Abstract
Uavhengig av oppnåeremisjoner med første linje hormonbehandling hos pasienter med prostatakreft (CAP), rømming sykdommen hormonavhengig scenen til en mer aggressiv status hvor kjemoterapi er den eneste effektive behandlingen og ingen behandling er kurativ. Dette gjør det svært viktig å identifisere nye mål som kan forbedre utfallet av behandlingen. ATM og DNA-PK er de to kinaser ansvarlige for alarm og reparere doble trådbrudd (DSB). Således begge kinaser er aktuelle mål i Cap behandling for å forbedre aktiviteten av de mange DNA DSB induserende midler anvendt i Cap behandling slik som ioniserende stråling (IR). Kolonidannelse assay ble brukt for å vurdere følsomheten av hormonavhengig, p53 wt (LNCaP) og hormonuavhengig p53-mutant (PC3) CAP-cellelinjer til den cytotoksiske effekten av IR og Doxorubicin i nærvær eller fravær av Ku55933 og NU7441 som er lite molekyl hemmere av henholdsvis ATM og DNA-PK,. Flowcytometri baserte metoder ble anvendt for å vurdere effekten av de to inhibitorene på cellesyklus, apoptose og H2AX foci formasjonen. Nøytral kometmetoden ble brukt til å vurdere induksjon av DNA DSB sin. Ku55933 eller NU7441 alene økte følsomheten Cap cellelinjer til DNA-skadelige stoffer, men å kombinere begge hemmere sammen resulterte i ytterligere forbedring av følsomhet. Cellesyklus profilen til begge cellelinjene ble forandret med øket celledød, DNA DSB og H2AX foci formasjonen. Denne studien rettferdiggjør ytterligere evaluering av ATM og DNA-PK-hemmere for klinisk anvendelse i Cap pasienter. I tillegg kan den forsterket effekt som følge av å kombinere både hemmere har en betydelig implikasjoner for behandlingen av Cap pasienter som har en defekt i en av de to DSB reparere veier
Citation. Shaheen FS, Znojek P, Fisher A , Webster M, Plummer R, Gaughan L, et al. (2011) Targeting DNA Double Strand Break reparasjon av veier i prostatakreft. PLoS ONE 6 (5): e20311. doi: 10,1371 /journal.pone.0020311
Redaktør: Kerstin Borgmann, Universitetssykehuset Hamburg-Eppendorf, Tyskland
mottatt: 18 januar 2011; Godkjent: 28 april 2011; Publisert: 23 mai 2011
Copyright: © 2011 Shaheen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Aga Khan Foundation, www.akdn.org/AKF, CRUK, CancerResearchUK.org, MRC, www.mrc.ac.uk, og AICR, www.aicr.org.uk. . Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser: En av forfatterne, Graeme C.M. Smith, er ansatt i et kommersielt selskap, kudos Pharmaceuticals Ltd, Cambridge Science Park, Milton Road, Cambridge, UK. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Ifølge utenfor USA National Institutes of Health, aldersjustert insidensrate på prostatakreft 2003-2007 var 156,9 per 100.000 menn per år. Selv om høye responsrater kan oppnås ved førstelinjebehandling med kirurgi, strålebehandling, antiandrogen eller kombinasjoner; den naturlige utviklingen av sykdommen er mot hormonet ildfaste status [1] hvor kjemoterapi er den mest effektive behandlingen, men likevel ikke kurativ [2]. Denne motstanden fremhever viktigheten av å identifisere nye mål som kan øke følsomheten av Cap celler og dermed responsrater og total overlevelse av pasienter. Ataxia telangiectasia mutated (ATM) og DNA-avhengig protein kinase katalytisk subenhet (DNA-PKCS) er medlemmer av fosfatidylinositol 3-kinase relaterte kinaser (Pikk) superfamilien. Medlemmer av denne familien er preget av sin høye molekylvekt og sekvenslikhet til p110 subenheten lipid kinase PI3-kinase [3]. I pattedyrceller, ATM og DNA-PK spiller nøkkelroller i DNA dobbel tråd pause (DSB) respons, via homolog rekombinasjon (HR) og ikke-homolog ende sammenføyning (NHEJ), henholdsvis [4], [5]. Rapid fosforylering av både minibank og DNA-PK oppstår i respons til DSB følgende endogene eller eksogene fornærmelser. Når aktivert, ATM og DNA-PK-signal til et bredt spektrum av nedstrøms mål som er involvert i reparasjonsprosessen, cellesyklusregulering og apoptose [6]. Valget av hvilke spredningsveier reparasjoner DSB er cellesyklus scenen avhengige, med NHEJ å være den dominerende sti i G0 og G1, og HR dominerer i S og G2 /M faser [7]. ATM og DNA-PK spaltes av caspase 3 når avgjørelsen om å aktivere apoptose er laget i cellen, og denne spaltning arrangementet er tenkt å lette apoptose ved å deaktivere den DNA-signalisering og reparasjon av veier [8], [9]. Tradisjonell PI3K inhibitor, Wortmannin med generelt lav selektivitet mot forskjellige klasser og /eller isoformer av Pikk har vært mye brukt til å studere ATM og DNA-PK signalveier [10]. Ku55933 ble identifisert som en potent og spesifikk ATP konkurrerende inhibitor av ATM (IC
50 13 nmol /L) i forhold til inhibering av andre medlemmer av familien Pikk. Ku55933 økte følsomheten av brystkreftceller til IR, endret deres cellesyklus-profil, og hemmet fosforylering av et panel av ATM mål. A-T-celler viste ikke disse effektene når de ble behandlet med Ku55933 [11]. NU7441 ble identifisert som en potent og spesifikk ATP konkurrerende inhibitor av DNA-PK (IC
50 14 nmol /L) med 100-ganger høyere selektivitet for DNA-PK sammenlignet med andre medlemmer av familien PI3KK. NU7441 økt følsomhet for tykktarmskreftceller til IR og topoisomerase II-hemmere, og endret sin cellesyklus profil. DNA-PK mangelfull V3-celler viste ikke disse effektene når de ble behandlet med NU7441 [12]. Denne studien ble utformet som en preklinisk evaluering av både minibank og DNA-PK-hemmere for å undersøke hvorvidt disse hemmere kan forbedre effekten av DNA DSB induserende midler for Cap behandling.
Materialer og metoder
Kjemi
Alle rutinemessige kjemikalier var kjøp fra Sigma med mindre annet er oppgitt. NU7441 ble syntetisert på den nordlige Institutt for kreftforskning, Newcastle University (Newcastle upon Tyne, UK) i samarbeid med kudos Pharmaceuticals (Cambridge, UK). KU-55933 var en slags gave fra kudos Pharmaceuticals. Begge inhibitorer ble oppløst i DMSO ved en stamkonsentrasjon på 2000 x den endelige konsentrasjon som er nødvendig for forsøket. Doksorubicin ble oppløst i vann ved lager-konsentrasjon på 1000 x den endelige konsentrasjon som er nødvendig for forsøket. Alle forbindelser ble lagret i delmengder ved -20 ° C.
Cell kultur
LNCaP hormon sensitiv (p53 villtype) og PC3 hormon ufølsomme (p53 null) CAP cellelinjer ble kjøpt fra ATCC og dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% (v /v) FCS. Begge cellelinjer ble rutinemessig testet for Mycoplasma.
Colony formasjon analysen
Celler ble sådd i 6 brønners plater på forskjellige tettheter. Etter som tillater å feste, ble celler inkubert med Ku55933 (10 pM) alene eller i kombinasjon med NU7441 (1 uM) i 1 time før bestråling enten (0-2 Gy) eller doksorubicin behandling (0-75 nM). 24 timer senere, brønnene ble forsiktig vasket to ganger med varm PBS før tilsetning av friskt medium, og returnert til inkubatoren i 7-10 dager for PC3-celler og 12-14 dager for LNCaP-celler til å danne kolonier. Kolonier ble løst med Carnoy fiksativ, tørket, farget med 0,4% krystallfiolett og telles manuelt. Overlevelsesreduksjonsfaktoren ble beregnet som den overlevende fraksjonen av celler i fravær av inhibitorene dividert med den overlevende fraksjonen av celler i nærvær av inhibitorer for en gitt dose eller konsentrasjon av cytotoksisk middel.
Strømningscytometri basert metode for cellesyklus
Cellene ble utsådd i 6-brønners plater. 24 timer senere ble cellene behandlet med 1 uM NU7441 og /eller 10 uM Ku55933 før IR eller doksorubicin behandling. 48 timer senere ble cellene samlet opp i FACS-rør (Becton B) og PC3 (figur 2C 0,001). LnCap (E F) eller PC3 (G H) celler ble sådd ut i forskjellige tettheter og til venstre for å feste før 1 time inkubering med Ku55933 (10 uM) eller NU7441 (1 uM) før behandling med varierende IR doser eller doxorubicin konsentrasjon for 24 timer (
P
0,001). Alle resultater er gjennomsnitt av tre uavhengige eksperimenter ± SEM.
Ku55933 og NU7441 redusert Cap cellelinjer cellular overlevelse i respons til IR eller doksorubicin
Etter å ha vist en konsentrasjonsavhengig chemo og bestrålingssensibilisering i begge cellelinjene, så undersøkte vi responsen til en fast konsentrasjon av hver inhibitor med økt konsentrasjon av doxorubicin eller IR-dose. Det var en doseavhengig reduksjon i celleoverlevelse som respons på IR. PC3 celler viste motstand mot IR forhold til LNCaP kombinerer NU7441 eller Ku55933 med IR betydelig redusert celleoverlevelse for LNCaP (figur 2E) og vesentlig for PC3 (figur 2G). På samme måte, doksorubicin redusert celleoverlevelse i begge cellelinjer, Ytterligere chemo-sensibilisering resultat av å kombinere NU7441 eller Ku55933 i LNCaP (figur 2F) og PC3 (figur 2 H). Kombinere begge hemmere betydelig økt chemo-bestrålingssensibilisering og NU7441 kombinasjonen var mer effektive i å indusere chemosensitisation i LNCaP mens Ku55933 kombinasjon hatt mer effekt i å indusere bestrålingssensibilisering i PC3 foreslå en avansert rolle for minibank i hormon ildfaste modell.
Ku55933 og NU7441 endret cellesyklus og økt apoptose som svar på DNA-skade i Cap cellelinjer
Vi neste fastslått hvorvidt den økte følsomheten Cap cellelinjer følges av økt apoptose eller endringer i cellesyklusen profil. IR forårsaket minimal /ingen økning i LNCaP (figur 3A) i forhold til en doseavhengig økning i G2 akkumulering i PC3 (figur 3B). Dessuten er kombinasjonen av begge inhibitorer hadde en additiv effekt på G2 akkumulering ved lav dose (2 Gy), men ikke ved høy dose (10 Gy). Doxorubicin-behandling forårsaket celler for å akkumulere i G2 /M, spesielt ved høye doser. Generelt, ved å kombinere enten inhibitor med en lav dose doxorubicin (20 nM) øket G2 /M akkumulering selv om NU7441 hadde bare beskjeden effekt i LNCaP-celler (Figur 3C). Mens den eneste inhibitor kombinasjonen ved høye doser doksorubicin (200 nM) resulterte i en slående økning i subG1 i LNCaP (figur 3C) sammenlignet med en interessant økning i G1 i PC3-celler (Figur 3D). En additiv effekt ble observert ved kombinasjon av begge inhibitorer
LNCaP (A og C). Og PC3 (B dette kan være delvis relatert til det faktum at IR induserer hovedsakelig høyere nivå av enkelttrådbrudd.
Diskusjoner
Ku55933 og NU7441 er potente hemmere av ATM og DNA-PK, henholdsvis. Hver inhibitor avskaffet autofosforylering av sine egne proteiner mål i begge cellelinjene Cap følgende IR. Dataene med doxorubicin behandling var lik mellom de to cellelinjene, men fosforyleringen av DNA-PK
Ser2056 synes ikke å være hemmet av NU7441. Spesielt, ble fosforyleringen av nedstrøms mål H2AX
Ser139 og p53
Ser15 som i hovedsak regulert av ATM oppheves når begge inhibitorer ble kombinert. Videre er en ny fosforylering hendelsen rapportert her som fosforyleringen av Ser2056 av DNA-PKCS, som antas å være en sann autofosforylering området for DNA-PK [14], ble redusert etter Ku55933 behandling (ikke NU7441) som reaksjon på doxorubicin, men ikke IR- behandling som tyder på dette nettstedet kan være målrettet med minibank, avhengig av DNA-skade induserende agent. En relevant kontroll ville være å utarme opprinnelig ATM og erstatte den med en kinase-ATM død.
å kombinere enten inhibitoren med IR- eller doksorubicin ført til en massiv og vesentlig økning av følsomheten av LNCaP og PC3-celler til den cytotoksiske effekten av både IR og doxorubicin. I tillegg, ved å kombinere de to inhibitorene sammen med DNA-skadende midler førte til en ytterligere forbedring i cytotoksisitet sammenlignet med enkelt-inhibitor kombinasjoner. Dette samsvarer med rapporterte litteratur der målretting ATM og DNA-PK bruker siRNA metodikk avslørte økt følsomhet for IR og til kjemoterapi i forskjellige Cap cellelinjer [15]. Den økte følsomheten som følge av en kombinasjon av begge hemmere kan ha en betydelig konsekvens for behandling av Cap hos pasienter med en defekt i HR eller NHEJ trasé som BRCA-mutasjonsbærere [16]. Pasienter med defekt i en reparasjon reaksjonsvei kan potensielt bli behandlet med inhibitoren i den annen bane og utbytte av maksimal behandlingsresultat med minimal toksisitet.
Heri, en viktig egenskap ved PC3 cellesyklus, mangel av p53-funksjon, ført til en økt akkumulering i G2 /M-fasen av cellesyklusen i nærvær av ATM, DNA-PK-inhibitorer eller begge, spesielt når kombinert med IR-behandling. Imidlertid inhiberer enten ATM eller DNA-PK, eller begge i kombinasjon med høye doser doksorubicin behandlingen økte G1-fase oppbygging, noe som tyder på aktivering av G1 sjekkpunkt av andre reaksjonsveier slik som p38MAPK /MK2 [17]. I nærvær av funksjonell p53 (LNCaP-celler), celler akkumulert i G2 /M-fase når ATM ble inhibert, mens de akkumulerte i G1 når DNA-PK ble hemmet. Dette kan forklare overlevelsesdata siden opphopning i G2 ville tillate mer NHEJ mediert DNA reparasjon. Disse dataene støtter tidligere rapporter som tyder på at virkningen av DNA-PK på p53 bidrar til apoptose prosess snarere enn til cellesykluskontroll. Det er interessant at ATM inhibering fører til G2 opphopning noe som kan forklares ved virkningen av kinase aktiv ATR i fravær av aktiv ATM-kinase [18]. Interessant å kombinere enten hemmer eller dual hemmer kombinasjon med høy dose doxorubicin (overdreven DNA-skade) resulterte i en dramatisk økning i subG1 befolkningen, en indikasjon på apoptose. Dette tyder på at tilstedeværelsen av p53 kan utløse celledød når skaden i DNA er for substansiell for reparasjon. Våre data er i overensstemmelse med en rolle for ATM og DNA-PK i cellesyklusregulering gjennom deres virkning på forskjellige proteiner [19].
I denne studie ble effekten av inhibering av ATM eller DNA-PK på den cellulære død Cap cellelinjer viste at, uavhengig av p53 status eller hormonet avhengighet, dette hemming økte programmert celledød indusert av lave doser av enten doksorubicin eller IR. Men tilstedeværelsen av p53 (LNCaP-celler) betydelig økt apoptotiske populasjonen med høy dose doxorubicin. Mens, i fravær av p53 (PC3-celler) var det enten ingen eller en liten økning i celledøds med høy dose doxorubicin som er konsistent med den observerte økning i cellesyklus-stans. Jo mer uttalt apoptose i PC3 sammenlignet med LNCaP ved lave doser av DNA-skade kan forklares ved den korteste periode av behandlingen (48 h) for LNCaP sammenlignet (96 h) for PC3-celler.
Vi observerte at primære induksjon av H2AX foci ble vesentlig redusert ved å kombinere den ene eller begge inhibitorer med DNA-ødeleggende midler. Ved senere tidspunkter, ble H2AX foci dannelse fortsatt hemmet i ATM hemmer kombinasjons armer, mens den økte i de DNA-PK hemmer armer. Dette innebærer at DNA-PK hemming øker DNA DSB sin som er uthevet med økt antall H2AX foci dannet på skadestedet. Men redusert H2AX foci formasjonen i ATM-hemmer armene er ikke en konsekvens av mindre DSB sin blir generert som vi demonstrert økt DNA DSB sin bruk av nøytrale kometmetoden. Dette er i samsvar med dataene som tyder på at ATM er den store kinase som induserer H2AX foci, og at DNA-PK kan fosforylere H2AX bare i fravær av ATM, men ikke i nærvær av kjemisk inhiberte ATM [20]. Disse dataene er i overensstemmelse med en rapport ved hjelp av andre metoder for påvisning H2AX [21] der den første H2AX foci formasjon (30 min følgende IR) ble opphevet ved kombinasjon av ATM og /eller DNA-PK-inhibitorer. En annen rapport i strid med våre data [22] hvor de viste DNA-PK spiller dominerende rolle i H2AX foci-dannelse i fravær av ATM-funksjon; men denne rapporten anvendes cellelinjer som mangler enten ATM eller DNA-PK, som ikke er tilfelle i våre cellelinjer. I tillegg, hemmer både ATM og DNA-PK resulterte ikke i økt H2AX signal ved alle tidspunkter. Dette tyder på at ATR (den tredje kinase innblandet i H2AX fosforylering) er ute av stand til å utføre denne fosforylering funksjon i nærvær av ATM og DNA-PK, selv når begge er hemmet. En interessant tilnærming ville være å undersøke effekten på Rad51 foci dannelse når disse kinaser blir hemmet.
Det sentrale rolle ATM og DNA-PK i å reparere DNA DSB i pattedyrceller tyder på at slå ned funksjon av enten eller begge proteiner bør øke antall DNA DSB etter en induserende behandling. Bruke den nøytrale kometen analysen viste vi at hemming av minibank og /eller DNA-PK resultert i økt antall DNA DSB sin følgende IR eller doxorubicin behandling. En additiv effekt ble observert i behandlingsarmene hvor begge kinaser ble hemmet. Det er interessant at komethaler er nesten lik i enkelt hemmer armene selv om det forventes at DNA-PK-hemmer, bør føre til mer øke i DSB sin som NHEJ er den viktigste veien for å reparere DNA DSB sin. Dette kan være fordi vi gjennomførte kometen analysen på 24, som er mer fysiologisk menings til cellene, men gjenspeiler ikke nødvendigvis reparasjonskinetikk. De fleste DSB sin er reparert raskt etter NHEJ og deretter tregere kinetikk ved HR for rest frank DSB sin og DSB sin som følge av fastlåste replikasjonsgaffelen. ATM konsekvenser for HR derfor KU55933 bør redusere denne langsomme fasen enda lenger og derfor et større antall pauser på 24 timer sammenlignet med når HR ikke er hemmet (kontroll og DNA-PK hemmer armene).
I sammendraget, dette studie rapporterer en ny behandling for prostatakreft ved å målrette den DNA DSB sin reparasjon av veier. Vi viser at targeting DSB reparasjon overfører en forbedret kjemo- og radiofølsomheten i hormonfølsomme og ufølsomme Cap cellelinjer forbundet med økt programmert celledød. Videre evaluering av spesifikke hemmere må gjennomføres i dyremodeller, herunder vurdering av plasma tilgjengelighet, giftighet, og effekt før du går videre mot all klinisk forskning.
