Abstract
DNA-addukter er ansett som et integrere mål for kreftfremkallende eksponering og det første trinnet i kreftutvikling. Deres nivå i mer tilgjengelige perifere blod-lymfocytter (PBL) speile det i blærevevet. I denne studien undersøker vi hvorvidt dannelsen av PBL DNA-addukter kan være forbundet med blærekreft (BC) risiko, og hvordan dette forhold moduleres av genetisk polymorfisme, miljømessige og arbeidsrisikofaktorer for BC. Disse komplekse sammenhenger, herunder direkte og indirekte effekter av hver variabel, ble utbygd med strukturelle ligningen modellering (SEM) analyse. Innenfor rammen av en sykehusbasert case /control studie, studiepopulasjonen inkludert 199 BC tilfeller og 213 ikke-kreft kontroller, alle kaukasiske menn. Data ble samlet inn på livstid røyking, kaffedrikking, kostvaner og levetiden yrke, med særlig henvisning til eksponering for aromatiske aminer (AAS) og polysykliske aromatiske hydrokarboner (PAH). Ingen indirekte stier ble funnet, motbevise hypotesen om sammenheng mellom PBL DNA-addukter og BC risiko. DNA-addukter ble i stedet positivt assosiert med yrkes kumulativ eksponering for Aas (p = 0,028), mens XRCC1 Arg 399 (p 0,006) var relatert med en redusert adduktpartiklene nivåer, men med ingen innvirkning på BC risiko. Tidligere funn om økt BC risiko ved packyears (p 0,001), kaffe (p 0,001), kumulativ AAs eksponering (p = 0,041) og
MnSOD product: (p = 0,009) og en redusert risiko ved
MPO product: (p 0,008) ble også bekreftet ved SEM analyse. Våre resultater for første gang gjør tydelig en sammenheng mellom yrkes kumulativ eksponering for AAs med DNA-addukter og BC risiko, styrke den sentrale rollen av AAS i blæren kreftutvikling. Men mangelen på en sammenheng mellom PBL DNA-addukter og BC risiko forteller at disse snapshot målingene er ikke representative for relevant eksponering. Dette vil se nye scenarier for biomarkører og nye utfordringer som gjentatte målinger på ulike kritiske livsstadier
Citation. Porru S, Pavanello S, Carta A, Arici C, Simeone C, Izzotti A, et al. (2014) komplekse sammenhenger mellom yrke, Miljø, DNA-addukter, genetisk polymorfisme og blærekreft i en case-control studie Bruke en Structural Equation Modeling. PLoS ONE 9 (4): e94566. doi: 10,1371 /journal.pone.0094566
Redaktør: Courtney G. Montgomery, Oklahoma Medical Research Foundation, United States of America
mottatt: 13 november 2013; Godkjent: 17 mars 2014; Publisert: 10 april 2014
Copyright: © 2014 Porru et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av det italienske departementet for universitet og forskning, og ved Universitetet i Brescia. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Tobakksrøyking og yrkesmessig eksponering til aromatiske aminer (AAS) og polysykliske aromatiske hydrokarboner (PAH) er de viktigste risikofaktorene for blærekreft (BC) [1], [2]. Videre økende bevis tyder på en betydelig påvirkning av genetisk predisposisjon på BC forekomst [3], [4].
Dannelsen av reaktive metabolitter av AAS og PAH og deres binding til DNA for å gi ureparert /stabile addukter, alt modulert av genetisk polymorfisme av metabolske og DNA-reparasjonsenzymer, betraktes som kritiske hendelser langs den teoretiske veien som knytter eksponering for BC [5]. «Klumpete» DNA addukt målingen er derfor ansett som en integrert markør for både eksponering for aromatiske forbindelser, og evne til å aktivere kreftfremkallende og reparasjon DNA-skade [6], [7]. Betydelig høyere nivåer av aromatiske DNA-addukter har blitt funnet i blærekreft biopsier fra røykere [8], [9]. Videre vedvarende aromatisk-DNA addukter forårsaker mutasjoner, inkludert mutasjons «hot spots» i blæren P53-genet, har gitt et solid mekanistisk syn på hvordan DNA-addukter kan kjøre blæren tumorgenesen [10]. Videre er enkelte modifikasjoner DNA indusert av aromatiske forbindelser i blæren funnet å gjenspeile de i de perifere blod-lymfocytter (PBL) [11], [12]. Dette har adressert muligheten for å måle slik biomarkør i tilgjengelige vev som kan være lett og ikke-invasiv måte erholdt fra mennesker.
Mange faktorer kan imidlertid gripe inn i det teoretiske reaksjonsveien som forbinder kreftfremkallende eksponering til BC, for eksempel flere eksponeringer (for eksempel, tobakksrøyk, yrkesmessig eksponering, frukt og grønnsaker forbruk), deres karakterisering (f.eks nivå, rute, pålitelighet), så vel som den modulerende rolle (stigende, beskytte eller å ha noen effekt) eventuelt spilt av polymorfe gener involvert i metabolisme og DNA-reparasjon [13]. Så langt vi kjenner til, er det kun få studier undersøkt hypotesen om at PBLs DNA adduktpartiklene nivåer kan være knyttet til eller logisk av BC risiko. Resultater fra tre retrospektive sykehus basert case-control viste at risikoindikator måler sammenhengen mellom DNA-addukter og BC var høyere enn 1,0 [14], [15], ikke forskjellig fra enhet [17], eller lavere enn 1,0 [16]. Mer presist, ble DNA-addukter knyttet til risikoen for BC, men uavhengig av røykevaner [14], [15], mens andre forfattere [16] ikke fant noen sammenheng mellom BC risiko og store DNA-addukter hos ikke-røykere. I nøstet pasient-kontroll prospektiv studie, ble DNA-addukter ikke forbundet med BC risiko [17]; samlet disse motstridende resultater er vanskelig å bli forklart fra den biologisk synspunkt. Videre ingen studie tilsynelatende estimert de komplekse interaksjoner mellom DNA-addukter, flere genetiske polymorfismer, yrkesmessig eksponering for Aas og PAH, og BC risiko.
Vi har tidligere vurdert samspillet mellom yrkesmessige og miljømessige eksponeringer med metabolsk og DNA-reparasjon polymorfismer på risikoen for BC i retrospektiv sykehus basert case-control studie [18] – [22]
Hensikten med denne studien var todelt: å undersøke i hvilken grad PBL DNA-addukter og BC risiko var separat. påvirkes av genetisk polymorfisme, miljømessige og yrkesmessig eksponering; og for å utforske hvorvidt dannelsen av DNA-addukter som er involvert en ytterligere økning i BC risiko. Disse komplekse sammenhenger ble utbygd med analyse av strukturelle ligningen modellering (SEM).
Fag og metoder
Fag
Study befolkning, innsamling av data og statistisk analyse er beskrevet i tidligere publikasjoner [18] – [22]
Kort, designet var en sykehusbasert case-control studie.. Inklusjonskriteriene var å være mann, i alderen mellom 20 og 80, bosatt i Brescia provinsen (Nord-Italia). Sakene ble 201 nydiagnostiserte, histologisk bekreftet BC pasienter innlagt i Urologi Avdelinger av de to viktigste sykehusene i Brescia fra juli 1997 til desember 2000. Kontrollene var 214 pasienter som lider av ulike urologiske ikke-neoplastiske sykdommer, frekvens tilpasses tilfeller av alder (± 5 år), periode og sykehus for opptak. En skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hvert rekruttert emne og studien ble godkjent av den Spedali Civili di Brescia Etisk Komité.
Alle fagene ble gitt et spørreskjema i løpet av sykehusinnleggelse for å samle informasjon om demografiske variabler og levetid historie røyking, kaffe og annen væske forbruk, kostholdsvaner, yrker. Yrkesmessig eksponering til PAH og Aas ble estimert i henhold til metodikken som er beskrevet i forrige publisering [22]. En indeks på kumulativ eksponering for AAs og PAH, hver for seg, ble beregnet som produktet (i × f x L) med lengde (l), intensitet (i) og frekvens (f) av eksponering i hver jobb, summere opp så mange produkter som var nødvendig å ta hensyn til alle jobbene gjort. Livslang forbruk av sigaretter ble beregnet som packyears. Den livslange tidsvektet gjennomsnitt av kopper /dag av kaffe ble omkodet som 0 (aldri drikker), ≤3, 4, ≥ 5 kopper /dag. PAH som inneholder mat, frukt, store bladgrønnsaker og andre grønnsaker forbruk ble delt inn i fire kategorier (mindre enn en gang /måned, mindre enn en gang /uke, 1-3 ganger /uke, mer enn 3 ganger /uke).
Genotyping av GSTM1, GSTT1, GSTP1, Nat1, NAT2, SULT1A1, XRCC1-3, XPD, CYP1A2, MPO, COMT, MnSOD og NQO1 ble vurdert ved hjelp Amplification Ildfast Mutation System analyse og bruk av GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, Italia). PCR ble fulgt ved enzymatisk fordøyelse og PCR-RFLP-analyse, slik som tidligere beskrevet [18] – [22]
Alle variabler viste seg å være forbundet med risiko BC ved univariable logistisk regresjon ble tvunget i en multivariabel ubetinget logistisk regresjon. modell og deretter valgt av baklengs trinnvis seleksjon (med p 0,05 som kriterium). BC risikoen betydelig økt med packyears, tunge kaffedrikkere, MnSOD (Val /Val genotype), mens redusert med stor bladgrønnsaker forbruk og MPO (G-463A homozygot variant). Kumulativ eksponering for AAs var ikke statistisk signifikant, men det ble beholdt fordi å være en betydelig confounder [19], [22].
DNA-ekstraksjon fra PBLs
Blodprøver ble samlet inn fra alle fag i løpet av sykehusinnleggelse og på den samme dag behandlet ved sentrifugering for oppnåelse av perifere blodlymfocytter (PBL). Protokollen for automatisert DNA ekstraksjon ble utført i henhold til Extragen kit (Extragen BC. Av TALENT) etter produsentens instruksjoner som beskrevet tidligere [20]. Særlig 2,5 ml buffy coats fremstilt fra opptil 10 ml fullblod ble bearbeidet for DNA-ekstraksjon. Et typisk utbytte varierte 150-400 ug DNA /ekstraksjon fra en normal donor.
32P-merking Post-analyse av DNA-addukter
Alikvoter av 5 mikrogram DNA ble analysert for tilstedeværelsen av voluminøse-DNA-addukter av
32P-postlabeling etter anriking med nuklease P1 som tidligere beskrevet [23], [24]. Oppløsning av DNA-addukter ble utført ved flerveis tynnskiktskromatografi (TLC) under anvendelse av polyetylenimin (PEI) -cellulose platene [25]. I korthet ble 5 ug DNA ble enzymatisk spaltet til 3′-mononukleotider med 0,14 U /ug DNA av micrococcal nuklease og en mU /ug DNA av milt-fosfodiesterase i 3-4 timer ved 37 ° C. Etter anrikningsfremgangsmåten ved Nuclease P1 fordøyelse, ble DNA-baser som er merket med 50 uCi [y-
32P] ATP til en spesifikk aktivitet på 5000 Ci pr mmol ved hjelp av 2,5 enheter T4 polynukleotidkinase. 20 ul postlabeled prøven ble oppdaget på opprinnelsen til en oppmerkede PEI cellulose ark og kjøre for skytespillet TLC kromatografi. Etter kromatografi, ble TLC ark tørket og elektronisk autoradiografi utført ved hjelp av en
32P imager (InstanImager, Packard, MD, USA). En benzo (a) -pyrene diolepoxide-N2-DGP referansestandard (National Cancer Institute Chemical Carcinogen Reference Standard Repository, Vesten Research Institute, Kansas City, MO) ble brukt som en positiv kontroll i hvert merking eksperiment. DNA-addukter ble målt som relativ addukt nivå per 10
8 nukleotider.
Statistisk analyse
I montering SEM, packyears, kaffe og grønnsaker forbruk,
MnSOD
,
MPO
, kumulativ AA eksponering (variabler knyttet til BC risiko i henhold til tidligere publikasjoner) pluss
XRCC1 plakater (se nedenfor) ble brukt som eksogene variabler (tilsvarende prediktorer i regresjon baserte teknikker). Både BC risiko og addukter kan være endogene variable (som tilsvarer utfalls variabler), som hver påvirkes av en eller flere eksogene variable (hypotese 1). Alternativt kan BC risiko kan også påvirkes indirekte gjennom dannelsen av DNA-addukter (hypotese 2). De to konkurrerende hypoteser ble konvertert i to modeller av strukturelle ligninger for å finne ut hvilken modell montert beste de observerte data. SEM strukturelle ligninger ble utstyrt med «asymptotiske fordelingen gratis» metoden fordi det ikke gjør antagelsen om felles normalitet av alle variablene og tillatt å bruke variablene (spesielt addukter, se nedenfor) som gitt. Effekten av hver eksogen variabel ble uttrykt som standardisert (eller beta) koeffisienter som gjør sammenligninger lett ved å ignorere den uavhengige variabel skala fra enheter. SEM resultater ble både ordnet og presentert grafisk. Vi brukte to SEM godhet-of-fit statistikk: (1) den khikvadrattest for «modellen kontra mettet» (mettet modellen er den modellen som passer til kovarianser perfekt); og (2) stabilitetsindeksen hentet fra analyse av samtidige likningssystemer.
Utvalgsstørrelsen er nødvendig for SEM er avhengig av modell kompleksitet, estimering metode som brukes, og den fordelte karakteristikk av observerte variabler [26]. Det beste alternativet er å vurdere modellen kompleksitet (dvs. antall eksogene variable) og følgende tommelfingerregler: minimumsforholdet 5:01 [27], [28]; anbefalt forholdet 10:01 [26] – [28]; anbefalt forholdet 15:01 for data uten normalfordeling [29]. Med åtte eksogene variable brukt i SEM-modell, bør vi ha 120 (= 15 × 8) personer, men de var faktisk 412 (se nedenfor) oppfyller kravene ovenfor.
Analysen ble utført med statistikkpakke STATA 12.
Resultater
i denne studien, komplett individuelle data var tilgjengelige for 199 (av 201) tilfeller og 213 (av 214) kontroller, totalt 412 (i stedet for
