Abstract
Phyllanthus watsonii
Airy Shaw er en endemisk plante funnet i Peninsular Malaysia. Selv om det er mange rapporter om anti kreft egenskaper av andre
Phyllanthus
arter, publisert informasjon om cytotoksisitet av
P. watsonii
er svært begrenset. Denne studien ble gjennomført med bioassay-guidet fraksjone tilnærming for å vurdere cytotoksisitet og apoptoseinduksjon evnen til
P. watsonii
ekstrakter og fraksjoner på menneskers gynekologisk (Skov-3 og Ca Ski) og kolon (HT-29) kreftceller.
P. watsonii
ekstrakter utstilt sterk cytotoksisitet på alle kreftceller studert med IC
50 verdier av ≤ 20,0 mg /ml. Heksan ekstrakt av
P. watsonii
ble ytterligere utsatt for bioassay-guidet fraksjonering og ga 10 fraksjoner (PW-en → PW-10). PW-4 → PW-8 portrettert sterkere cytotoksisk aktivitet og ble ytterligere utsatt for bioassay-guidet fraksjonering og resulterte med 8 sub-fraksjoner (PPWH-1 → PPWH-8). PPWH-7 besatt størst cytotoksisitet (IC
50-verdiene i området 0,66 til 0,83 ug /ml) og ble selektivt på kreftcellene ble studert. LC-MS /MS-analyse av PPWH-7 viste nærvær av ellaginsyre, geranic syre, glochidone, betulin, phyllanthin og sterol glukosid. Merkede morfologiske endringer, stige-lignende utseende av DNA og tilvekst i caspase-3-aktivitet indikerer apoptose ble klart observert i både menneskelige gynekologiske og tykktarm kreft celler behandlet med
P. watsonii
spesielt med PPWH-7. Studien viste også at
P. watsonii
ekstrakter arrestert cellesyklus ved forskjellige vekstfaser i Skov-3, Ca Ski og HT-29 celler. Cytotoksiske og apoptotisk potensialet i endemisk
P. watsonii
ble undersøkt for første gang av bioassay styrt tilnærming. Resultatene viste at
P. watsonii
selektivt hemmer veksten av SKOV-3, Ca ski og HT-29 celler ved apoptose-induksjon og cellesyklusmodulering. Derfor
P. watsonii
har potensial til å bli ytterligere utnyttes for oppdagelsen og utviklingen av nye anti kreft narkotika
Citation. Ramasamy S, Abdul Wahab N, Zainal Abidin N, Manickam S, Zakaria Z (2012) Vekst hemming av menneskelig gynekologisk og Colon kreft celler med
Phyllanthus watsonii
gjennom apoptoseinduksjon. PLoS ONE 7 (4): e34793. doi: 10,1371 /journal.pone.0034793
Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 08.09.2011; Godkjent: 08.03.2012; Publisert: 20 april 2012
Copyright: © 2012 Ramasamy et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Postgraduate Research Fund (PPP) Grants UM 524 PS130 /2008a og UM PS307 /2010A, finansiert av Universitetet i Malaya. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
det er en lang historie i bruk av planter i Sørøst-asiatiske land, noen som har vist seg å ha interessante biologiske aktiviteter med potensielle terapeutiske anvendelser [1]. Bruken av planter som medisin har resultert i isolering og karakterisering av farmakologisk aktive forbindelser [2] og i dag er det minst 120 forskjellige kjemiske stoffer som stammer fra planter som anses som viktige legemidler og aktive ingredienser i den farmasøytiske industri [3].
Kreft er en av de viktigste årsakene til dødsfall i både industriland og utviklingsland, og fortsetter å være et stort folkehelseproblem i mange deler av verden [4]. Mye arbeid har blitt gjort for å utvikle ulike tilnærminger for å redusere trusselen forårsaket av kreft og bare beskjeden fremgang har blitt gjort for å redusere sykelighet og dødelighet av denne forferdelige sykdommen [5]. Ifølge verden kreft rapport utgitt av International Agency for Research on Cancer, globalt var det 12,4 millioner nye krefttilfeller i 2008 (6672000 hos menn og 5.779.000 kvinner) og 7,6 millioner dødsfall fra kreft (4293000 hos menn og 3.300.000 kvinner) [6]. I dag har kreftbehandling ved kjemoterapi, kirurgi og strålebehandling ikke er helt effektiv mot den høye forekomsten eller lav overlevelse av kreft [7]. Letingen etter nye anti kreft agenter fra planteriket er en av de realistiske og lovende tilnærminger innen kreft chemoprevention og dette førte til oppdagelsen av mange nye anti kreft narkotika, inkludert vinkaalkaloider, vinblastin og vinkristin, taxol, camptotheciner, og podophyllotoxins [8]. Tilnærminger har også blitt tatt til å oppdage anti kreft agenter fra tropiske planter [2] som alternative kreft behandlinger på grunn av deres lave toksisitet og kostnader [9].
I løpet av de siste tiårene, mange studier har indikert at mekanismen handling av mange anti kreftlegemidler er basert på apoptoseinduksjon, og dermed åpne en ny strategi i søke av anti kreft narkotika [10]. En apoptotisk induksjon er en meget ønskelig egenskap ved behandling strategi for kontroll av kreft, er det derfor viktig å screene apoptotiske induse fra planter, enten i form av råekstrakter eller som komponent forbindelsene [11]. Slike studier må gjøres ved å vurdere cytotoksisitet og apoptotisk induksjon i kreftcellelinjer før hele dyreforsøk eller kliniske studier ble utført.
Phyllanthus watsonii
Airy Shaw er en liten busk voksende til ca 1 m høy og tilhører familien phyllanthaceae (figur 1). Arten er en smal endemisk, og er bare kjent for å oppstå fra Nord Johor til sørlig Pahang (to stater i Peninsular Malaysia) ved bredden av Endau River [1], [12]. En rekke studier har vist at ekstrakter og forbindelser avledet fra andre
Phyllanthus
art kan undertrykke veksten av forskjellige krefttyper, inkludert cervical [13]; leveren [14], lunge [15], makrofager [16], livmor, mage [17], brystkreft og tykktarmskreft [18]. Men det var ingen detaljert studie utført for å evaluere den cytotoksiske og apoptotiske virkninger av
P. watsonii
på humane kreftcellelinjer, med unntak av en rapport som viser effekten av den vandige og metanol ekstrakt av
P. watsonii
mot MeWo huden melanom celler og PC-tre prostatakreftceller [19]. Phytochemistry studier viste tilstedeværelsen av to nye umettede nor-triterpener (26-nor-D: A-friedoolean-14-en-3-on og 26-nor-D: A-friedoolean-14-en-3beta-ol), lupenyl palmitate, friedelin, epifriedelanol, glochidone, glochidonol, lupeol, LUP-20 (29) -en-1 beta, 3 beta-diol, sitosterol og sitosterol-beta- (D) -glucoside i
P. watsonii product: [20].
Denne studien ble utført for å evaluere den cytotoksiske potensialet i metanol, heksan og etylacetat ekstrakter av
P. watsonii
mot menneske gynekologisk og tykktarm kreft cellelinjer. MRC-5, en normal human lunge fibroblast-cellelinje ble også anvendt for å bestemme spesifisiteten av ekstraktene for kreftceller. MRC-5-celler har blitt brukt som en kontroll i mange lignende studier [21] – [23]. Bioassay-guidet fraksjonering ble også utført for å bestemme de bioaktive sekundære metabolitter med cytotoksiske egenskaper. Så vidt vi vet, vil dette være første gang en slik ekstrakter og fraksjoner fra
P. watsonii
blir testet mot disse cellelinjene. I tillegg apoptotiske prosessen forbundet med celle effekt i disse cellene ble også undersøkt.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle nødvendige tillatelser og tillatelse til innsamling av materialer var innhentet for de beskrevne feltstudier og partiet er involvert er behørig anerkjent. Arten (
Phyllanthus watsonii
) ligger i Endau Rompin nasjonalpark som tilhører staten regjeringen i Johor og administreres av Johor National Parks Corporation (JNPC), Malaysia. Arten er ikke truet og habitat er ikke truet, og det er heller ikke oppført i vedlegg av CITES (Konvensjonen om internasjonal handel med truede arter av vill flora og fauna).
Plant Materialer
bladene av
Phyllanthus watsonii
ble samlet inn fra Endau Rompin nasjonalpark, Johor (Peninsular Malaysia) i juni 2008. autentisering av
P. watsonii
ble utført i herbariet av Rimba Ilmu Botanisk hage, Institute of Biological Sciences, University of Malaya og en kupong materiale (Ref. nr KLU46068) for denne studien ble avsatt på samme herbarium.
Utarbeidelse av ekstrakter fra
P. watsonii
De tørkede blader av
P. watsonii
(PW) (2 kg) ble malt og ekstrahert med metanol (MeOH) (Fisher Scientific, UK) (6 L x 3 ganger) ved romtemperatur i 72 timer og filtrert gjennom Whatman nummer 1 filterpapir (Whatman , England). MeOH Filtratet ble oppsamlet og overskudd av løsningsmiddel ble fordampet under redusert trykk under anvendelse av en rotasjonsfordamper (Buchi, Sveits) ved 40 ° C til tørrhet for å produsere 160,3 g mørk grønnaktig-MeOH ekstrakt (PW-M). En del av MeOH ekstrakt ble reservert for analysen, mens den gjenværende del ble ytterligere ristet kraftig med heksan (Fisher Scientific, UK) inntil det resulterende heksan ble nesten fargeløs. Den heksanoppløselige Løsningen ble filtrert og slått sammen, etterfulgt av konsentrering under redusert trykk med en rotasjonsfordamper for å gi 6,5 g heksan-ekstrakt (PW-H). Den gjenværende heksan uløselige ble underkastet oppløsningsmiddel-oppløsningsmiddel ekstraksjon med en blanding av etylacetat (EtOAc) (Fisher Scientific, UK) og destillert vann (01:01, v /v), etterfulgt av forholdsvis kraftig blanding. Denne blandingen ble deretter suksessivt fraksjonert ved anvendelse av en skilletrakt hvor to distinkte lag dannet. Bunnlaget (vannlaget) ble kastet, mens EtOAc-fasen (øvre sjikt) ble sluppet inn i et rent beger. Dette filtratet ble konsentrert under redusert trykk under anvendelse av en rotasjonsfordamper for å gi 9,7 g av EtOAc-ekstraktet (PW-E). I alle forsøkene ble ekstraktene oppløst i dimetylsulfoksyd (DMSO) (Sigma) som stamløsning og lagret ved -20 ° C. Før analyse ble den endelige konsentrasjon av hver prøve fremstilles ved å fortynne stamløsning i 10% DMSO. Sluttkonsentrasjonen av DMSO i cellekulturen var mindre enn 0,5%. PW-M, PW-H og PW-E av
P. watsonii
ble videre underkastet nøytral rød opptaksanalyse i henhold til prosedyrene beskrevet senere. PW-H ble funnet å vise sterkest cytotoksisitet sammenlignet med PW-M og PW-E og garantert videre etterforskning.
Bioassay styrt Fraksjonering av PW-H
cytotoksisk aktive brøkdel av PW -H (6,1 g) ble kromatografert på en kolonne (4 cm iD x 40 cm lengde), pakket med silikagel 60 F254, 0,25 mm tykkelse (Merck, Darmstadt, Tyskland) (160 g). Gradient eluering trinn startet med 100% heksan og polaritet av eluerings-løsningsmiddel ble gradvis økt ved hjelp av aceton (Me
2CO) (Fisher Scientific, UK) og MeOH. Utvasking av 25 ml volum ble oppsamlet i nummererte ampuller. Separasjonen av hver eluent ble overvåket på pre-coated tynnsjiktskromatografi (TLC) silikagel 60 F254 plate ved anvendelse av n-heksan /aceton (20:80, volum /volum) som et utviklende løsningsmiddel og det TLC sonene ble detektert etter sprøyting
p
-anisaldehyde reagent og oppvarming ved 105 ° C i 5-10 min. Elueringsmidlene ble oppsamlet i henhold til likheten i den kjemiske sammensetningen detektert ved TLC og overskudd løsemiddel ble fordampet under redusert trykk under anvendelse av en rotasjonsfordamper for å gi et totalt 10 fraksjoner betegnet som PWH-1, PWH-2, PWH-3, … …., PWH-8, PWH-9 * og PWH-10 * (figur 2). Fraksjoner PWH-9 * og PWH-10 * ble funnet å inneholde silicagel og ble ytterligere oppløst i kloroform og filtrert gjennom Whatman nummer 1 filterpapir (Whatman, England) for å fjerne silika. Fraksjoner PWH-9 og PWH-10 ble oppnådd etter fjerning av overskudd av løsningsmiddel ved fordampning til tørrhet ved 40 ° C under redusert trykk i en rotasjonsfordamper. Alle fraksjoner ble videre underkastet nøytral rød opptaksanalyse (prosedyrer beskrevet senere), og fraksjoner PWH-4, … .., PWH-8 avslørt som de mest aktive fraksjoner i cytotoksisk aktivitet.
Disse fraksjonene (PWH-4, … .., PWH-8) (581,0 mg) ble slått sammen og ytterligere renset med silikagelkolonne-kromatografi (2,6 cm iD x 60 cm lengde), pakket med silikagel 60 F254, 0,25 mm tykkelse (Merck, Darmstadt, Tyskland) (160 g). Eluering begynte med 100% heksan og polaritet av elueringsmiddel ble gradvis økt hjelp meg
2CO og MeOH. Utvasking av 25 ml volum ble oppsamlet i nummererte ampuller. Separasjonen av hver eluent ble overvåket på pre-coated tynnsjiktskromatografi (TLC) silikagel 60 F254 plate ved anvendelse av n-heksan /aceton (20:80, v /v) som fremkallende løsningsmiddel og ble påvist TLC sonene etter sprøyting med
p
-anisaldehyde reagent og oppvarming ved 105 ° C i 5-10 min. Elueringsmidlene ble oppsamlet i henhold til likheten i den kjemiske sammensetningen detektert ved TLC og overskudd løsemiddel ble fordampet under redusert trykk under anvendelse av en rotasjonsfordamper for å gi et totalt 8 sub-fraksjoner betegnet som PPWH-1, PPWH-2, … .. , PPWH-8. Under fraksjoner ble underkastet nøytral rød opptaksanalyse som beskrevet senere. Den løsningsmiddelsystem profil og utbyttet av hver fraksjoner og underfraksjoner som ble oppnådd er oppsummert i tabell 1.
Deretter cytotoksisk aktive ekstrakter (PW-M, PW-H og PW-E) og mest aktiv sub-fraksjonen (PPWH-7) ble valgt ut og videre evaluert for sin apoptotisk effekt mot gynekologiske og tykktarm kreft cellelinjer.
LCMS-MS analyse
Den mest aktive sub-fraksjon, PPWH-7 ble analysert ved LC-MS /MS-system utstyrt med 3200 QTrap massespektrometer (Applied Biosystem, Darmstadt, Tyskland) og Shidmazu UHPLC system. Den kromatografiske separasjon ble utført på en 50 mm x 2,0 mm x 5 uM Aqua C18-kolonne (Phenomenex, Torrance, CA), eluert med en mobil fase bestående av vann (A) og acetonitril (B) inneholdende 0,2% maursyre og 2 mM ammoniumformiat. En gradient eluering (ved å starte fra 10% av A til 90% av B, fra 0,01 min til 10,0 min, hold 2 min, og tilbake til 10% av A i 0,1 min og re-ekvilibrert i 5 min) ble anvendt for å separere forbindelser av interesse før massespektralanalyse. Massespektrometer-analyse ble utført i en positiv ion-modus (
m /z
M + H
+) for påvisning av sekundære forbindelser. Identiteter for forbindelsene ble oppnådd ved å sammenligne deres molekylære ioner (
m /z
) oppnådd ved LC-MS /MS med referansestandarder der det er tilgjengelig og ved korrelasjon med tidligere publiserte data for kjemiske bestanddeler fra
Phyllanthus
[24] – [30]
Cell Culture
De humane cellelinjer Skov-3 (ovarialcancer cellelinje), Ca Ski (epidermal karsinom i cervix cellelinje), HT. -29 (colon cancer cellelinje) og MRC-5 (normal lunge fibroblast cellelinje) ble anskaffet fra American Type Culture Collection (ATCC), USA. SKOV-3-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) (Sigma, UK), mens HT-29, Ca ski og MRC-5-celler ble dyrket i RPMI 1640 medium (Sigma, UK) og DMEM-medium (Sigma, UK ), respektivt. Alle media ble supplert med 10% (v /v) føtalt bovint serum (FBS) (PAA Lab., Østerrike), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (PAA Lab., Østerrike) og cellene inkuberes ved 37 ° C med 5% CO
2 i en fuktig atmosfære (Shel Lab., USA).
Nøytral Red Opptak (NSE) Analyse
Den cytotoksisitet av
P. watsonii
ekstrakter, fraksjoner og sub-fraksjoner ble målt ved Neutral Red opptak (NRU) assay som var basert på opptak og påfølgende lysosomal akkumulering av supravital fargestoff, nøytralt rødt i de levedyktige og uskadde celler. Kvantifisering av fargestoff utvunnet fra cellene har vist seg å være lineær med celletall, både ved direkte celletall og ved protein bestemmelse av cellepopulasjonen [31]. Celler ble sådd i en 96-brønn mikro-titer-plate (Nunc, Danmark) ved en konsentrasjon på 30.000 celler /ml og plassert i en CO
2 inkubator ved 37 ° C for å la cellene få feste seg før tilsetning av ekstraktene , fraksjoner og under fraksjoner av
P. watsonii
. Etter 3 timer ble cellene behandlet med ekstrakter og fraksjoner av
P. watsonii
på seks ulike konsentrasjoner dvs. 1, 10, 25, 50, 75 og 100 ug /ml og inkubert i 72 timer. Brønner inneholdende ubehandlede celler (uten tilsetning av noe ekstrakt) ble betraktet som en negativ kontroll, mens celler behandlet med doksorubicin (0,5-10 ug /ml) tjente som en positiv kontroll. Ved slutten av inkubasjonsperioden, ble mediet erstattet med medium inneholdende 50 mikrogram /ml nøytral rød (NR) løsning (50 ug /ml NR i dyrkningsmedier, 24 timer pre-inkubert i mørke ved romtemperatur og deretter sentrifuger ved 1500 g i 10 min før bruk) og inkubert i ytterligere 3 timer for å tillate opptak av den vitale fargestoff inn i lysosomene i levedyktige og uskadde celler. Mediet ble deretter fjernet, og cellene ble hurtig vasket med kalsiumklorid-formaldehyd-blandingen. Fargestoffet i levedyktige celler ble eluert fra cellene med en blanding av eddiksyre, etanol og vann (01:50: 49) (0,2 ml). Platene ble ristet på en mikro- titer platerister (LT Biomaks 500) i 30 min og deretter absorbans mot en blank referanse ble målt ved 540 nm ved anvendelse av en mikroplateleser (Emax, Molecular Devices, USA).
NR opptak, proporsjonal med antall levedyktige celler i brønnen, ble uttrykt som en prosentandel av opptak i kontrollceller [(OD
kontroll – OD
prøve) /(OD
kontroll) x 100%] . IC
50-verdier (konsentrasjon som er nødvendig for å redusere celler levedyktighet med 50% sammenlignet med kontrollceller) for hvert ekstrakt ble ekstrapolert fra grafene plottet ved hjelp av OD-verdiene som ble oppnådd. For å undersøke hvorvidt den cytotoksiske aktivitet var spesifikk for kreftcellene, ble den cytotoksiske aktiviteten av ekstraktene, fraksjoner og sub-fraksjon testet og selektiviteten indeksen (SI) av aktiv ekstrakt ble bestemt. Selektiviteten indeks (SI) av ekstraktene er definert som forholdet mellom cytotoksisitet (IC
50-verdier) på normal lunge fibroblast (MRC-5) celler til kreftceller (SKOV-3, Ca Ski og HT-29). (SI = IC
50 på MRC-5 celler /IC
50 på kreftceller). Prøver med en SI større enn 3 ble vurdert til å ha høy selektivitet mot kreftceller [32].
Påvisning av apoptose
Morfologisk vurdering av apoptotiske celler ved fasekontrast invertert mikroskop.
celler (3 x 10
4 celler /ml) ble inkubert i 24 timer i fravær eller nærvær av PW-M, PW-H og PW-E i
P. watsonii
og sub-fraksjon PPWH-7 ved konsentrasjoner på 10,0 ug /ml i 24-brønners vevskulturplater. Ved slutten av inkuberingsperioden ble mediet fjernet og cellene ble vasket en gang med en fosfatbuffersaltløsning (PBS, pH 7,4) og observert under et Leica DMI 3000B fasekontrast invertert mikroskop (Leica Micro, Tyskland) ved 200 x forstørrelse og fotografert.
Morfologisk vurdering av apoptotiske celler ved acridinoransje (AO) -ethidium bromide (EB) dobbel farging.
Cell morfologiske endringer ble vurdert ved differensialfarging bruk av DNA-intercalate fluorescerende fargestoffer, acridine oransje (AO) og etidiumbromid (EB). Celler (3 x 10
6 celler /ml) ble sådd ut i 24-brønners vevskulturplater, behandlet med PW-M, PW-H, og PW-E og PPWH-7 i en konsentrasjon på 10,0 ug /ml og inkubert i 24 timer. Ubehandlede celler ble anvendt som en negativ kontroll. Etter inkubering ble kontroll og behandlede celler pelletert og suspendert i 25 ul av PBS pH 7,4. Til hver prøve, 1 ul av AO /EB-løsning (1 del av 100 ug /ml av AO i PBS, 1 del av 100 ug /ml av EB i PBS) ble tilsatt før mikroskopisk undersøkelse. Cellesuspensjonen ble plassert på en 3-brønns teflonbelagt mikroskopiske objektglass, dekket med et glass dekkglass, og ble observert og fotografert med et Nikon Eclipse 80i (Nikon, NY) under fluorescens-belysning med trippelfiltre (FITC, Cy3 og DAPI) . Bilder ble analysert av Nikons Imaging Software, NIS-Elements (Nikon, New York).
DNA Fragmentering Analyse av agaroseelektroforese
Celler ble behandlet i nærvær eller fravær av PW-M, PW- H, PW-E og PPWH-7 (1,0, 10,0 og 100,0 pg /ml) i 48 timer, deretter høstet ved hjelp av 500 ul lyserer buffer [50 mM Tris-HCL (pH 8,0), 20 mM EDTA (pH 8,0), 1,43 ml av Tergitol
®-løsning type NP-40, og 20 ul SDS 10%] ved 65 ° C i 30 minutter på is. Etterfølgende trinn ble utført på is. 100 pl 8 M kaliumacetat ble tilsatt til de suspenderte blandinger og inkubert på is i 1 time. Supernatanten ble oppnådd ved sentrifugering av lysatet ved 10 000 x g i 10 min (Heraeus PICO 17, Thermo Scientific, USA) ble og de oppløselige proteinene ekstrahert med fenol /kloroform /isoamylalkohol (PCI, 25:24: 1, vol /vol /v) (Invitrogen Life Technologies). Til slutt ble DNA utfelt ved anvendelse av 2 x volum av iskald absolutt etanol. For å utføre DNA-fragmentering analysen, ble DNA-pelleten ble oppløst i 20 ul TE-buffer [10 mM Tris-HCl og 1 mM EDTA, pH 8,0] sammen med en pl RNase (10 ug /ml) og 1 pl proteinase K (100 ug /ml) og inkubert ved 37 ° C i 30 minutter. DNA-fragmentering ble analysert ved 1,5% agarosegelelektroforese. DNA-bånd ble observert og fotografert ved hjelp av en Gene Flash gel dokumentasjonssystem (Syngene Bioimaging, UK). Apoptoseinduksjon er indikert ved fremkomsten av DNA-fragmenter av stigen omtrent 180-200 bp multipler på agarosegel.
Caspase-3 Assay aktivitet
Aktivitet av caspase-3 ble bestemt ved anvendelse av caspase -3 /CPP32 koloanalysesett (Biovision, CA) i henhold til produsentens protokoll. Analysen er basert på spektrofotometrisk detektering av kromoforen,
p
-nitroanilide (
p hoteller, NA), etter at dens spalting fra det merkede substrat DEVD-
p hoteller, NA. Celler (2 x 10
6) ble pelletert og lysert etter behandling med 10 ug /ml av PW-M, PW-H, og PW-E i
P. watsonii
og sub-fraksjon PPWH-7 i 48 timer. Analyser ble utført på 96-brønners mikrotiterplater ved inkubering av 100 pg protein fra cellelysat per prøve i 50 pl av 2 x reaksjonsbuffer. Reaksjonsbufferen supplert med 10 mM DTT og substrater av 4 mM DEVD-pNA i et sluttvolum på totalt til 100 ul og inkubert ved 37 ° C i 1,5 timer. Dannelse av
p
-nitroanilide ble målt ved anvendelse av ELISA mikro-plateavleser ved en bølgelengde på 405 nm og kaspase-aktivitet ble uttrykt som prosentandel av enzymaktivitet sammenlignet med kontroll (ubehandlede celler).
Cell Cycle Analysis ved flowcytometri
for å sammenligne effekten av ekstrakt PW-H og sub-fraksjonen PPWH-7 på cellesyklusen, ble CycleTEST ™ PLUS DNA Reagent Kit (Becton Dickinson, USA) benyttet. Cellene (1 x 10
6 celler /ml) ble sådd ut i en 6-brønns plate og ble behandlet med 10 ug /ml av PW-H og sub-fraksjon PPWH-7. Etter 24 timer inkubering ble cellene høstet, brakt til suspensjon, permeabilisert med trypsin buffer. Den kjerne-DNA ble merket med propidiumjodid (PI) fargende oppløsning og inkubert i mørke mellom 2 ° til 8 ° C i 10 minutter. Cellesyklus fasefordeling av kjerne-DNA ble bestemt ved hjelp av strømningscytometri (Becton Dickinson FACS Calibur, USA) ved å analysere minst 10.000 celler per prøve. Prosentandelen av celler i G1, S og G2 faser ble analysert ved ModFit LT programvare (Verity Software House, Topsham, ME).
Statistiske analyser
Data ble presentert som gjennomsnitt ± standardavvik. Signifikante forskjeller ble bestemt ved hjelp av Student
t
-test der *
p
0.05 betegner en statistisk signifikant forskjell. Alle prøvene ble målt i tre paralleller.
Resultater
Cytotoksisitet av
P. watsonii
Ekstrakter-NSE analysen
I denne studien, de potensielle cytotoksiske effekter (IC
50) på
P. watsonii
ekstrakt i metanol (PW-M), heksan (PW-H) og etylacetat (PW-E), så vel som fraksjoner og underfraksjoner av PW-H ble undersøkt på to humane gynekologiske kreftceller (SKOV- 3 og Ca Ski), en tykktarmskreftceller (HT-29) og en normalceller (MRC-5) ved hjelp av NRU-analysen. Basert på amerikanske National Cancer Institute retningslinjer, er en rå ekstrakt generelt anses å ha
in vitro
cytotoksisk aktivitet hvis IC
50 verdi i carcinoma celler, etter inkubasjon mellom 48 og 72 timer, er ≤20 ug /ml, mens det for en ren forbindelse IC
50 verdi er ≤4 ug /mL [33] – [34]. Cytotoksisk aktivitet (IC
50) og selektivitet indeks av ekstraktene, brøker og underfraksjonene er oppsummert i tabell 2. I tillegg er doxorubicin, et vanlig brukt kjemoterapeutisk medikament for behandling av akutt leukemi, lymfomer og andre typer av fast tumorer så som bryst, lever og lunge-kreft [35], ble anvendt som en positiv kontroll i eksperimentene.
P. watsonii
ekstrakter viste størst cytotoksisk aktivitet på alle kreftceller testet hvor alle viste IC
50 verdiene 20 mikrogram /ml. De mest lovende og mest selektive cytotoksiske aktiviteter ble oppdaget i PW-H og PW-E. IC
50 (ug /ml) og SI verdier med PW-H på SKOV-3, Ca ski og HT-29-celler var 5,79 ± 0,29 (SI = 9,9), 6,94 ± 0,96 (SI = 8,3) og 11,79 ± 1,61 (SI = 4,9), henholdsvis. Mens verdiene med PW-E var 5,52 ± 0,50 (SI = 6,1), henholdsvis 3,58 ± 1,01 (SI = 9,4) og 5,14 ± 0,36 (SI = 6,6). PW-H ble valgt for bioanalysen styrt fraksjonering som viste den sterkeste cytotoksisk virkning på kreftceller og var den minst toksiske på normale celler sammenlignet med PW-M og PW-E. Disse kriteriene anses normalt å rettferdiggjøre ytterligere rensing av ekstraktet [36].
Bioassay styrt Fraksjone-NSE analysen
Kolonnekromatografi (CC) av PW-H ga totalt 10 fraksjoner. Fraksjoner på PW-H viste sterkere cytotoksisk aktivitet og høyere selektivitet sammenlignet med den PW-H særlig når testet på SKOV-3-celler (tabell 2). På SKOV-3-celler, fraksjonene PWH-4, PWH-5, PWH-6, PWH-7 og PWH-8 oppviste IC
50 verdier på 0,29 ± 0,06 (SI = 56,0), 0.18 ± 0.06 (SI = 68.1), 0.42 ± 0.12 (SI = 18.7), 0.77 ± 0.29 (SI = 10,4) og 0,36 ± 0,12 (SI = 23,0) ug /ml, respektivt. IC
50-verdier oppnås når Ca Ski og HT-29 celler ble behandlet med fraksjonene PWH-4 – PWH-8 var mellom området fra 2,77 til 13,19 og 1,21 til 10,78 mg /ml, respektivt. Fraksjonene PWH-4 til PWH-8 ble oppnådd fra midtpartiet av den silikakolonne (heksan /Me
2CO: 40:60 /50:50), og dette viser at nærværet av sterkt cytotoksiske forbindelser var ved mellom polaritet fase. Disse fraksjonene ble slått sammen og underkastet det andre trinn i bioanalysen styrte fraksjonering og ga 8 underfraksjoner. PPWH-7 var den mest cytotoksiske og oppviste høyere selektivitet (SI) på Ca Ski og HT-29-celler med IC
50 (ug /ml) og SI-verdier på 0,83 ± 0,00 (SI = 12,8) og 0,83 ± 0,10 ( SI = 12,8), henholdsvis (tabell 2). Tvert imot, rensede sub-fraksjon PPWH-7 viste nedre cytotoksiske og selektivitet effekt på SKOV-3-celler (IC
50 = 0,66 ± 0,06 ug /ml; SI = 15,5) sammenlignet med de fraksjonene PWH-4 (IC
50 = 0,29 ± 0,06 ug /ml; SI = 56,0), PWH-5 (IC
50 = 0,18 ± 0,06 ug /ml; SI = 68,1), PWH-6 (IC
50 = 0,42 ± 0,12 ug /ml; SI = 18,7) og PWH-8 (IC
50 = 0,36 ± 0,12 ug /ml; SI = 23,0). Det er verdt å nevne at PPWH-7 viste lignende cytotoksisk aktivitet som standard anticancer medikament, doxorubicin som ble anvendt som en positiv kontroll i denne studien. Men doxorubicin også utstilt høy giftighet på MRC-5 normale celler, mens PPWH-7 viste ca 6 ganger lavere toksisitet på MRC-5 normale celler.
LCMS /MS analyse
Under brøkdel PPWH -7 ble analysert ved LC-MS /MS-system og minst 15 forbindelser var tilstede i PPWH-7 hvorav 7 forbindelser med retensjonstider på hovedtoppene ble identifisert ved massespektrometri (tabell 3). Et eksempel på LC-MS /MS analyse som viser en positiv fullstendig spektra kromatogram av en av det detekterte forbindelsen (ellaginsyre i sub-fraksjon PPWH-7) i en positiv ion-modus (EPI-modus) er vist i figur 3. Den store topp med en retensjonstid på 13,99 minutter ble identifisert som metylesteren av geraiinic syre (MS
m /z
= 397), og kalium phyllanthin (MS
m /z
= 457). Phyllanthin ble også identifisert som natrium phyllanthin (MS
m /z
= 441) ved en retensjonstid på 11,66 min. En annen stor topp ble identifisert som sterol glucoside (MS
m /z
= 718), en isoprenoider på oppholdstid på 9,39 min. To triterpene ble eluert ved retensjonstid på 10,20 minutter og 13,45 minutter og ble identifisert som glochidone (MS
m /z
= 423) og betulin (MS
m /z
= 443), henholdsvis . En polyfenolforbindelsen identifisert som trimetyl- eteren av ellaginsyre (MS
m /z
= 345) ble eluert ved retensjonstid på 7,77 minutter (figur 4).
Peak tallene refererer til tabell 3.
Morfologisk Vurdering av apoptotiske celler ved fase-kontrast invertert mikroskop
Morfologisk observasjon av ubehandlet Skov-3, Ca Ski og HT-29 celler viste at kontrollceller opprettholdt sin opprinnelige morfologi som er cuboids og polygonal i sin form og var vedheftende til platene (figur 5). I motsetning til dette, SKOV-3, Ca Ski- og HT-29-celler som ble behandlet med PW-M, PW-H, og PW-E og PPWH-7 viste apoptotiske-lignende egenskaper som for eksempel krymping av celler, bleb formasjon og atom kromatin kondensasjon og aggregering i tette masser under kjernemembranen. Celler som gjennomgår apoptose resulterte også i andre typer av morfologiske forandringer som krymping av rundet opp cellene og mister kontakt med naboceller. Som et resultat av noen sensitive celler selv løsrevet fra overflaten av brønnplatene.
SKOV-3, Ca ski og HT-29-celler etter behandling med 10 ug /ml av PW-M, PW-H, PW-E og PPWH-7 i 24 timer. Piler indikerer dannelsen av (A) apoptotiske legemer; (B) kondenserte kjerner og (c) membranen blebbing som bevis for apoptose. Bildene er representant for en av tre lignende eksperimenter.
Morfologisk Vurdering av apoptotiske celler ved Acridine Orange (AO) -ethidium bromide (EB) Double Farging
De morfologiske endringer av SKOV -3, Ca Ski- og HT-29 celler ble behandlet med 10,0 pg /ml PW-M, PW-H, PW-E og PPWH-7 i 24 timer ble observert ved AO /EB farging og cellene ble klassifisert som lever ( normal), apoptotiske og nekrotiske (figur 6). Levende celler med intakt DNA og kjerne vil ha en runde og grønne kjerner.
