Abstract
Bakgrunn
kreft stamcelle teori hypothesizes at kreften er foreviget av kreft stammen celler (CSC) eller tumor initiere celler (TIC) besittelse selvfornyelse og andre stamcelleliknende egenskaper samtidig differensierte ikke-stilk /initiere celler har en begrenset levetid. For å undersøke om hypotesen gjelder lungekreft, identifisering av lunge CSC og demonstrasjon av disse egenskapene er avgjørende.
Metodikk /Principal Finne
Uttrykket profiler av fem stamcellemarkører (CD34, CD44, CD133, BMI1 og OCT4) ble screenet ved flowcytometri i 10 lunge kreft cellelinjer. CD44 ble videre undersøkt ved å teste for
in vitro Hotell og
in vivo
tumorigenecity. Dannelse av sfæroide organer og
in vivo
startfasen evne ble demonstrert i CD44
+ celler av 4 cellelinjer. Seriell
in vivo
svulst transplantability i hårløse mus ble demonstrert ved hjelp H1299 cellelinje. Den primære xenografter initiert fra CD44
+ celler besto av blandet CD44
+ og CD44
– cellene i samme forholdet som foreldre H1299 cellelinje, som støtter
in vivo
differensiering. Semi-kvantitativ real-time PCR (RT-PCR) viste at begge ferske sortert CD44
+ og CD44
+ celler avledet fra CD44
+ – initiert svulster uttrykte pluripotency gener
OCT4 /POU5F1
,
Nanog
,
SOX2
. Disse stemness markører ble ikke uttrykt av CD44
– celler. Videre ferske sortert CD44
+ celler var mer motstandsdyktig mot cisplatin behandling med lavere apoptose nivåer enn CD44
– celler. Immunhistokjemisk analyse av 141 resekterte ikke-småcellet lungekreft viste tumorcelle-ekspresjon av CD44 på 50,4% av tumorene, mens ingen CD34, CD133 og ekspresjon ble observert i tumorceller. CD44 uttrykk var assosiert med plateepitelkarsinom men uventet ble det observert en lengre overlevelse i CD44-uttrykke adenokarsinomer.
Konklusjon /Betydning
Totalt våre resultater viste at stamcellelignende egenskaper er beriket i CD44-uttrykke subpopulasjoner av enkelte lungekreftcellelinjer. Videre undersøkelser er nødvendig for å avklare rollen til CD44 i tumorcellefornyelse og kreft forplantning i
in vivo
miljø
Citation. Leung EL-H, Fiscus RR, Tung JW, Tin VP -C, Cheng LC, Sihoe AD-L, et al. (2010) ikke-småcellet lungekreft celler som uttrykker CD44 er beriket for Stem Cell-lignende egenskaper. PLoS ONE 5 (11): e14062. doi: 10,1371 /journal.pone.0014062
Redaktør: Dong-Yan Jin, University of Hong Kong, Kina
mottatt: 5 mai 2010; Godkjent: 26 oktober 2010; Publisert: 19.11.2010
Copyright: © 2010 Leung et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en Seed Fund for Basic forskning (HKU 10400863 til MP Wong), et lite prosjekt stipend (HKU 200907176141 til EL Leung) og en oversjøisk forskerutdanning stipend fra Kina Medical Board, University of Hong Kong, tildelt EL Leung. Dette arbeidet ble også støttet delvis av National Institutes of Health Grants R01HL087948, National Cancer Institute Grant R21CA131522 (til Y. Ma). DOE Finansiering DOE-FG02-08ER64608 på Nevada Cancer Institute (L. M. Fink), en oppstart finansiering fra Nevada Cancer Institute og University of Southern Nevada (til R. R. Fiscus). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis. Den generelle Prognosen er dårlig med lav 5 års overlevelse på grunn av sen presentasjon, sykdom tilbakefall og mangel på kurativ systemisk terapi. Nylig, foreslår kreft stamceller (CSC) teori om at kreft blir vedlikeholdt av subpopulasjoner av kreftceller som besitter stilk eller stamcelleegenskaper. Disse cellene kan starte tumordannelse, differensiere langs flere veier potente og er forholdsvis resistente mot konvensjonell kjemoterapi [1]. CSC er vist i hematologiske og noen faste tumorer så som bryst, hjerne, tykktarm, lunge og lever-kreft [2], [3], [4], [5], [6]. Forskjellige stamcelle markører for normale vev har blitt brukt for CSC identifisering og isolasjon. For eksempel, er CD133 den hyppigst viste markør i kreft i leveren, hjerne, tykktarm og lunge, etc [3], [4], [5], [6]. Den CD44
+ /CD24
– /lav profil karakteriserer CSC i bryst og prostata kreft [7], [8]. Expression av de viktigste «stemness gener av embryonale (ES) og indusert pluripotent stamceller (iPS-celler) OCT4 og BMI1 [9], [10] har blitt funnet i CSC fra ulike kreftformer [11], [12].
Den markør profil lunge CSC gjenstår å bli utforsket. Nylige studier ved bruk av NSCLC-cellelinjer og frisk lunge tumorvev foreslår CD133 som lunge CSC markør [3], [11], [13], [14], [15], [16]. Biokjemiske studier viste at CD133 spiller en funksjonell rolle i cellesyklusregulering og formering, men ikke startfasen [17]. Studier av tykktarmskreft viste at CD133
+ celler har en høyere DNA innhold [18] og bli CD133
– under metastaser, men begge CD133
+ og CD133
– celler initiere svulst i SCID-mus [ ,,,0],19]. CD133
– populasjoner fra tykktarmskreft og føflekkreft ble også funnet å være tumorigent i SCID /hårløse mus [19], [20]. Markører som ESA, CXCR4, ALDH og ABCG2 har vært brukt med CD133 for å isolere CSC fra lungekrefttilfellene [13], [21], [22]. CD34 og Sca-1 er nyttig for å identifisere murine lunge stamceller men Sca-en ikke er uttrykt i menneskelig vev [23]. For å utforske ytterligere lunge CSC markører, har vi vist uttrykket profilen til CD34, CD44, CD133, BMI1 og OCT4 i 10 lunge kreft cellelinjer ved flowcytometri. Vi viste at CD44
+ men ikke CD44
– celler fra selektive kreftcellelinjer kunne utvides og serielt spredte
in vitro Hotell og
in vivo
. Vi foreslår at CD44-uttrykke celler er beriket for stamcelleegenskaper. Vår studie viser ikke at alle CD44
+ celler er bona fide CSC, men foreslår at CD44 kan være en markør for startfasen evne i enkelte lungekreftceller. Uttrykket mønster av CD44 ble også karakterisert ved kliniske lungekrefttilfellene.
Resultater
Stamcelle markør uttrykk profilen til NSCLC cellelinjer
Vi har analysert uttrykket profilen til antatte overflate ( CD34, CD44, CD133) og kjernefysiske markører (BMI1, OCT4) av stamceller i 10 lunge kreft cellelinjer ved hjelp av flowcytometri (tabell 1). Av overflatemarkører, ble CD34, CD44 og CD133 uttrykkes på forskjellige frekvenser. CD44 var den store markør uttrykt av H1299 og H23. A549, H441 og H1648 viste ingen ekspresjon av overflatemarkører som ble studert. CD133 ble uttrykt i HCC1833 bare. Ingen korrelasjon i uttrykket frekvens ble observert mellom 2 markører. Begge de nukleære markører, BMI1 og OCT4, ble uttrykt i de fleste kreftceller i alle cellelinjer som ble studert. Representative diagrammer av flowcytometri analyse for CD44 og CD133 uttrykk ble vist i figur 1. Immunoblotting og immunhistokjemi (IHC) analyser ble også utført på cellelinjer som inneholdt CD44
+ og CD133
+ populasjoner (Fig 2A). Immunoblot viste CD44 protein uttrykk i H1650, HKULC2, H1299, HKULC4, HCC827 og H23. CD133 protein ble bare uttrykt i HCC1833 og PLC8024 som ble benyttet som en positiv kontrollcellelinje for CD133 [4]. IHC viste også CD133 uttrykk i HCC1833 men ikke H1299, og vice versa for CD44 uttrykk. Dermed resultatene fra begge analysene var på linje med flowcytometri data.
Representative diagrammer av flowcytometri analyse av CD44 (FITC) og CD133 (PE) uttrykk i lunge kreft cellelinjer HKULC2, HCC827, HKULC4, H23, HCC1833, H1299 og H1650. Døde celler, ble cellerester og dubletter silt ut. Kompensasjon for bakgrunns fluorescens ble utført ved å måle målet signaler fra én farge kontroller og negative kontroller. Data ble presentert i 2D-diagrammer plotting enten PE eller FITC signaler mot en irrelevant kanal ECD® (også kjent som PE-Texas Red). De gjennomsnittlige prosent fra 3 individuelle analyser ble presentert i tabell 1.
A. Representant immunoblot av H1650, HKULC2, H1299, HKULC4, HCC827, H23, HCC1833 og PLC8024 total protein lysat bruker antistoffer mot CD44 og CD133. Aktin ble anvendt som en kontroll lasting. Blottet ble representative for tre individuelle eksperimenter. B. Overall view vise tettheten av SB formasjon fra CD44
+ og CD44
– H1299 cellene etter dyrking i RPMI medium med EGF, FGF og insulin supplement i 21 dager (øvre panel) og morfologi av SB på ukentlig intervaller (i midten panel). Celler av første generasjon SB ble skilt ut og analysert ved flowcytometri (nedre panel). Den CD44
+ til CD44
– (81,58% til 9,68%) forholdet var lik som foreldre H1299-celler (81,3% til 18,7%, tabell 1). SSC, Side Scatter Channel. C. Representative felt av kolonidannelse usortert, CD44
+ og CD44
– H1299 celler i soft-agar etter dyrking i 21 dager. Innfellinger viser forstørret utsikt over representative kolonier fra de respektive celler tatt under samme forstørrelse. CD44
– gruppen viste signifikant færre kolonier i forhold til både CD44
+ og usorterte undergrupper. (**, P 0,01). Histogrammer representerte gjennomsnittlig 3 uavhengige observasjoner fra egne eksperimenter.
spheroid dannelsen evne NSCLC cellelinjer
Vi neste vurdert spheroid kroppen (SB) dannelse evne til autorisert servicesenter-fraksjonert cellene i henhold til CD44 og CD133 ekspresjon i 7 cellelinjer. 500 usortert, men da
+ og markør
– celler henholdsvis dyrket i ikke-klebende og serumfrie forhold med EGF, bFGF og insulin kosttilskudd for 21 dager. Prosentandelen av SB dannelse av hver cellelinje ble tellet ved tilfeldig felt valg ved dag 21, og resultatene ble plottet som histogrammer (Supplementary figur S1). Usorterte celler fra alle 7 cellelinjer var i stand til å danne SB. SB ble også dannet fra CD44
+ subpopulasjoner av 6 cellelinjer som CD44 ble uttrykt, men ikke fra CD44
– subpopulasjoner. I tillegg HKULC2, H1299 og H1650 som inneholdt lavere første andeler av CD44
+ celler ga opphav til betydelig mer SB forhold til usorterte celler (* p 0,05, ** p 0,01). For HCC1833, CD133
+ men ikke CD133
– celler dannes SB. Økningen i SB tall fra CD133
+ i forhold til usorterte celler var ikke statistisk signifikant. Etter 21 dager, ble alle SB fra H1299 CD44
+ cellene dissosiert til enkeltceller og re-suspenderes i kulturmedier. Opp til tre serie passasjer ble etablert, noe som indikerer
in vitro
selvfornyelse av CD44
+ celler. Flowcytometri analyse av den første generasjonen SB celler fra H1299 viste 81,58% av CD44
+ celler, som lignet på 81,3% av foreldre celler, noe som viser at
in vitro
tumorigenecity fra CD44
+ -celler resulterte i et avkom med samme profil av CD44 ekspresjon (fig. 2B). Clonogenicity analyse i myk agar viste også at ferske isolert H1299 CD44
+ celler dannet betydelig flere kolonier enn CD44
– celler i 3 uker (** p 0,01), støtte til utvidet selvfornyelse kapasitet på CD44-valgte celler (fig. 2C).
in vivo
tumor initiere egenskaper CD44
+ celler og sekvensiell økning på transplantasjon effektivitet i nakne mus
evnen til markør valgte celler til å sette i gang
in vivo
svulst ble undersøkt ved subkutan transplantasjon i nakne mus. For H1299, HKULC4, H1650 og HCC827, så få som 10 000 CD44
+ celler var i stand til å initiere tumorer i 30-68 dager (tabell 2), men ingen svulst ble dannet fra det samme antall usortert eller CD44
– celler etter 90 dager. For usorterte celler av H1299, kunne startfasen oppnås ved 200.000 celler (3/4 mus), mens med CD44 + celler, ble tumorer initiert av 10.000 (1/4 mus), 50 000 (3/4 mus) og 100.000 celler (4- /4 mus). For CD44
– celler, ble ingen svulst dannet selv ved hjelp av 200.000 celler (0/4 mus) (figur 3A-representant svulster, Tabell 2.). Vi har dissekert mus og undersøkt alle organer og fant ingen metastatisk tumordannelse fra de sorterte eller usorterte celler under observerte perioden. For HKULC2 og H23, selv ble observert SB-formasjonen, ble ingen xenograft tumor dannet ved hjelp av 200.000 usortert, CD44
+ eller CD44
– celler. Likeledes 200.000 usortert, CD133
+ eller CD133
-. HCC1833 cellene ikke danner svulster
A. Representative bilder av primær xenografttumorer. Startfasen ble oppnådd ved 200.000 usorterte celler (3/4 mus). Fra CD44
+ celler, ble tumorer initiert av 10.000 (1/4 mus), 50 000 (3/4 mus) og 100.000 celler (4/4 mus). Ingen tumor ble dannet med 200.000 CD44
– celler (0/4 mus). PBS, saltvann injeksjon kontroll. B. Flowcytometri analyse av disaggregerte primære og sekundære xenotransplantater viste lignende CD44
+ til CD44
– undergruppe forholdstall som foreldre H1299 celler. X-akse: CD44 ekspresjon, FITC kanal; Y-akse: Døde celler farget av PI, PE-kanal. C. Semi-kvantitativ RT-PCR-analyse av primær xenotransplantater viste uttrykk av CD44 standard form (CD44s) og pluripotency gener (
POU5F1
,
Nanog
,
SOX2
) i CD44
+ men ikke CD44
– undergrupper. D. IHC analyse av transplantater fra sekvensiell generasjoner av mottaker mus viste CD44 uttrykk i cellemembranen distribusjon. Vertsceller fra mus opprinnelse som er tilstede i tumoren stroma var ikke farget. Tumor vekstkurver av den primære, ble sekundære og tertiære xenografttumorer dannet av usorterte og CD44-sortert H1299 celler plottet ved å observere og måle tumordannelse ukentlig i opptil 9 uker, ble etter den mus scarified å unngå overvekst av svulster.
de neste forsøkene testet om svulsten initiering kapasitet kan spres
in vivo
. Siden H1299 CD44 + viste den korteste ventetiden for tumordannelse (tabell 2), dissosiert vi H1299 primærtumor å demonstrere
in vivo
serie tranplantability. Bare levedyktige kreftceller fra disaggregerte H1299 xenotransplantater ble valgt for serie tumor transplantasjon i videregående, og senere, tertiær mottaker mus. Svulster ble dannet fra CD44
+ men ikke CD44
– celler (tabell 3). Spesielt, selv om andelen av levende CD44
+ celler (47,73% for primære, 0,91% for sekundær) (figur 3B) ble redusert på serie transplantasjon, effektiviteten startfasen økte i påfølgende generasjoner av tumor. Den latency av tumordannelse fra 5000 CD44
+ celler ble gradvis forkortet fra 30 dager etter den første generasjonen, til 21 dager etter den andre og 14 dager av tertiær generasjon, henholdsvis. Antall celler som kreves for å initiere tertiær svulster også redusert til 1000 CD44
+ celler.
For å analysere differensiering kapasiteten CD44
+ celler, de høstet svulster var skilt ut og utsatt for flowcytometri analyse. Den CD44
+ :CD44
– forholdet mellom primærtumor var 80.72:17.0, og av den sekundære svulsten var 85.4:12.53. Disse var i samme størrelsesorden som foreldrecellene (81.3: 18.7), noe som viser tilsvarende CD44 ekspresjon hierarki av sekvensielle generasjoner av xenografter (fig. 3B). Videre analyser av primærtumor ved RT-PCR avslørte uttrykk for pluripotency markører
POU5F1
,
Nanog Hotell og
SOX2
i CD44
+ men ikke CD44
-. subpopulasjoner (fig. 3C)
fig. 3D viser representative IHC-farging for CD44 og tumorvekstkurver til den primære og serielt transplanterte xenotransplantater. Som vist av svulsten vekstkurve, primær- og serielt transplanterte svulster initiert fra 50.000 CD44
+ celler vokste raskere enn 200.000 usorterte celler.
CD44
+ celler uttrykte pluripotency og epithelial-Mesenchymale-overgang (EMT) markører og besatt differensiering potensialer
uttrykk for pluripotency gener og oppkjøp av mesenchymale egenskaper har vist seg å indikere en stamcelle fenotype. Vi demonstrerte co-uttrykk av embryonale proteiner OCT4, Nanog og SOX2 til IF studier på SB fra CD44
+ H1299 celler. Semi-kvantitativ RT-PCR ble også utført på fersk sortert CD44
+ og CD44
– H1299 celler. Uttrykk for
OCT4
,
Nanog
,
SOX2
og mesenchymale markører
SNAI1
,
CDH2 Hotell og
VIM
ble vist i CD44
+ celler, men var lavere eller umulig å oppdage i CD44
– celler. Siden differensial uttrykk for standard (
s
) og variantformer (
v3
,
v5
,
v6 Hotell og
v10
) av CD44 er vist i stammen eller differensierte celler, undersøkte vi mønsteret av
CD44
mRNA-spleising av RT-PCR. Både standard og variantformer ble funnet i CD44
+ men ikke CD44
– celler, noe som tyder oppbevaring av
CD44
mRNA differensial skjøting potensialer i CD44
+ i forhold til CD44
– undergruppe (fig. 4A B).
A. Immunfluorescens karakterisering av SB fra CD44
+ undergruppe, viser samtidig uttrykk for OCT4, Nanog og SOX2. DAPI, kontroll; Green, OCT4-FITC; Rød, SOX2-Texas Red; Blå, pseudocolor av Nanog av PE-konjugert antistoff. B. Semi-kvantitativ RT-PCR-analyse viste pluripotency gener,
SNAI1
,
CDH2
,
VIM
,
CD44s Hotell og
CD44 v3 , 5,6,10
uttrykk i CD44
+ celler. CD44
– H1299 cellene mangler disse uttrykk bortsett
CDH2 Hotell og
VIM
. C. CD44
+ celler var mer motstandsdyktig mot apoptotiske virkninger av fem mikrometer cisplatin sammenlignet med CD44
– i H1299 og H1650 celler etter 24 timers inkubasjon. Histogrammer representert gjennomsnitt på tre individuelle eksperimenter av usortert, CD44 + og CD44- celler før og etter cisplatin behandling.
CD44
+ celler var cisplatin-resistente
Fersk sortert CD44
+, CD44
– og usorterte celler av H1299 og H1650 ble dyrket i serumfritt RPMI-medium og underkastet 5 uM cisplatin behandling i 24 timer. Histogrammet i fig. 4C representerte gjennomsnittet av tre individuelle eksperimenter for begge cellelinjer. Apoptotiske og ikke-levedyktige celler ble målt ved hjelp av Annexin V og PI-farging ved hjelp av flow cytometri, respektivt. For H1299, cisplatin-behandling av usortert eller CD44
+ celler medførte ingen signifikant økning av apoptotiske celler i forhold til deres ubehandlet kontroll, noe som indikerer relativ cisplatin motstand. CD44
– celler viste en signifikant økning i apoptose (*** p 0,001) etter behandling med cisplatin som indikerer sensitivitet. Når man sammenligner blant gruppene, CD44
– celler viste betydelige økninger (### p 0,001) av apoptose i forhold til både usorterte og CD44
+ celler, noe som indikerer at CD44
– celler var den mest cisplatin- følsomme av de 3 gruppene. Sammenlignbare resultater ble også observert for H1650, noe som indikerer relativ cisplatin motstand av usortert og CD44
+ celler. Videre er resistente H1299-celler som stabilt er valgt av langtids cisplatin behandling viste en høyere basal prosentandel (96,2%) av CD44
+ celler sammenlignet med de parentale celler (82%). Likeledes, for H1650, økt basal CD44
+ prosent fra 61,5% til 92,9%. Resultatene viste motstand og en overlevelse fordel av CD44
+ celler under kronisk cisplatin behandling (Supplementary Figur S2).
Immunhistokjemisk analyse av kreft stamcellemarkører i NSCLC prøvene
For å evaluere
in vivo
protein uttrykk for CD44 uttrykk, IHC ble utført på oppstilt kreft kjerner av 141 primær lungekarsinom og reaktive eller foster lunge vev. I kontroll vev, ble cellemembranen uttrykk for CD44 observert i basal celler av luftveiene eller metaplastiske plateepitel bronkialepitelet, og gjenoppfriske cuboidal pneumocytes av skadet lunge. Ingen ekspresjon ble observert i terminalt differensiert epitelceller som Cilierte eller ikke-ciliated columnar celler av bronkialepitelet eller type I flate pneumocytes lining alveolarområdene. I første trimester human fetal lunge, ble CD44 uttrykt i epitelet i luftveiene primitive (Fig. 5A). I lungekrefttilfellene, uttrykk var til stede i alveolære makrofager og små lymfocytter som fungerte som interne positive kontroller. Helt, 62/141 (50,4%) tilfeller viste CD44 uttrykk. SCC var signifikant assosiert med moderat til sterk ekspresjon (21/27, 77,8%) sammenlignet med AD (41/96, 42,7%) (p = 0,002) (figur 5B). I SCC viser moderat til godt differensiering, ble CD44 uttrykt mye sterkere i den basale forhold til modning tumorceller (Fig. 5B), i samsvar med de forventede stamcelle nisjer. Når bare AD ble vurdert, CD44 uttrykk viste en svak sammenheng med ikke-røykere (p = 0,024). For AD, viste Logg Rank test at pasienter med negativ eller svak CD44 uttrykk hadde signifikant dårligere samlet (p = 0,015), men ikke progresjonsfri overlevelse. For SCC, ble observert noen signifikant sammenheng for å overleve med nivået på CD44 uttrykk. Ingen assosiasjon med andre clinicopathological parametere inkludert pasientens alder, kjønn, tumor klasse, størrelse, scene, lymfeknute status, eller patologisk stadium ble observert (Supplementary tabell S2). CD133 uttrykk ble oppdaget bare i spredte små celler i stroma av føtale og reaktive voksen lunge vev. Den basale bronchiolar epitel, regenererende pneumocytes eller kreftceller var negative. CD34 ble påvist i endotel og reaktive stromale celler i noen tumorer, men ikke kreftceller. For å sikre at fravær av farging var ikke på grunn av regional variasjon av cellulær distribusjon, ble resultatene validert ved å gjenta IHC analyse på fulle deler av kreft i selektive tilfeller.
A. CD44 uttrykk i pseudoglandular fasen av embryonale lunge (til venstre) og regenererende pneumocytes av lunge med diffuse alveolær skade (til høyre). Inset viser CD44
+ basal celler i normal bronkialepitelet. B. Representative tilfeller av adenokarsinomer (AD) viser moderat (til venstre) og sterk (til høyre) CD44 uttrykk i cellemembranen distribusjon. I noen tilfeller av plateepitelkarsinom (SCC), CD44 uttrykk var spesielt fremtredende i tumorceller i periferien (pil) enn sentrale strøk (stjernetegn) av kreft øyer som er generelt ansett som stamcelle nettsteder. Spredte små lymfocytter og marcophages viste også CD44 uttrykk i svulsten stroma. C. Kaplain Meier overlevelsesanalyse av pasienter med AD (øvre panel) og SCC (nedre panel) stratifisert etter CD44
+ (svulster med moderat /sterkt uttrykk) eller CD44
– (fraværende /svak, focal flekker) . PFS, progresjonsfri overlevelse i måneder; OS, ovrall overlevelse i måneder.
Diskusjoner
Hypotesen om at kreft blir vedlikeholdt av en undergruppe av stamceller eller progenitorceller-lignende celler mens ikke-stammen /stamceller har en begrenset levetid span øker muligheten som er rettet mot utvalgte komponenter av de regulatoriske reaksjonsveier for kreft stamcelle vedlikehold kan tilveiebringe et middel for kontroll av kreft. Som et innledende trinn for å undersøke om denne hypotesen er anvendelig til lungekarsinomer, er det nødvendig å identifisere og isolere kreft initiering av celler ved hjelp av egnede markører. Selv om den optimale tilnærmingen til dette formålet er fortsatt under utvikling, flowcytometrisk analyse og sortering av markør-positive celler er for tiden den mest anvendte metoden [24]. Blant de overflatemarkører studert, har vi vist at CD44
+ celler er anriket for tumor som forplanter seg kapasitet og CD44 er en potensiell CSC markør av NSCLC-cellelinjer. I en fersk studie på metastatisk lungekreft i ondartet pleural effusjon, ble CD44 også rapportert som en mulig stamcelle markør men karakterisering av stamcelleliknende egenskaper var basert på
in vitro
molekylær analyse og cellulær ekspansjon bare [ ,,,0],16]. I vår studie,
in vitro Hotell og
in vivo
tumorigenecity av CD44
+ celler ble vist. Videre våre xenograft eksperimenter viste en progressiv forbedring av transplantasjon effektivitet i påfølgende tumor generasjoner med forkorting av latenstid og redusert minimal mobil dose engraftment. En økende svulstdannelse kapasitet ble også rapportert av Du et al. som undersøkte CD44
+ subpopulasjoner av tykktarmskreftceller [25]. Bryst epitelceller indusert til å gjennomgå EMT ble vist å tilegne stamcelleliknende og tumorigene tegn [26]. I vår studie ble CD44
+ celler også forbundet med uttrykk av markører implicating EMT som
SNAI1
,
CDH2 Hotell og
VIM
. Bare CD44
+ celler uttrykte pluripotency gener
POU5F1
,
Nanog Hotell og
SOX2 product: [10], [27], [28], [29], mens disse markørene gikk tapt i CD44
– celler, noe som tyder på at EMT kan være involvert i å opprettholde stemness. Videre undersøkelser er nødvendig for å klargjøre den underliggende mekanismen og samspillet mellom disse transkripsjons komplekse proteiner og CD44 uttrykk.
I dyrkede H1299 og H1650 celler, CD44
+ celler viste en lavere basal apoptotisk nivå og relativ resistens mot cisplatin behandling i forhold til CD44
– celler. Dette indikerer deres motstandsdyktighet mot chemotoxicity og kapasitet for å opprettholde homeostase vev, funksjoner som antas å være forbundet med vev stamcelle-fenotype. På den annen side, når CD44
+ celler ble transplantert fra
in vitro
til
in vivo
miljø utløser merket celletap ved apoptose, en 100 gangers reduksjon av tumorceller var i stand å initiere svulster i et raskere tempo i sekvensielle mus generasjoner, noe som viser hvor robust den stamcelleliknende undergruppe som finnes i de valgte cellene. Dette kan også indikere at bare en del av CD44
+ celler var nødvendig for startfasen, og at den økende tumorigenecity av CD44
+ -celler var på grunn av
in vivo
anriking av CSC. Videre markør studier og raffinerte utvalgskriterier er nødvendig for mer spesifikk
in vitro
CSC isolasjon.
CD133 er den hyppigst rapporterte markør og har blitt brukt til å isolere CSC fra ferske lungekreft [13] , [15], men i vårt studium, de fleste kreftcellelinjer viste ingen signifikant CD133 ekspresjon av enten semikvantitativ RT-PCR (data ikke vist), IHC, immunoblotting (fig. 2A) eller strømningscytometri-analyse (tabell 1). Ved anvendelse av samme anti-CD133 antistoff, Chen et al. kun observert 0,7% CD133 uttrykk i H1299, mens ingen uttrykk ble funnet i vår studie [11]. Blant våre studert cellelinjer, bare HCC1833 viste SB formasjon på CD133-utvalg, men
in vivo
tumorigenecity kunne ikke påvises. Bruk av andre mus arter som er immunologisk mer tolerant mot transplantater kan avsløre ulike resultater. Ingen data på HCC1833 er tilgjengelige i litteraturen for sammenligning. Stuelten et al fant også sjelden CD133 uttrykk i NCI60 kreftcellen panel [30]. CD44 uttrykk ble observert, men i to cellelinjer, deres funn forskjellig fra vår. Vi observerte 0% og 95,9% av CD44 i A549 og H23, men 84,41% og 30,95%, henholdsvis, ble oppdaget av forskere [30]. Vi kan ikke forklare forskjellene, men data for andre krefttyper har også rapportert avvikende observasjoner. For eksempel, en studie rapporterte 38-72% av CD133 + -celler i ovarian cancer cellelinje SKOV3 mens andelen funnet ved Stuelten et al var bare 0,78%. Ulike markør prosenter har også blitt funnet i tykktarm og lever kreftceller [30], [31], [32]. Inkonsekvensen CSC markør profil uttrykk blant ulike studier kan være relatert til individuell kreft variasjon, men de kan også være på grunn av forskjellige potens stater, kompositoriske eller funksjonelle egenskaper kreft stammen eller stamceller populasjoner. I fraværet av en spesifikk markør, den sanne prosentandel av CSC i en svulst, spesielt at i vel etablerte cancercellelinjer, er kontroversiell [24]. Variasjonen i miljø- og selektive presset oppleves av kreftceller
in vitro Hotell og
in vivo
kan utløse eller undertrykke ulike veier i de molekylære nettverk som regulerer CSC funksjoner, og det er ikke klart om CSC markør profilen kunne variere med omstendighetene. Selv om vi har vist at CD44
– celler er i stand til opprettholdelse tumor, mer raffinerte fremgangsmåter for CSC utvelgelse og karakterisering er strengt nødvendig. Det ville være verdt å undersøke om CD44 kan kombineres med andre potensielle CSC markører som ALDH, CXCR4, ABCG2, siden befolkningen markør, ESA, etc., for å forbedre effektiviteten og spesifisiteten av CSC utvalg [13], [21], [22], [33].
CD44 er et membranbundet glykoprotein som medierer en kompleks rekke funksjoner. Nyere studier har gitt støtte til sin rolle som CSC markør. For eksempel, den klonal ekspansjon og xenograft initiering kapasitet av CD44
+ – kunne valgt kolorektal kreft CSC bli inhibert av CD44 knockdown [25]. Homozygot CD44 sletting påvirket intestinal krypten celle overlevelse og svekket tumorigenecity uten at det påvirker spredning i en musetykktarmskreft modell [34]. Mekanistisk, kan invasiv og metastatisk vekst bli formidlet gjennom samspillet av celleoverflaten CD44 med ekstracellulære matrix komponenter som hyaluronan med påfølgende endringer indusert i cytoskeletal maskiner av kreftceller [35]. CD44 uttrykkes på overflaten av tykktarmskreftceller har vist seg å lette binding til endotele P- eller L-selektin og øke tumor adgang til hematogen spredning [36]. CD44 er også nettverk til mange signalkaskader som medierer kreftfremmende funksjoner. Det fungerer som en ko-reseptor med nabo EGFR eller andre ErbB-familien reseptorer tyrosin-kinaser [37], og kan aktivere cellespredningsveier indirekte via liganden presentasjon for eksempel spredningsfaktoren til sin reseptor c-MET [38]. Tumor celle overlevelse kan også bli styrket gjennom aktivering av anti-apoptotiske trasé som PI3K /AKT kaskade [39], [40] og BCL2 og BCL-XL transkripsjonsfaktorer [41]. En rapport om småcellet lungekreft viste at aktivering av CD44-MAPK-PI3K signalering førte til økt uttrykk av uPA /uPAR og MDR1, noe som resulterer i forbedret invasive og multiresistent kreft fenotyper [42]. Det har vært antydet at variantformer av CD44, spesielt CD44v6 som er forbigående uttrykt under embryonal utvikling lunge, medierer tumorcellemigrering og invasjon og kan være tilstrekkelig for en CSC markør [43].
