Abstract
nylig beskrevet transcriptomic bryter til en mitose program i kastrering resistent prostatakreft (CRPC) antyder at mitotiske proteiner kan rasjonelt rettet mot den dødelige stadium av sykdommen. I denne studien viste vi oppregulering av mitose-fase på proteinnivået i vår kohort av 51 kliniske CRPC saker og fant centrosomal avvik også skje gjenom CRPC sammenlignet med ubehandlet, høy Gleason grad hormonfølsom prostatakreft (
P
0,0001). Expression profilering av kjemoterapi-resistente CRPC prøver (n = 25) ble utført, og resultatene ble sammenlignet med data fra primær kjemoterapi-naive CRPC (n = 10) og hormonfølsom prostatakreft tilfeller (n = 108). Våre resultater viste anrikning av mitose-fase gener og gangstier, med progresjon til både kastrering-resistent og kjemoterapi-resistent sykdom. Den mitotiske cent-forbundet kinesin (MCAK) ble identifisert som en roman mitose-fase mål i prostatakreft som ble overuttrykt i flere CRPC gen-uttrykk datasett. Vi fant konkordant genuttrykk av MCAK mellom våre foreldre og murine CRPC xenograft par og økt MCAK protein uttrykk med klinisk progresjon av prostatakreft til en kastrering-resistent sykdom scenen. Knockdown av MCAK arrestert veksten av prostata kreft celler som tyder på sin nytteverdi som et potensielt terapeutisk mål
Citation. Sircar K, Huang H, Hu L, Liu Y, Dhillon J, Cogdell D, et al. (2012) Mitosis Fase Enrichment med Identifikasjon av Mitotisk cent-Associated kinesin Som et terapeutisk mål i Kastrering resistent prostatakreft. PLoS ONE 7 (2): e31259. doi: 10,1371 /journal.pone.0031259
Redaktør: Irina Agoulnik, Florida International University, USA
mottatt: 10 juli 2011; Godkjent: 04.01.2012; Publisert: 17 februar 2012
Copyright: © 2012 Sircar et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette papiret er støttet av institusjonelle midler fra MD Anderson Cancer Center (KS). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Ingen ekstra ekstern finansiering ble mottatt for denne studien
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er den nest største årsaken til. kreftspesifikk dødelighet i USA [1], med de fleste dødsfall som inntreffer etter svikt av androgen-deprivasjon terapi når svulsten vokser som kastrering resistent prostatakreft (CRPC), drepte pasienten innen en median periode på 18 måneder. Docetaxel-basert kjemoterapi har blitt etablert som standard vare i CRPC, med en liten, men klar overlevelsesgevinst [2], [3]. Identifisere mål for denne terminal kastrering-resistente og kjemoterapi-resistent fase av sykdommen representerer således et udekket behov i prostatakreft [4], [5].
Et viktig nytt fremskritt innen dette felt var demonstrasjonen at den androgen reseptoren aktiverer en distinkt mitose-fase transkripsjonell program i CRPC men ikke i hormonsensitiv prostatakreft (HSPC) [6], delvis forklarer den relative suksess av docetaxel, et anti-mitotisk kjemoterapeutisk middel som brukes til å behandle CRPC. Disse resultatene tyder også på at andre mitose-fase proteiner kan være potensielle mål for terapi behandling av denne fasen av sykdommen.
Vi søkte først å validere oppregulering av mitose-fase transkripsjonen program på proteinnivået i CRPC hjelp klinisk CRPC og høyverdig HSPC tilfeller. Deretter undersøkte man transcriptomic profiler av lokaliserte CRPC prøvene som ble kjemoterapi fast med CRPC kjemoterapi-naive tumorer og hormonfølsom prostatakreft. Pathway analyse av data fra våre egne prøver og offentlig tilgjengelige databaser identifiserte anrikning av mitose relaterte gener som sykdommen utviklet seg til både en kastrering-resistent og kjemoterapi bestandig scenen. Den mitotiske cent-forbundet kinesin (MCAK), hvis genekspresjon ble oppregulert i flere CRPC kjemoterapiresistent datasett, ble valgt for klinisk og funksjonell validering. MCAK protein uttrykk var assosiert med klinisk progresjon av prostatakreft, og dens knockdown arrestert veksten av prostata kreft celler.
Resultater
CRPC svulster viser augmented mitosestimulerende fase protein uttrykk og centrosomal avvik sammenlignet med høyverdig HSPC
for å validere den antatte transcriptomic bytte til en mitose-fase program i CRPC på proteinnivå, vi brukte atom phosphohistone H3 farging som en mitose-fase markør, som histoner er fosforylert ved utgangen av prophase og deres fosforylering topper ved meta [7]. Vi undersøkte kvantitativt vev-microarray deler av HSPC og CRPC med ARIOL bildeanalyse system. Våre vev arrays inkludert 557 kjerner og 250000 kjerner fra 75 kliniske tilfeller. Våre resultater viste signifikant oppregulering av phosphohistone H3 i kastrering-resistente prostatakarsinom sammenlignet med HSPC (Tall 1G-1i og tabell S2). Disse resultatene gir bevis for at mitose-fase proteiner er oppregulert i CRPC. Viktigere, høy grad av hormonfølsom svulster med Gleason graderinger av 4/5 viste også betydelig lavere phosphohistone H3 uttrykk enn kastrering-resistente svulster i adenokarsinom eller småcellet karsinom histologier (P 0.0001) (Tall 1G-1 J og Tabell S2) . Gitt de svært ulike transkripsjons profiler og langt mer aggressiv klinisk oppførsel av høy Gleason grad (Gleason karakterer 4/5) prostatakreft sammenlignet med lav Gleason-grade (Gleason grad 3) prostatakreft, understreker vår data særpreg CRPC fra alle histologiske subtyper av HSPC
Hematoxylin og eosin (H E). -stained snitt som viser kastrering-resistente adenocarcinoma (A), kastrering-resistente småcellet karsinom (B), og hormonsensitiv høy grad av prostata carcinoma ( C). Kastrering bestandig adenokarsinom immunfarget med gamma-tubulin (D) og p-histon H3 (G). Kastrering-resistente småcellet karsinom immunfarget med gamma-tubulin (E) og p-histon H3 (H). Hormon-sensitive høy klasse prostata carcinom immunostained med gamma tubulin (F) og p-histon H3 (I). Stjernene indikerer betydelig økt merking for mitose-fase markør p-histon H3 (J) og centrosomal markør gamma-tubulin (K) i kastrering-resistente prostata kreft sammenlignet med hormon-sensitive høy klasse prostata kreft.
i studere mitose fase, vi også undersøkt sentrosomen overflod, siden centrosomes er sentrale aktører i celledeling. Gamma tubulin, en microtubule kjernedannende og markør for sentrosomen forsterkning, viste signifikant økt cytoplasma merking i kastrering-resistent sykdom sammenlignet med HSPC (P 0,0001) og høy grad av HSPC (P = 0,008) (figur 1D-1F og 1K og tabell S3). Dette funnet er i tråd med den kjente rollen sentrosomen forsterkning og genetisk ustabilitet i utviklingen av andre kreftformer [8], [9], [10], [11].
oppregulering av den mitotiske apparatet i CRPC svulster med progresjon til kastrering motstand og kjemoterapi motstand
Vi macrodissected kreftceller som var kastrering-resistent og kjemoterapi bestandig fra lokaliserte ikke-metastatisk frosne kirurgiske prøver fra 20 unike pasienter og fem xenografter avledet av disse (Tabell S1). Transcriptomic profilering av totalt RNA ble utført på disse tumorprøver og fem godartet prostata prøvene som ble brukt til å normalisere vår ekspresjonsdata. Vårt utvalg rådata er sendt til GEO (GSE 33277). Som våre data ble utledet fra begge klemkastrerings-motstandsdyktig og docetaksel kjemoterapi-resistente tumorer, sammenlignet vi mRNA ekspresjon Profilen til disse prøvene som for prøver fra tidligere stadier av prostatakreft progresjon. Spesielt sammenlignet vi våre data til offentlig gen-uttrykk data fra ubehandlet HSPC (GSE 21032, n = 108) og kjemoterapi-naive CRPC (GSE 6811, n = 10). Slike meta-analyser er utfordrende med tanke på de mange variabler som kan påvirke intensiteten av hybridisering signal. For en mer pålitelig sammenligning vi spesielt valgte datasett med lokaliserte, ikke-metastatisk HSPC og kjemoterapi-naive CRPC prøvene som hadde blitt normalisert til data fra sammenslåtte benign prostata prøver eller hvor genet-uttrykk data fra godartede prostataprøver som tillot en slik normalisering ble gitt . Som forventet fant vi overekspresjon av mitose-fase gener og stier i forhold til ubehandlede HSPC prøver fra Memorial Sloan Kettering Cancer Center datasett (GSE 21032). Disse resultatene er i samsvar med tidligere rapporter [6] men bruker uavhengige datasett og metoder.
The University of Tokyo datasett (GSE 6811) er en av svært få som inkluderer CRPC kjemoterapi-naive prøver. Betydningen av microarray (SAM) analyse som sammenligner CRPC kjemoterapi-naive gruppe med vår CRPC kjemoterapi-resistente gruppe identifiserte to informative gensettene som besto av 2490 oppregulert og 2121 downregulated gener i kjemoterapi-resistente gruppe. Pathway analyse av disse to gensettene utført ved anvendelse av oppfinnsomhet svei Analyse viste at flere celle-syklusregulering banene ble vesentlig anriket på oppregulert genet settet (figur 2A). Spesielt, kjemoterapi-resistente gruppe oppviste betydelig overekspresjon av mitose-involverte reaksjonsveien (figur 2B), sammenlignet med kjemoterapi-naive gruppe (figur S1). Videre overlapper analyse av disse to gensettene, vurdert ved en geometriske distribusjonen modell (figur 2C) ved hjelp av mitose-fase (M-fase) gener oppnådd fra MSigDB database (https://www.broadinstitute.org/gsea/msigdb /index.jsp), viste en betydelig overlapp med bare de gener som ble oppregulert i kjemoterapi-resistente gruppe (n = 27;
P
= 5,0 x 10
-7). Genene nedregulert i kjemoterapi-resistente gruppe var ikke signifikant overlapper med M-fase gener (n = 9;
P
= 0,416). Denne observasjonen ble støttet av genet set-anrikning analyse (GSEA; https://www.broadinstitute.org/gsea/index.jsp, Version 3,7), noe som viste at M-fase-genet settet ble betydelig anriket på kjemoterapi-resistente gruppe på en falsk funnrate (FDR) av 10% (figur 2D). Disse analyser viser at mitose-assosierte gener og trasé kan være involvert i mediering av kjemoterapi motstand.
(A) Celle-syklusregulering veier er signifikant oppregulert i den CRPC kjemoterapi-resistente (TX)-gruppen sammenlignet med den CRPC kjemoterapi -naïve gruppe. (B) Oppfinnsomhet Pathway Analysis. (IPA) av oppregulert genet sett viser at den kanoniske vei av mitotiske roller polo-lignende kinase er signifikant assosiert med CRPC kjemoterapi-resistente gruppe (
P
= 0,004).
P
verdi er beregnet ved Fishers eksakte test. Genene som er oppregulert i CRPC kjemoterapi-resistente gruppe og er involvert i denne veien er fargekodet i rødt. De andre gener som er inkludert i denne veien, men er ikke i oppregulert genet sett er angitt i hvitt. (Se tekst for identifikasjon av upreguated genet satt i detaljer). (C) Betydelig overlapping av de oppregulert-genet satt inn CRPC kjemoterapi-resistente svulster med M-fase (n = 27,
P
= 5.00E-7) sammenlignet med den nedregulert gen sett (n = 9,
P
= 0,416). (D) GSEA indikerte at M-fase ble betydelig anriket på CRPC kjemoterapi-resistente gruppe på FDR. 10%
Mitotisk cent-forbundet kinesin er assosiert med progresjon til terapi motstand, mens stanse hemmer prostatakreft cellevekst
Undersøkelse av spesifikt endret mitotiske regulatorer i våre transcriptomic data ledet oss til å identifisere gener som koder for den mitotiske kinesin familie av motor proteiner som blir oppregulert i CRPC kjemoterapiresistent prøver. Disse mitotiske kinesins ble også oppregulert i to andre store CRPC kjemoterapiresistent datasett fra University of Michigan (GDS 1439) og Memorial Sloan Kettering Cancer Center (GSE 21032). Vi valgte den mitotiske cent-forbundet kinesin (MCAK) som et mål i prostatakreft fordi det var romanen, og det var markert overekspresjon av MCAK genet (
P
= 1,55 × 10
-15) i lokaliserte CRPC fra MD Anderson Cancer Center datasett i forhold til hormonfølsomme prostatakreft tilfeller (n = 108) fra Memorial Sloan Kettering Cancer Center datasett (GSE 21032). MCAK ble også oppregulert med progresjon til metastatisk CRPC innenfor Memorial Sloan-Kettering Cancer Center kohort (
P
= 3,73 × 10
-10) (figur S2). Videre fant vi konkordant uttrykk for MCAK i begge våre menneskelige foreldre CRPC svulster og murine xenografter avledet fra disse tumorer (
r
= 0,428) som vist i Figur S3. Vi måles deretter MCAK protein uttrykk ved immunhistokjemisk analyse av microarray av uavhengige hormon-sensitive (n = 38) og kastrering-resistente (n = 51) saker. Vi fant MCAK cytoplasmisk farging å bli signifikant assosiert med klinisk progresjon til kastrering-resistent sykdom (P 0,0001). (Figur 3A-D og tabell S4)
MCAK-immunostained deler av kastrering-resistente adenokarsinom (A) , kastrering-resistente småcellet karsinom (B), og hormonsensitiv prostatakarsinom (C). D) Betydelig økt merking for mitotisk cent-assosiert protein MCAK med progresjon til CRPC, angitt med stjerner.
For å fastslå effekten av å slå ned MCAK i HSPC og CRPC, brukte vi to forskjellige sett med small interfering RNA (siRNA) spesifikk for MCAK til taushet sitt uttrykk i hormon-sensitive LNCaP og kastreringsresistent kjemoterapi-naive C4-2B prostata kreft cellelinjer. Begge CRPC og HSPC cellelinjer viste rikelig iboende MCAK protein uttrykk og begge viste veksthemming etter 3 dager med MCAK knockdown med den første siRNA (SI-MCAK # 1) som vurderes av en MTT-analyse (figur 4A-D) (C4-2B : 3 d, P = 5,45 × 10
-7, 4 d, P = 4,85 × 10
-10, 5 d, P = 3,78 × 10
-8, LNCaP: 3 d, P = 1,43 × 10
-3, 4 d, P = 3,86 × 10
-5, 5 d, P = 1,48 × 10
-5). Lignende resultater fra det andre settet med siRNA (Si-MCAK # 2) er vist i figur S4.
A) Western blot som bekrefter knockdown av MCAK av Si-MCAK 1 #. Hel-cellelysater fra LNCaP-celler transfektert med Si-kontroll (C) eller si-MCAK # 1 (M) ble samlet ved forskjellige tidspunkter etter transfeksjon, som angitt. Tubulin ble brukt som kontroll lasting. B) MTT cellevekst analysen. LNCaP-celler ble behandlet på samme måte som i A), og etter en 24-timers transfeksjon, ble 4000-celler sådd ut i hver brønn av en 96-brønns plate (n = 10 for hver gruppe) og MTT-analysen ble utført i en 24 timers intervall. C) Western blot bekrefter knockdown av MCAK med SI-MCAK # 1. Hel-cellelysater fra C4-2B celler transfektert med Si-kontroll (C) eller si-MCAK # 1 (M) ble samlet ved forskjellige tidspunkter etter transfeksjon, som angitt. Tubulin ble brukt som kontroll lasting. D) MTT cellevekst analysen. C4-2B-celler ble transfektert med si-kontroll og si-MCAK # 1, respektivt. Etter en 24-timers transfeksjon, ble 4000-celler sådd i hver brønn i en 96-brønnplate og inkubert i forskjellige tidsperioder, som angitt, fulgt av MTT-analysen (n = 10 for hver gruppe).
Diskusjoner
i denne studien har vi utvidet resultatene av Wang et al [6] ved å validere, på proteinnivå, den transcriptomic bytte til en mitose program i et uavhengig sett med CRPC kliniske prøver og viser at forskjellene mellom kastrering motstandsdyktig og ubehandlet hormonfølsom prostatakreft blir opprettholdt selv når man sammenligner høye Gleason grad prostatakreft. Dette er et viktig funn gitt de ulike programmene transcriptomic sett i prostata cancer med lav og høy Gleason karakterer [12] som gjenspeiler deres dramatisk forskjellige kliniske oppførsel. Vi har også vist centrosomal avvik å skje gjenom CRPC, i tråd med unormal celledeling sett i andre avanserte kreftformer. Disse resultatene støtter ideen om at CRPC er biologisk distinkte og ikke bare en forlengelse av høy grad av hormonfølsom prostatakreft, til tross for deres histologiske likheter og tilbøyelighet for klinisk aggressivitet.
Ved å sammenligne transcriptomic profiler av CRPC kirurgiske prøver som var kjemoterapi-naive med våre CRPC kjemoterapi bestandig data, fant vi anrikning av mitotisk-fase proteiner og stier i kjemoterapiresistent svulster. Blant de mitose-relaterte gener, valgte vi det mitotiske kinesin familien av motor proteiner for ytterligere å studere-i særdeleshet MCAK, som ikke tidligere har vært studert i prostata kreft. Mitotiske kinesins er kjent for å spille en avgjørende rolle i å regulere den mitotiske spindel apparatet under celledeling. De er involvert i cellulær proliferasjon og er regulert av aurora kinase-B [13]. Progresjon av lunge, hjerne, og tykktarmskreft [14] [15] er forbundet med utvidet kinesin uttrykk, mens dens inhibering har ført til cellesyklus-stans i mitose fase [16], [17]. Mitotisk cent-forbundet kinesin er rikelig i centrosomes, depolymerizes mikrotubuli, og formidler overgangen fra prometafase til meta [18], blant andre viktige funksjoner knyttet til riktig kromosom segregering [19] under celledeling. Overekspresjon av mitotiske kinesins, som er postulert til å arbeide ved å motvirke den mikrotubul-stabiliserende virkning av taxan-kjemoterapi, har vært knyttet til docetaxel motstand i brystkreft [20], og MCAK overekspresjon er kausalt relatert til paclitaxel motstand [21].
målrette mitotiske kinesins er dermed fremstår som en attraktiv behandlingsform i kreft som ikke responderer på taxan-basert kjemoterapi som virker på den mitotiske spindel, siden hemming av kinesin motor proteiner ikke direkte rettet mot mikrotubuli. Videre er mitotiske kinesins ikke uttrykkes av nerveceller [22] og er dårlige substrater for P-glykoprotein-efflukspumpen [23], noe som resulterer i docetaxel er dosebegrensende neurotoksisitet og multimedikamentresistens. Derfor er mitotisk kinesin inhibering antatt å indusere mitose-spesifikke cellesyklus-stans som kan komplettere eksisterende kjemoterapeutiske protokoller med færre bivirkninger [18].
Ulike mitotiske kinesins tjene bestemte funksjoner, og rollen til disse proteinene i prostatakreft har bare blitt undersøkt med hensyn på den mest veletablerte medlem av denne familien, kinesin spindelprotein (KIF11 /EG5), hvis Slå har blitt vist å hemme veksten av LNCaP og PC3 cellelinjer
in vitro
og
in vivo product: [24], [25]. Tidlig-fase kliniske studier CRPC pasienter ved hjelp av første generasjon EG5 inhibitor, ispinesib, har møtt med begrenset suksess [26] [27]. Imidlertid har nyere generasjon EG5 hemmere er rapportert å vise større effekt
in vitro product: [28], og en tredje klinisk studie rekrutteringen pasienter fra en rekke kreftformer, blant annet kastrering resistent prostatakreft (# NCT01065025) .
i sammendraget har vi vist anrikning av mitose-fase trasé og proteiner som prostata kreft utvikler seg til både en kastrering-resistent og kjemoterapi bestandig tilstand. Vi har undersøkt rollen til MCAK for første gang i prostatakreft og viste at MCAK uttrykk korrelerer med klinisk utviklingen av sykdommen. Dessuten viste vi veksthemming i MCAK-forstummet kastreringsresistent prostatakreft cellelinjer. Sammen våre resultater tyder på at MCAK er et funksjonelt viktig protein i terminal prostatakreft. Oppfølging studier basert på denne rapporten bør omfatte bruk av syntetiske hemmere rettet mot MCAK (f.eks patent # 7294640, Merck) i prekliniske modeller og i fremtidige kliniske studier på prostatakreft.
Materialer og Metoder
Etikk uttalelse
hormon-sensitive og prøver prostata kreft vev kastreringsresistent ble oppnådd med godkjenning fra fra de institusjonelle gjennomgang styrene i The University of Texas MD Anderson Cancer Center (Houston, Texas) og McGill University (Montreal, QC, Canada). Vevsprøvene som brukes til å utvikle MDA PCa 79, MDA PCa 117-9, MDA PCa 124, MDA PCa 130, MDA PCa 149-1, og MDA PCa 180-30 xenotransplantater ble avledet fra tumorprøver av kirurgiske prøver (cystoprostatectomy, radikal prostatektomi eller bekken exenteration) av en progressiv primær kastrering resistent prostatakreft. Skriftlig informert samtykke var innhentet fra pasienter før prøven oppkjøpet, og prøver ble behandlet i henhold til en protokoll godkjent av MD Anderson Institutional Review Board, herunder godkjennelse fra dyr omsorg og bruk komité. De lab protokollnumre som dekket bruken av disse prøvene er MDACC LAB 03-0336 og LAB 09-0213.
Pasient vevsprøver
molekylært profilerte vev ble avledet fra MD Anderson frossen tumorprøver fra pasienter med kastrering-og kjemoterapi-motstandsdyktig prostatakreft (n = 20) og fra benign prostatisk vev kontroller (n = 5). Kastrering-resistente kjemoterapi bestandig prøver ble tatt fra berging cystoprostatectomies eller bekken exenterations. Murine xenografter avledet fra fem av disse 20 svulster som viser adenokarsinom histologi ble også vurdert. Kliniske data av genomisk profilerte prøver er inkludert i tabell S1. Fire microarray ble brukt til å validere genomiske data og besto av formalinfiksert parafin-embedded prøver fra 58 pasienter med HSPC og 51 pasienter med CRPC.
Expression profilering og analyse
Tumor mRNA uttrykk var vurdert ved hjelp av en menneskelig hel-genom oligonukleotid microarray kit fra Agilent (prod # G4112F) i henhold til produsentens protokoll og som beskrevet tidligere [29]. Våre CRPC data ble normalisert til gjennomsnitts gen-uttrykk verdier fra fem godartet prostata prøver å finne oppregulert eller nedregulert gener ved hjelp av en tømmerandel verdi 0,3 som cut-off for informative gener som finnes i mer enn to tredjedeler av tilfellene. Vi sammenlignet våre uttrykk profilering data til University of Michigan (GDS 1439), University of Tokyo (GSE 6811), og Memorial Sloan Kettering Cancer Center (GSE 21032) datasett. For disse datasettene, ble normalisering utført mot sine interne kontroller (godartet prøver).
Immunhistokjemisk analyse
Standard 3,3′-diaminobenzidin (DAB) immunhistokjemiske analyser av microarray ble utført med en Dako Autostainer Plus (Dako) ved hjelp av en mus anti-humant monoklonalt MCAK antistoff (Abgent AT2621a) på 1:50 fortynning, en fosfor-histoneH3 antistoff (Santa Cruz SC-8656) på 1:100 fortynning, og en gamma-tubulin antistoff (Abcam AB27074) ved 1:400 fortynning, som tidligere beskrevet [30]. Farging for gamma-tubulin og MCAK ble evaluert manuelt ved å tildele en prosent positiv verdi for hvert enkelt tilfelle basert på den samlede immunhistokjemiske merking av alle vev kjerner som tilhører den saken.
Automatisert bildeanalyse
phosphohistone H3-positive kjerner ble kvantitativt vurdert ved hjelp av automatisert bildeanalyse med ARIOL programvare fra Applied Imaging (Genetix Ltd.). En skreddersydd, automatisert atom kvantifisering algoritmen bruker ARIOL programvaren ble utarbeidet basert på fargevarianter av den brune flekken i DAB-positive celler versus negative atom hematoxylin bakgrunn for å oppnå en prosent positiv per forhåndsvalgt område av representasjon på hvert lysbilde .
Cell kultur
C4-2B celler deponert ved MD Anderson ble utviklet etter serie passering av LNCaP celler i kastrerte verter når cellene ikke lenger var lydhør overfor androgen manipulasjon i dyr (PMID: 8168083 ). LNCaP-celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Begge cellelinjer ble dyrket i RPMI1640 medium supplementert med 10% føtalt bovint serum ved 37 ° C med en atmosfære av 5% CO
2.
xenograft studier
vevsprøver som brukes til å utvikle MDA PCa 79, MDA PCa 117-9, MDA PCA 124, MDA PCA 130, og MDA PCA 149-1 xenografter var rest vev fra kirurgisk reseksjon (cystoprostatectomy eller bekken exenteration) av progressiv primære CRPC. Små tumorStykkene ble implantert i subkutane lommer av 6- til 8 uker gamle hann CB17 SCID mus (Charles River Laboratories). Svulster utviklet seg i løpet av 6 måneder og ble opprettholdt i mus, som cellene ikke kunne dyrkes
in vitro
. Passasjen og svulst bearbeidingsmetoder som ble brukt var de samme som rapportert tidligere (PMID: 18618013).
siRNA transfeksjon
LNCaP eller C4-2B celler ble sådd på en seks-brønns plate på en tetthet på 5 x 10
4 celler /brønn og dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% FBS i henhold vev dyrkningsbetingelser normale. Etter 20-24 timer inkubasjon, ble siRNA transfeksjon utført ved hjelp LipofectamineRNAiMax Reagens fra Invitrogen (Invitrogen, katt # 56532) ved å følge produsentens protokoll. To sett med si-MCAK siRNA ble anvendt for eksperimentene. si-MCAK # 1 ble kjøpt fra Ambion (Ambion, katt # 4390824) og si-MCAK # 2 ble kjøpt fra Dharmacon (Chicago, IL, USA, katt # L-004955-00). Universal Negativ kontroll # 1 siRNA fra Sigma (cat # SIC-001) ble anvendt som en kontroll. Sluttkonsentrasjonen av den siRNA var 50 nM.
Western blot-analyse
MCAK monoklonalt antistoff ble oppnådd fra Abgent (cat # AT2621a) og begge β-aktin (cat # sc-1616) og β-tubulin (cat # sc-9104) ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA, USA). Western blotting ble utført som beskrevet [31]. Kort fortalt ble celleekstrakter som inneholder 30 mikrogram av protein løst med 10% SDS-PAGE elektroforese, overført til Hybond ECL nitrocellulosemembraner (Amersham Pharmacia Biotech) eller polyvinylidenfluorid membraner (Cat # IPVH20200) fra Millipore (Millipore Corporation, kat. # IPVH20200) , blokkert i 5% fettfri melk i 1 x Tris-bufret saltvann plus 0,05% tween-20 (pH 8,0) og probet med primære antistoffer med konsentrasjoner på 1:1000 for MCAK og 1:2500 for β-aktin eller β-tubulin. De sekundære antistoffer ble benyttet i konsentrasjoner på 1:10,000. Proteinene ble visualisert ved hjelp av SuperSignal West Pico kjemiluminescenssubstrat (Prod # 34708) eller SuperSignal West Femto maksimal følsomhet Substrat (Prod # 34096) fra Pierce (Pierce Chemical, Rockford, IL, USA).
celleproliferasjon analyser
Celleproliferering ble bestemt av en MTT absorbans analyse. De celler transfektert med enten kontroll siRNA (Si-kontroll) eller MCAK siRNA (Si-MCAK) ble trypsinert fra skålene ved 24 timer etter transfeksjon og 4000 celler i 200 pl komplett medium ble sådd i hver brønn av en 96-brønns plate ( n = 10). Cellene fikk feste seg i 24 timer i komplett medium, og MTT-analysen ble utført ved 24 timers intervaller etterpå. Etter 2,5 timers inkubering med 50 uM MTT-reagens i celledyrkningsbetingelser normale, ble brønnene tømt ved vakuum aspirasjon, og 200 ul DMSO ble tilsatt til hver brønn. Absorbansen ble målt ved 590 nm med en mikroplateleser. (MRX; Danatech Laboratory)
Statistisk analyse
Data er uttrykt som gjennomsnitt +/- S.D. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av Student
t
-test og Wilcoxon rank-sum test. Forskjeller i middel ble evaluert ved hjelp av en to-tailed
t
-test, forutsatt ulike variasjoner. En P value≤0.05 ble ansett som statistisk signifikant.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
mitose veier er ikke forbundet med downregulated genet satt i CRPC kjemoterapi-resistent sykdom. Oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA) av downregulated genet sett viser at den kanoniske vei av mitotiske roller polo-lignende kinase ikke er signifikant assosiert med CRPC kjemoterapi-resistente gruppe (
P
= 0,16).
P
verdi er beregnet ved Fishers eksakte test. Genene som er nedregulert i CRPC kjemoterapi-resistente gruppe og er involvert i denne veien er fargekodet i grønt. De andre gener som er inkludert i denne veien, men er ikke inkludert i downregulated genet sett er angitt i hvitt
doi:. 10,1371 /journal.pone.0031259.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Økte MCAK transkripsjonsnivåer med progresjon til CRPC. (A) MCAK viser transcriptomic oppregulering i lokaliserte CRPC (
P
= 1,55 × 10
-15) og (B) metastatisk CRPC (
P
= 3,73 × 10
– 10) sammenlignet med HSPC
doi:. 10,1371 /journal.pone.0031259.s002 plakater (TIF)
Figur S3.
Concordance av MCAK genuttrykk mellom CRPC muse xenografter (MDA-79, MDA-117, MDA-130, MDA-149) og tilhørende menneskeordnede tumorer (
r
= 0,428).
doi: 10,1371 /journal.pone.0031259.s003 plakater (TIF)
Figur S4.
Vekst inhibering av LNCaP og C4-2B celler ved si-MCAK # 2. A) Western blot som bekrefter knockdown av MCAK av Si-MCAK # 2. Hel-cellelysater fra LNCAP celler transfektert med Si-kontroll (C) eller si-MCAK # 2 (M) ble samlet ved forskjellige tidspunkter etter transfeksjon, som angitt. Aktin ble anvendt som kontroll lasting. B) MTT cellevekst analyser. LNCaP-celler ble behandlet på samme måte som i A), og etter en 24 timers transfeksjon, ble 4000-celler sådd i hver brønn i en 96-brønns plate (n = 6 for hver gruppe) og etterfulgt av MTT-analyse. C) Western blot som bekrefter knockdown av MCAK med Si-MCAK # 2. Hel-cellelysater fra C4-2B celler transfektert med Si-kontroll (C) eller si-MCAK # 2 (M) ble samlet ved forskjellige tidspunkter etter transfeksjon, som angitt. Aktin ble anvendt som kontroll lasting. * Indikerer uspesifikke bånd. D) MTT cellevekst analyser. C4-2B-celler ble transfektert med si-kontroll og si-MCAK # 2, henholdsvis. Etter en 24 timers transfeksjon, ble 4000-celler sådd i hver brønn i en 96-brønnplate og inkubert i forskjellige tidsperioder, som angitt, fulgt av MTT-analysen (n = 5 i hver gruppe):
doi:. 10,1371 /journal.pone.0031259.s004 product: (TIF)
Tabell S1.
Forkortelser: CXPX – cystoprostatectomy; PE – bekken exenteration; TURP – transurethral reseksjon; TAB – total androgen blokade (Lupron + Casodex); LHRH – Lupron; Orch – bilateral orchiectomy; XRT – strålebehandling. * Småcellet karsinom komponenten ble profilert fra en blandet histologi liten celle /adenokarsinom tumor
doi:. 10,1371 /journal.pone.0031259.s005 plakater (DOC)
Tabell S2.
