målrettet av
MIR-195/497
klynge, det TargetScan algoritmen viste at 6,730 gener var antatt
MIR-195/497
mål, og 113 betydelig beriket signalveier ble identifisert i denne analysen. Kategorien «Pathways i kreft» ble den mest beriket, som involverer 104 kandidat målgener. Genuttrykk data viste at 27 av 104 kandidat målgener faktisk ble oppregulert i BC kliniske prøver. Luciferaserapportørplasmid analyser og Western blotting viste at
BIRC5 Hotell og
WNT7A
ble direkte angrepet av
MIR-195/497
. Avslutningsvis ble avvikende uttrykk for grupperte mirnas identifisert av dyp sekvensering, og nedregulering av
MIR-195/497
bidratt til BC progresjon og metastasering. Tumor undertrykkende miRNA-mediert kreft trasé gir ny innsikt i de potensielle mekanismer BC onkogenese
Citation. Itesako T, Seki N, Yoshino H, Chiyomaru T, Yamasaki T, Hidaka H, et al. (2014) The mikroRNA Expression underskrift blærekreft ved Deep Sequencing: Den funksjonelle betydningen av
MIR-195/497
Cluster. PLoS ONE 9 (2): e84311. doi: 10,1371 /journal.pone.0084311
Redaktør: Bernard W. Futscher, The University of Arizona, USA
mottatt: 02.04.2013; Godkjent: 13 november 2013; Publisert: 10 februar 2014
Copyright: © 2014 Itesako et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble delvis støttet av departementet for utdanning, vitenskap, idrett og kultur Grants-i-Aid for Scientific Research (C), 23501298 og 23592340, 2011. Ingen ytterligere ekstern finansiering mottatt for denne studien. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i utviklede land, blærekreft (BC) er den femte vanligste diagnosen svulst og den nest vanligste dødsårsaken hos pasienter med urogenitalsystem maligniteter. I USA er det mer enn 73.000 nye tilfeller og 14.000 dødsfall årlig [1]. I Japan, ble antall nye BC pasienter anslått til 17 461 i 2007, og antall dødsfall ble anslått til 7008 i 2011 [2].
Bachelor kan deles inn i to kategorier, ikke-muskel-invasiv svulster og muskel-invasive svulster. Selv om 70% -80% av pasientene er diagnostisert med ikke-muskel-invasiv tumorer, er høy tilbakefallsprosent (50% -70%) observert hos disse pasientene. Videre blant tilbakevendende tilfeller, 15% av Bachelor videre til muskel-invasiv sykdom [3]. De fem-års overlevelse for pasienter med ikke-muskel-invasiv BC er nær 90%, mens den for pasienter med muskel-invasiv BC er omtrent 60% [4]. Videre nesten 80% av pasienter med lymfeknutemetastaser dø i løpet av de første fem årene [5]. Siden de fleste kliniske studier av kjemoterapeutika for avansert BC har vist begrensede fordeler, nye prognostiske markører og effektive behandlingsstrategier basert på dagens kreft-genomanalyser er nødvendig.
Oppdagelsen av ikke-kodende RNA i det menneskelige genom var en viktig konseptuelt gjennombrudd i post-genom sekvense æra [6]. Bedre forståelse av ikke-kodende RNA er nødvendig for fortsatt fremgang i kreftforskning. mirnas utgjør en klasse av små, ikke-kodende RNA-molekyler, 19-22 nukleotider i lengde, som modulerer genekspresjon. Forordning oppnås gjennom ufullkommen sammenkobling med mål messenger RNA (mRNA) av proteinkodende gener og transkripsjonen eller post-transcriptional regulering av deres uttrykk [7]. Foreløpig 2.042 mennesker modne mirnas er registrert på miRBase slipper 20,0 [https://microrna.sanger.ac.uk/]. En voksende mengde bevis indikerer at mirnas også bidra til initiering, utvikling og metastasering av ulike typer kreft. Mange kreft hos mennesker viser avvikende uttrykk for miRNAs som kan fungere enten som tumor suppressors eller onkogener [8]. Derfor er identifisering av abnorme uttrykt mirnas det første skrittet mot å belyse miRNA-mediert onkogene trasé i kreft hos mennesker.
Utvikling av high-throughput, dyp sekvenseringsteknologi har raskt avdekket roman informasjon om miRNAs. Deep sekvensering analyse synes å være bedre enn microarray- eller PCR-baserte metoder som er begrenset til kjente mirnas og vanligvis inneholder ikke en fullstendig liste over kjente miRNAs sekvenser. Deep sekvense analysen vil bli gullstandarden metode for omfattende miRNA analyse i kreftgenomforskning. miRNA uttrykk signaturer av BC innhentet av dyp sekvenseringsteknologi har ført til fire nye publikasjoner [9] – [12] og denne studien utgjør den femte rapporten. Totalt ti små RNA bibliotekene ble sekvensert (fem blære carcinoma og fem matchet, histologisk normale prøver av urothelia), som fører til 13.190.619 til 18.559.060 rent lite RNA leser i denne analysen. Vi oppdaget 933 kjente mirnas og 17 nye miRNA kandidater i vår serie av prøver.
Noen mirnas ligger i umiddelbar nærhet til hverandre på det menneskelige genom, og blir derfor kalt gruppert miRNAs. I det humane genom, er 247 humane mirnas blitt funnet å være gruppert på 64 steder på inter-miRNA avstander mindre enn 5000 bp [13].
MIR-15a /16
klyngen, for eksempel, er godt kjent for å opptre som en tumor suppressor ved å målrette flere onkogener, inkludert
BCL2
,
MCL1
,
CCND1 Hotell og
WNT3A product: [14] – [16], mens
MIR-17/92
klynge er anerkjent som et onkogen [17]. Vi har tidligere rapportert at
MIR-1-1 /133a-2 Hotell og
MIR-1-2 /133a-en
dannet klynger i forskjellige kromosom loci i det menneskelige genom, 20q13.33 og 18q11.2, henholdsvis, og disse klyngene fungere som tumor suppressors, rettet mot flere onkogener i humane kreftformer, inkludert BC [18] – [24].
MIR-143/145
klynge ligger i 5q32 locus og ble også rapportert som en svulst undertrykkende miRNA klyngen i BC [25] – [28]. Vi valgte 60 downregulated mirnas i BC signatur og undersøkt deres kromosom loci. Interessant, blant 60 mirnas, fant vi at flere dannet klynger, slik som
MIR-1 /133a
,
MIR-206 /133b
,
la-7c /MIR-99a
,
MIR-143/145 Hotell og
MIR-195/497
.
i denne studien har vi en hypotese om at
MIR-195/497
klynge fungerte som en tumor suppressor gjennom målretting av flere onkogene gener involvert i spesifikke kreftrelaterte trasé i BC. Basert på denne hypotesen, vi utførte gain-of-funksjon studier i microRNAs transfektanter og også forsøkt å identifisere roman
MIR-195/497
cluster-mediert molekylære mål og stier av
i silico
analyse . Forstå rollen mirnas vil gi en effektiv og lovende strategi for miRNA-forbundet evidensbaserte terapi for behandling av BC.
Resultater
Sekvensering og annotering av små RNA
ti små RNA bibliotek (fra fem Bachelor og fem NBEs) ble sekvensert ved hjelp dyp sekvenseringsteknologi. Pasientenes egenskaper er vist i tabell 1. I første omgang leser 13.905.124 til 18.938.856 rå sekvens ble fremstilt for biblioteker. Etter filtrering og trimming av leser for lav kvalitet og adaptere, fra 13.190.619 til 18.559.060 rent lite RNA leser ble oppnådd (tabell 2). Fordelingen av nukleotid lengder av rent lite RNA leser variert fra 16 til 38 nukleotider i hvert bibliotek. Den mest tallrike lengde var 22 nukleotider (Figur S1). Alle av høy kvalitet rent leser større enn 18 nukleotider ble kartlagt for det menneskelige genom og disse genom-matchet leser ble delt inn i ulike kategorier av små RNA i henhold til deres biogenesis og annotering (tabell 3). Begge BCs og NBEs inneholdt flere og heterogene små RNA arter som inkluderte miRNA, degraderings fragmenter av ikke-kodende RNA (tRNA, rRNA, snRNA, snoRNA, etc.), genomiske gjentar, mRNA, eller uklassifiserte RNA. Den mest tallrike RNA kategori fra hvert bibliotek var miRNA. Sekvensdataene fra denne studien ble avsatt i DDBJ Sequence Les Archive (tiltredelse nummer, DRA001043)
Identifikasjon av downregulated mirnas basert på miRNA uttrykket signaturer av BC
Vi skilte høykvalitets rene Les sekvenser i hvert bibliotek inn i to kategorier, mirnas eller ikke-kodende RNA bruker NCBI GenBank data, Rfam data og miRBase. I denne studien ble totalt 933 kjente miRNAs og 17 kandidat nye mirnas oppdaget av høykvalitets rene Les sekvenser (tabell S1 og S2). Uttrykket nivåer av de nye miRNA kandidatene var lav og de funksjonelle rollene ble ikke vurdert nok (tabell S2). Av disse grunner utelukket vi dem fra analysen. Imidlertid er den funksjonelle betydning av disse nye miRNA kandidatene viktig, og de vil bli undersøkt i fremtiden. Her fokuserte vi på de 933 kjente mirnas og etablerte miRNA uttrykket signaturen til BC ved dyp sekvensering. Forskjellig uttrykt mirnas ble identifisert ved hjelp av edger program med en generell lineær modell. Totalt 60 downregulated miRNAs ble valgt for denne analysen (tabell 4).
Neste, vi kartlagt downregulated mirnas i det menneskelige genom og funnet flere mirnas som var i nærheten av hverandre og ble kalt grupperte miRNAs, slik som
MIR-1 /133a, MIR-206 /133b, la-7c /MIR-99a, MIR-143/145 Hotell og
MIR-195/497 plakater (tabell 5). Fordi rolle
MIR-195/497
klynge hadde ikke blitt rapportert i BC, fokuserte vi på det for videre studier. Som vist i figur 1,
MIR-195 Hotell og
MIR-497
befinner seg innenfor samme kromosom region (17p13.1), 209 bp hverandre.
MIR-195 Hotell og
MIR-497
er i et intron av
MIR497HG
genet på menneskets kromosom 17q13.1, hvor de er atskilt av 209 bp.
Expression nivåer av
Mir-195
og
MIR-497
i kliniske prøver
for å validere uttrykk nivåer av
speil 195 Hotell og
MIR-497
i kliniske prøver, vi utsatt 29 Bachelor og 20 NBEs å demme-loop RT-PCR. Vi fant at uttrykket nivåer av
MIR-195 Hotell og
MIR-497
i BCs var betydelig lavere enn i NBEs (
MIR-195
: 0,083 ± 0,078 og 1,367 ± 1,178, P 0,0001;
MIR-497
: 0,056 ± 0,058 og 1,928 ± 2,425, P 0,0001) (figur 2A, B). Interessant Spearman korrelasjonskoeffisient oppnådd med rank test viste en signifikant positiv sammenheng mellom uttrykk nivåer av
Mir-195
og
Mir-497
i de kliniske prøvene (r = 0,984, P 0,0001) (figur 2C).
A, B) uttrykk for
MIR-195 Hotell og
MIR-497
var betydelig lavere i 20 kliniske BC prøver enn i 29 tilstøtende noncancerous prøver.
RNU48
ble brukt som intern kontroll. *, P 0,0001. C) Betydelig positiv korrelasjon mellom miRNA uttrykk mønstre av
MIR-195 Hotell og
MIR-497 plakater (rank test Spearmans korrelasjonskoeffisient r = 0,984, P . 0,0001)
Effekt av
Mir-195 Hotell og
MIR-497
transfections på celleproliferasjon, invasjon, og migrasjon aktiviteter BC cellelinjer
for å undersøke de funksjonelle roller disse mirnas, vi utførte gain-of-funksjon studier ved hjelp av miRNA transfektanter. Den XTT analysen viste signifikant hemming av celleproliferasjon i
MIR-195 Hotell og
MIR-497
transfektanter (BOY og T24) i sammenligning med MIR-kontroll transfektanter (prosentandel av cellen levedyktighet for BOY : 61,7 ± 1,4, 59,1 ± 0,9 og 100,0 ± 2,2, henholdsvis P 0,0001, og, for T24: 66,0 ± 0,9, 67,7 ± 1,2 og 100,0 ± 2,8, henholdsvis P 0,0001) (figur 3A). Den Matrigel invasjonen analysen viste at invaderende celle tall ble betydelig redusert i begge
MIR-195- Hotell og
Mir-497
-transfected BOY og T24 cellelinjer i forhold til kontrollene (prosentandel av cellen invasjonen for BOY: 8,7 ± 3,1, 13,4 ± 1,7 og 100 ± 12,3, henholdsvis hver P 0,0001, og, for T24: 64,7 ± 16,2, 36,5 ± 7,5 og 100 ± 18,7, henholdsvis, P = 0,009 for
MIR-195
transfektant vs. kontroll, P 0,0001 for
MIR-497
transfektant vs. kontroll) (figur 3B). Den sårheling analysen viste signifikant hemming av cellemigrasjon både
MIR-195- Hotell og
MIR-497
-transfected BOY og T24 celler sammenlignet med kontrollene (prosentandel for sårheling for BOY : 51,2 ± 15,5, 43,9 ± 8,3 og 100 ± 28,7, henholdsvis hver P 0,0001, og for T24: 70,1 ± 11,4, 72,3 ± 18,8 og 100 ± 12,6, henholdsvis hver P 0,0001) (figur 3C).
Forsterkning-of-funksjon studier ble utført ved hjelp av
MIR-195
og
MIR-497
-transfected BOY og T24 i sammenligning med MIR-kontroll transfektanter. A) Celleproliferasjon bestemt ved XTT-assay. B) Celle invasjon aktivitet demonstrert ved Matrigel invasjon analysen. C) Cellemigrering aktivitet bestemmes ved leging av sår analysen. *, P 0,0001; **, P = 0,009.
Forut målgener og kreft trasé av
MIR-195/497
klynge
For å utforske de biologiske funksjonene til
MIR-195/497
klynge, vi utførte
i silico
analyser ved hjelp av to uavhengige algoritmer, TargetScan, og GeneCodis3 og offentlig microarray expression data godkjent av GEO. Arbeidsflyten for
i silico
analysen er vist i figur 4. I begynnelsen indikerte TargetScan database som 6,730 gener ble spådd målene for
MIR-195/497
klynge, som delte den samme frø sekvens «GCUGCU» i sine 3′-ikke-translaterte regioner (3’UTR).
i alt 6730 gener ble identifisert ved TargetScan algoritmen. Deretter ble 113 vesentlig anriket signalveier er identifisert ved hjelp av KEGG og GeneCodis3 programmer. Blant dem er de topp 21 beriket trasé vist i tabell S3. Uttrykket nivåer av 104 gener i toppen beriket pathway (Pathways i kreft) ble endelig evaluert. Blant dem ble 27 antatte målgener oppregulert i BC kliniske prøver basert på ekspresjonsdata av GEO database (deponeringsnummer, GSE11783 og GSE31684). (Tabell S4)
Basert på KEGG sti klassifisering, disse gener ble innblandet i 113 trasé, og «pathways i kreft» var den mest betydelig anriket (tabell S3). Totalt 104 gener ble involvert i denne veien. Vi søkte de onkogener målrettet av
MIR-195/497
klynge basert på en hypotese om at antatte onkogener ville bli oppregulert i kliniske prøver på grunn av nedregulering av tumor undertrykkende
MIR-195/497
mirnas . Ved å bruke GEO database analyse ble 27 gener valgt som
MIR-195/497
-regulated onkogene gener i BC (figur 5 og tabell S4). For å bekrefte denne analysen valgte vi de to øverste oppregulert gener (
BIRC5 Hotell og
WNT7A
), og validert om disse mirnas ble regulert av
MIR-195/497 plakater ( nedenfor).
Heat kartet diagrammet viser uttrykket av 27 kandidatgener involvert i «Pathways i kreft» i 90 BC prøver og seks tilstøtende noncancerous blære prøver.
BIRC5 Hotell og
WNT7A
var direkte regulert av
MIR-195/497
klynge i BC celler
mRNA og protein uttrykk nivåer av
BIRC5
og
WNT7A
ble nedregulert i
MIR-195- Hotell og
MIR-497-
transfektert BOY og T24 celler sammenlignet med kontroll transfektanter (Figur 6A, B).
A)
BIRC5 Hotell og
WNT7A
mRNA uttrykk 72 timer etter transfeksjon med
MIR-195
,
MIR-497
, og Mir-kontroll.
GUSB
uttrykk ble brukt for normalisering. B)
BIRC5 Hotell og
WNT7A
protein expression 72 timer etter transfeksjon med
MIR-195
,
MIR-497
, og Mir-kontroll.
GAPDH
ble anvendt som en kontroll lasting. Forholdet mellom
BIRC5
eller
WNT7A
til
GAPDH
uttrykk ble evaluert med ImageJ programvare (ver 1.43;. https://rsbweb.nih.gov/ij/index .html). * P. 0,01
neste utført luciferaserapportørplasmid analyser for å fastslå om
BIRC5 Hotell og
WNT7A
mRNA hadde funksjonelle målwebområder for
MIR-195 Hotell og
MIR-497
i BC. Vi brukte en vektor som koder for de 3-«UTRs av
BIRC5 Hotell og
WNT7A
mRNA, inkludert antatte måls for
MIR-195 Hotell og
MIR-497
(posisjonene 198-204 og 197-203, henholdsvis; tabell S5). Vi fant at luminescens intensitet ble betydelig redusert i nærvær av målet stedet for
BRIC5
av
MIR-195- Hotell og
MIR-497-
transfektanter (figur 7A ). Vi fikk det samme resultatet med en luciferase reporter analysen for
WNT7A
genet (figur 7B). Disse data antydet at
MIR-195 Hotell og
MIR-497
bundet direkte til bestemte områder i 3′-UTR av både
BRIC5 Hotell og
WNT7A
mRNA.
Luminescence intensitet ble målt i
MIR-195- Hotell og
MIR-497-
transfektanter i sammenligning med MIR-kontroll transfektant. A)
MIR-195/497
klasebindingsseter i 3′-UTR av
BIRC5
mRNA. Luciferase reporter analysen vektor brukes kodingen 3′-UTR regionen
BIRC5
inkludert antatte
MIR-195/497
målse.
Renilla
luciferasepreparater verdier ble normalisert til ildflue luciferase verdier. * P 0,01. B)
MIR-195/497
klasebindingsseter i 3′-UTR av
WNT7A
mRNA. Luciferase reporter analysen vektor er koding 3′-UTR regionen
WNT7A
inkludert antatte
MIR-195/497
målområde. * P. 0,01
Diskusjoner
Det antas at mirnas regulere uttrykk for ca 30% av alle gener i det menneskelige genom [29]. I normale celler, er samspillet mellom miRNAs og mål messenger RNA (mRNA) strengt regulert, mens denne reguleringen er ofte mangler i kreftceller. En voksende mengde bevis tyder på at mirnas er avvikende uttrykk i mange humane kreftformer, og at de spiller viktige roller i initiering, utvikling og metastasering av disse kreftformene [30]. Derfor, identifisering av abnorme uttrykt miRNAs er et viktig skritt i analysen av menneskelig onkogenese. Den siste analytiske metoden i genom, dyp sekvenseringsteknologi, har potensial for å identifisere nye vevsspesifikke mirnas inkludert de i humane kreft vev [31]. Deep sekvenseringsteknologi er i dag den gullstandarden for omfattende analyse av menneskelige miRNAs. I denne studien dypt sekvensering identifisert et stort sett med mirnas som er forskjellig uttrykt mellom BC og normal epitel.
Bestemme uttrykket signaturer av mirnas kan raskt og pålitelig avsløre mirnas som er avvikende uttrykt i kreft. Derfor vi tidligere analysert miRNA uttrykk signaturer ved bruk av PCR-basert arrays og søkte på svulst undertrykkende mirnas i BC. På denne måten har vi lykkes med å identifisere kreft undertrykkende mirnas som
Mir-1
,
MIR-133a
,
MIR-145 Hotell og
MIR-218
[18] – [20], [25], [32] – [36]. Vi sammenlignet våre tidligere resultater med de dype sekvense signaturer som er beskrevet her, slik at vi kan inkludere de opprinnelige datasettet med den nye signaturen. Hittil har det vært fire studier av BC miRNA uttrykk signaturer av dype sekvense analyser [9] – [12]. I publiserte data,
Mir-1
,
MIR-145
,
MIR-143
,
MIR-125b
, og
speil 100
har blitt oppført som de ofte nedregulert mirnas [9] – [12], data bekreftet av vår egen signatur. Dette faktum understøtter virkningen av den dype sekvense signatur, og det tyder på at det finnes nye tumorundertrykkende mirnas på disse nye data. Fordelen med denne strategien er å være i stand til å identifisere nye miRNA kandidater i BC som ikke tidligere har blitt rapportert. Vi fant 17 slike sekvenser som kan utgjøre nye miRNA kandidater. De ble imidlertid påvist ved meget lave nivåer av ekspresjon sammenlignet med kjente mirnas i både kreft og godartede vev. Den funksjonelle betydningen av disse nye miRNA kandidatene er ukjent, og det vil være viktig i fremtiden for å undersøke forholdet mellom disse søker mirnas og BC onkogenese. I denne studien, fikk vi ikke bruke vev mikro-disseksjon, derfor den nøyaktige andelen av epitelceller i normale prøver og den nøyaktige andelen av tumorceller i tumorprøver er ukjent. Imidlertid ble den tynne-klaff fra normal slimhinne blære besto hovedsakelig av NBE celler, mens tumorprøver ble utgjøres hovedsakelig av cancerøse epiteliale celler. Derfor tror vi at mindre forurensning av andre celler var ikke signifikant og ikke påvirke uttrykk nivåer av microRNAs.
microRNAs kan kategoriseres i familier basert på deres sekvenser eller i klynger basert på deres genomisk loci. Gruppert mirnas transkriberes coordinately og har lignende funksjoner som regulerer de samme målene [37]. For eksempel uttrykk for
MIR-1 /133a
klynge ofte redusert flere typer kreft, inkludert BC. Denne klyngen fungerer som en tumor suppressor rettet mot de samme onkogene gener som
TAGLN2 Hotell og
PNP product: [18] – [23]. Lignende eksempler er rapportert med andre klynger mirnas som
MIR-15a /16 Hotell og
MIR-143/145 product: [14] – [16], [25] – [28]. Dermed disse studiene viste at klynge mirnas kan fungere i kombinasjon for å oppnå sin funksjon gjennom de samme biologiske prosesser og de samme målrettede gener. Med hensyn til
MIR-195/497
klynge, har det vist seg at
MIR-195
ble nedregulert i flere krefttyper [38] – [40] og hemmet glukoseopptak, spredning, og cellesyklus ved å målrette
GLUT3 Hotell og
CDK4
i BC [41], [42]. Det har også blitt vist at m
iR-497
ble nedregulert og fungerte som en tumor suppressor av målretting
BCL2
i flere krefttyper [43], [44].
MIR-195/497
klynge også fungert som en tumor suppressor av målretting
RAF1 /CCND1
i brystkreft [45]. For å validere de siste rapportene, vi evaluert uttrykket nivåer av
Mir-195
og
Mir-497
i BC kliniske prøver, og vi bekreftet at
MIR-195 Hotell og
MIR-497
var signifikant nedregulert i tumorvev. Deretter undersøkte vi den funksjonelle betydningen av
MIR-195
og
MIR-497
i BC ved hjelp av to cellelinjer, BOY og T24. Restaurering av modne
MIR-195
eller
MIR-497
i kreftcellene viste signifikant hemming av kreftcelle spredning, invasjon og migrasjon. Våre nåværende data og tidligere studier tyder på at
MIR-195/497
klynge gjør faktisk fungerer som en tumor suppressor i BC.
mirnas er unike i sin evne til å regulere mange proteinkodende gener. Bioinformatiske spådommer indikerer at mirnas regulere mer enn 30% av proteinkodende gener [29]. I kreftceller, normale miRNA – er mRNA nettverk forstyrret av abnormt uttrykt miRNAs. Vi har tatt det standpunkt at identifisering av nye kreft trasé og ansvarlige målgener regulert av svulsten undertrykkende
MIR-195/497
klynge er et viktig første skritt i å forstå BC onkogenese. Basert på dette synet har vi identifisert molekylære stier og målet onkogener som ble regulert av
MIR-195/497
klynge hjelp genom-wide genuttrykk data og
i silico
analyse.
MIR-195/497
klynge tilhører
MIR-15/16/195/424/497
familie som deler samme 3′-UTR bindende frø sekvens (AGCAGCA). Den TargetScan database identifisert 6,730 gener som var kandidat målene for
MIR-195/497
klynge. KEGG pathway analyse indikerte at disse genene ble innblandet i 113 pathways, inkludert «Pathways i kreft», «MAPK signal», «Endocytose», «Insulin signalering» og «Wnt signal».
Blant disse banene, vi fokusert på «Pathways i Kreft» på grunn av sin direkte relevans. Ifølge vår hypotese, målgener av
MIR-195/497
bør oppregulert i kreftceller. Når vi undersøkte uttrykk nivåer av 104 gener i «Pathways i kreft» gruppen ble 27 gener oppregulert i BC kliniske prøver, noe som tyder på at disse genene var kandidat
MIR-195/497
mål og fungerte som onkogener i BC. For å bekrefte påliteligheten av våre
i silico
analyse av mulige målgener, vi sjekket om
BIRC5 Hotell og
WNT7A
gener ble faktisk regulert av
speil 195/497
klyngen i BC. Våre data viser at
BIRC5 Hotell og
WNT7A
var direkte regulert av
MIR-195/497
klyngen i BC.
BIRC5
er medlem av inhibitor av apoptose (IAP) familie fortrinnsvis uttrykt av mange kreftformer inkludert BC [46]. Det kan måles i urinen ved mRNA og proteinnivåer, og urin
BIRC5
ble rapportert som et diagnostisk biomarkør for BC [47]. Nyere studier fra andre grupper har vist at flere microRNAs som
MIR-542-3p
,
MIR-218
,
MIR-708 Hotell og
MIR-203
direkte hemmet
BIRC5
uttrykk i ulike typer kreft [48]. Vår studie er den første til å foreslå at
BIRC5
kan bli regulert av
MIR-195/497
klyngen i BC celler. Derfor vår strategi med å identifisere nye tumor-undertrykkende, miRNA-regulert molekylære mål /stier i BC er en effektiv metode for miRNA-kreftforskning.
Konklusjoner
I sammendraget, konstruerte vi miRNA uttrykket signaturer av kliniske BC prøver ved hjelp av dyp sekvensering som en gullstandard metode. Totalt 60 miRNAs ble betydelig redusert i BC prøver. Vi identifiserte flere downregulated mirnas som ble plassert i samme genomisk region utgjør en miRNA klynge, inkludert
MIR-1 /133a
,
MIR-143/145
,
MIR-99a /la-7c
,
MIR-195/497 og MIR-144 /451A
. Nedregulering av
MIR-195/497
klynge var en hyppig hendelse i BC kliniske prøver. Restaurering av disse miRNAs betydelig hemmet kreft celle spredning, migrasjon og invasjon, noe som tyder på at
MIR-195/497
funksjon som tumor suppressors i BC. Vår analyse av
MIR-195/497
klynge antydet at det regulerte antatte kreft trasé og onkogene gener. Disse funnene vil bidra til analysen av BC onkogenese. Identifikasjon av svulsten-undertrykkende
MIR-195/497
klynge i menneskelig BC kunne gi ny informasjon om potensielle terapeutiske mål i behandling av BC.
Materialer og metoder
kliniske prøver og cellekultur
Vevsprøver for miRNA screening ved hjelp av dyp sekvensering ble oppnådd fra fem BC pasienter og fem NBEs. BC pasienter hadde gjennomgått cystektomi eller transuretral reseksjon av blæren svulster (TUR-BT) ved Kagoshima universitetssykehus mellom 2003 og 2010. Fem NBEs ble avledet fra pasienter med ikke-BC sykdommer. Ingen forurensning av kreftcellene ble oppdaget av patologer. En annen serie av 29 Bachelor og 20 NBEs ble hentet fra Kagoshima universitetssykehus mellom 2003 og 2010. Denne gruppen ble utsatt for real-time RT-PCR for å evaluere miRNA uttrykket nivåer. Prøvene ble iscenesatt i samsvar med tumor-node-metastaser klassifikasjonssystem av det amerikanske Joint Committee on Cancer /Union Internationale Contre le Cancer (UICC) og histologisk gradert [49]. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter og vår studie ble godkjent av bioetikkomité av Kagoshima University. Pasientenes bakgrunn og clinicopathological egenskaper er oppsummert i tabell 1 og 6.
Vi brukte to menneskelige BC cellelinjer: gutt, som ble etablert i vårt laboratorium fra en asiatisk mannlig pasient, 66 år gammel , som ble diagnostisert med stadium III BC med lungemetastaser; og, T24, som var invasiv og oppnådd fra American Type Culture Collection. Disse cellelinjene ble holdt i minimum essensielt medium (MEM) supplert med 10% føtalt bovint serum i en fuktet atmosfære av 5% CO
2 og 95% luft ved 37 ° C.
Tissue samling og RNA utvinning
Vevsprøver ble nedsenket i RNAlater (Qiagen, Valencia, CA, USA) og lagret ved -20 ° C til RNA ekstraksjon ble gjennomført. Total RNA, inkludert miRNA, ble hentet fra frosne friske vev ved hjelp av Mirvana ™ miRNA isolasjon kit (Ambion, Austin, TX, USA) etter produsentens protokoll. Integriteten til RNA ble sjekket med RNA 6000 Nano Assay Kit og en 2100 Bioanalyzer ™ (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA).
Små RNA bibliotek forberedelse og profilering av dyp sekvense
Totalt RNA fra fem Bachelor og fem NBEs ble utsatt for dyp sekvensering. Den eksperimentelle prosessen omfattet følgende trinn: små RNA isolering, cDNA bibliotek forberedelse, og sekvensering. Total RNA for hver prøve ble størrelses-fraksjonert på en 15% PAGE-gel, og en 18-30 nukleotid-fraksjon ble samlet opp. 5′-RNA-adapter ble ligert til RNA med T4-RNA-ligase. Ligert RNA ble størrelses-fraksjonert, og 36-50 nukleotid-fraksjonen ble skåret ut. 3′-RNA-adapter ble deretter ligert til det utfelte RNA ved anvendelse av T4 RNA-ligase. Ligert RNA ble størrelses-fraksjonert, og fraksjonen 62-75 nukleotid (liten RNA + adaptere) ble skåret ut. Tabell S1. Tabell S2. Tabell S3. Tabell S4. Tabell S5.
