Abstract
hemmere av Wnt signal har vist seg å være involvert i prostata cancer (PC) metastaser; Men rollen som Sclerostin (Sost) ennå ikke er utforsket. Her viser vi at forhøyet Wnt signal avledet fra Sost mangel osteoblasts fremmer PC invasjonen, mens rhSOST har en hemmende effekt. I motsetning til dette fremmer rhDKK1 PC tøyelighet og filopodia formasjon, morfologiske endringer som er karakteristiske for en invasiv fenotype. Videre rhDKK1 ble funnet å aktivere kanoniske Wnt signal i PC3 celler, noe som tyder på at SOST og DKK1 har motstridende roller på Wnt signal i denne sammenheng. Genekspresjon analyse av PC3-celler ko-dyrket med OBS oppviser varierende mengder av Wnt signal identifisert CRIM1 som en av de transkriptene oppregulert i henhold sterkt invasive betingelser. Vi fant CRIM1 overekspresjon til også å fremme celle-invasjon. Disse funnene tyder på at bein-avledet Wnt signal kan forbedre PC tropisme ved å fremme CRIM1 uttrykk og tilrettelegge for kreftcelle invasjon og heft til beinet. Vi konkluderte med at SOST og DKK1 har motstridende effekter på PC3 celle invasjon og at bein-avledet Wnt signale positivt bidrar til invasive fenotyper av PC3 celler ved å aktivere CRIM1 uttrykk og legge til rette for PC-OB fysisk interaksjon. Som sådan, undersøkte vi effekten av høye konsentrasjoner av SOST
in vivo
. Vi fant ut at PC3-celler som overuttrykker SOST injisert via halevenen i NSG mus ikke lett metastasize, og de injiserte intrafemorally hadde betydelig redusert osteolyse, noe som tyder på at målretting den molekylære bein miljøet kan påvirke beinmetastatisk prognose i kliniske settinger.
Citation: Hudson BD, Hum NR, Thomas CB, Kohlgruber A, Sebastian A, Collette NM, et al. (2015) SOST Hemmer Prostate Cancer invasjon. PLoS ONE 10 (11): e0142058. doi: 10,1371 /journal.pone.0142058
Redaktør: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, USA
mottatt: 21 januar 2015; Godkjent: 17 oktober 2015; Publisert: 06.11.2015
Copyright: © 2015 Hudson et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: Microarray data er offentlig tilgjengelig på NCBI ved tiltredelse antall GSE56582
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Health Grant No. DK075730 og P41MI03483 Lawrence Livermore National Laboratory Grant No. LDRD-10-ERD-020. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PC) er den hyppigst diagnostisert kreft og den nest største årsaken til kreftrelaterte dødsfall blant menn i USA. Hvis oppdages på et tidlig stadium prognosen er ganske gunstig; imidlertid, aggressive former for metastatisk PC spres primært til skjelettet [1]. Bensvulster forårsake stor smerte, fremme frakturer, og til slutt representerer den viktigste årsaken til sykelighet hos pasienter som lider av avansert PC, med en 70% insidens dokumentert ved obduksjon [2]. De fleste pasienter med avansert PC vil oppleve store komplikasjoner fra benmetastaser preget av en blanding av osteoblastiske og osteolytiske lesjoner, der osteoblastiske komponent oftest dominerer. Det har vært en teori om at bein mikromiljøet er en stor bidragsyter til PC metastatisk prosessen gjennom utskillelsen av parakrine faktorer som tiltrekker, modulerer, beholde og fremme spredning av PC celler i bein. Derfor er kjennskap til den lokale benet mikromiljøet er vesentlige for å forstå mulige veier for å forhindre dannelsen av sekundære bentumorer i PC-pasienter [3].
Wnt signal har vist seg å spille mange viktige roller under embryonal utvikling, og organ vev homeostase, og ben biologi. Aktivering av Wnt /β-catenin signalering skjer ved binding av ligander wnt til den 7-transmembran domene-dekkende frizzled reseptoren kombinert med lav-densitet lipoprotein-reseptor-relatert protein 5 og 6 (LRP5 /6) co-reseptorer. Intracellulære signaler blir generert ved hjelp av et proteinkompleks som inkluderer i uorden, Axin og frat-1, som forstyrrer en GSK3-avhengig protein-komplekset som normalt inhiberer β-catenin funksjon ved å målrette den for nedbrytning. Stabilisert β-catenin blir så frigjort for å translocate til kjernen, hvor den virker sammen med andre transkripsjonelle aktivatorer slik som T-celle-faktor /lymfoid forsterker bindingsfaktor (TCF /LEF) for å aktivere transkripsjon. Binding av β-catenin senere fortrenger transkripsjons co-repressors bundet til TCF /LEF og rekrutterer transkripsjons co-aktivatorer som p300 og cAMP respons element-bindende protein [p300 /CBP]) [4]. Wnt signal er strengt regulert. Ett nivå av kontroll oppnås ved samvirkning av utskilte inhibitorer med ligander eller reseptorer for å hindre ligand-reseptor-interaksjon. Ligand blokkerer proteiner inkluderer Wnt hemmende faktor 1 (WIF1) og utskilt frizzled-relaterte proteiner (Sfrp). Samtidig er reseptor hemming oppnås ved medlemmer av sclerostin (SOST) og Dickkopf (DKK) familier [4, 5], primært gjennom binding til LRP5 /6 co-reseptorer.
Wnt feil som har vært innblandet i en rekke skjelettlidelser dysplasi og degenerative sykdommer. For eksempel taps og få-av funksjon mutasjoner i LRP5 årsaken enten lav eller høy benmasse [6, 7] og inaktivering av SOST fører to hyperosteoses sykdommer: sclerosteosis [8, 9] og van Buchem sykdom [10, 11]. Et tap-av-funksjon mutasjon i LRP6 er knyttet til en arvelig lidelse preget av osteoporose, koronarsykdom og metabolsk syndrom [12]. Videre mutasjoner i en intracellulær regulator av β-catenin stabilitet, WTX, føre osteopathia striata med kranie sklerose [13, 14] og mutasjoner i en Wnt co-reseptor, FZD9, føre Williams-Beuren, et syndrom delvis preget av lav bentetthet [15]. I tillegg har flere genom brede assosiasjonsstudier identifisert polymorfismer i Wnt-signale beslektede gener knyttet til endringer i bentetthet [16-18]. Dermed kan selv små endringer i intensiteten, amplitude og varighet av Wnt signal forstyrre utviklingen av skjelettet, benremodelleringen og bein regenerasjon.
Aberrant Wnt signal er også ofte observert i kreft og betydningen av denne veien stammer fra en opprinnelig observasjon at tumor suppressor adenomatøs polypose coli (APC) nedregulerer β-catenin. Mens tap av funksjon mutasjoner i Wnt signalveien gener er felles for flere kreftformer [19], har aktiveringen av Wnt signalering gjennom oppbygging av kjernefysisk β-catenin også blitt dokumentert for PC [5, 20]. Videre aktivatorer av Wnt signal har vært svært involvert i invasiv potensial av metastatisk kreft: Wnt5a [21], Wnt3a [22] og Wnt11 [23] har alle vist seg å endre kreft invasjon og migrasjon. Hemmere av Wnt signal også har blitt studert. Frzb (PC [24], fibrosarkom [25]) og WIF1 (PC [26] og kreft i urinblæren [27]), som modulerer Wnt signal ved å binde seg direkte til Wnt ligander, er begge kjente hemmere av kreft invasjon og migrasjon. Den mest undersøkte (og strids) virkning av en Wnt signal inhibitor på kreft invasjon /metastatisk potensial er av den reseptor-bindende protein, DKK1. DKK1 har vist seg å øke den invasive potensialet av spiserørskreft [28] og DKK1 antistoffer er blitt anvendt klinisk som et mål for passiv immunterapi [29]. Imidlertid DKK1 har også vist seg å hemme invasjon og migrasjon i tykktarmskreft [30], brystkreft [31], og PC3-celler [32], noe som indikerer kompleksiteten i å studere dette system
in vitro
. Interessant, har effekten av SOST på kreft invasjon /metastase aldri blitt undersøkt. Derfor, i dagens papir vi fokusert på rollen SOST i PC invasjonen. Spesielt undersøkte vi effekten av osteoblast-avledet Wnt signal på PC for å avgjøre om det er nødvendig med direkte virkningen av osteoblaster for moduler PC oppførsel.
Materialer og metoder
Dyr
Alle dyr arbeidet ble godkjent av Lawrence Livermore National Laboratory (LLNL) IACUC komiteen. LLNL er en AAALAC akkreditert institusjon.
Sost
KO Hotell og
Lrp5
KO
tidligere ble beskrevet [33, 34]. KO og C57BL /6J (WT) mus ble plassert i standardforhold og alle dyreforsøk ble gjennomført i henhold til NIH retningslinjer for bruk av dyr i henhold til godkjent IACUC protokoller ved Lawrence Livermore National Laboratory.
Cellelinjer og transfeksjon forhold
PC3, DU145, C4-2Bm, LNCaP celler hentet fra ATCC ble dyrket i DMEM; HPrEC ble hentet fra Lifeline Cell Technology og dyrket i Lifeline er ProstaLife Medium. Ekspresjonsplasmider (pCMV-DKK1, pCMV-SOST, pCMV-CRIM1) ble generert ved å erstatte reporter genet av pmKate2-N (Evrogen, Moskva, Russland) med full-lengde cDNA (Bilde Clones 3508222, 40009485, 8322423). Stabile PC3 transfections av pCMV-DKK1, pCMV-SOST, pmKate2-vektor ble utført ved hjelp Fugene 6 (Promega Corp., Madison, Wi.) I henhold til produsentens anvisninger; positive kloner ble bekreftet ved qPCR eller fluorescens. Muse primære osteoblaster (OB) ble samlet enzymatisk fra calvaria av 4-5 dager gamle valpene ligner Bellows et al. 1986 [35]. Dissekert calvaria fri for periosteum ble sekvensielt digerert 5 ganger ved 37 ° C i 4 ml kollagenaseoppløsning (Collagenase 1, 0,625 mg /ml; Collagenase B, 1,875 mg /ml; CaCl
2, 25 mM; i DDH
20 på is) blandet med 1: 2,5 media oppløsning (DMEM /F-12, 0,1% BSA, 25 mM Hepes, 37 ° C), og fraksjoner 2-5 ble oppsamlet. Isolerte OBS ble dyrket i DMEM /F-12 inneholder 10% FBS og 1% penn /strep.
Canonical Wnt signale analysen
TOPFlash (0,9 mikrogram) Wnt reporter plasmid (M50 Super 8x TOPFlash ) og Renilla luciferase kontroll plasmid (0,1 mikrogram) (RLTK) ble transfektert ved hjelp av tre ul Fugene HD (Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN) i henhold til produsentens protokoll. Etter 24 timer ble mediet i kulturer endret til nye medier eller media supplert med rekombinant protein. Co-kulturer av isolerte mus osteoblasts dyrket på 3 mikrometer pore innsatser (BD Falcon, katt # 3181) ble også introdusert til PC3 cellene på dette tidspunktet. Luciferasepreparater aktiviteter både Super 8x TOPFlash og RLTK journalister ble målt ved hjelp av en dual luciferase assay kit (Promega Corp.).
Co-kultur invasjon analysen
Invasion analysene ble utført ved hjelp av en modifisert Boyden kammer (BD biovitenskap). Matrigel (BD Bioscience) ble fortynnet 1: 2,5 i iskald DMEM (serumfritt) og 100 ul ble overført til det øvre kammer av en 8 um pore innsats (BD Falcon, cat # 3182) og tillatt å størkne i en inkubator i 2 timer ved 37 ° C. PC-celler ble sådd ut på innsatser på 2.5X10
4, og OBS i 12-brønners plater på 5×10
4; Cellene fikk såkornet. Etter en 4 timer inkubasjon i serumfritt medium, ble innsatser overført til 12-brønns plate inneholdende Obs. Cellene ble tellet ved 20X på et Zeiss mikroskop etter 48 timer. DU145, C4-2Bm, LnCap, og HPrEC celler ble tellet følgende farging i 1% krystall fiolett (Sigma) (30 min) etterfulgt av PBS-vaskinger. Invasion studier ble utført ved hjelp av vekstfaktorer [rhSOST (R D 1406-ST-025) 2.5-100ng /ml; rhDKK1 (R D 5439-DK-010) 10-400ng /ml; TGFB (R D 240-B-002) 10 ng /ml, WNT3A (R D 5036-WN-010) 100 ng /ml; PTH (R D 7665-PT-050) 10 nM og CRIM1 (R D 1917-C-050)], i kombinasjon med PC3 celler, co-kultivert i 48 timer. PC3 celler ble transient transfektert med pCMV-Crim1 plasmid hjelp Fugene 6 under invasjonen og Crim1 uttrykk ble verifisert ved qPCR [AGTTTCCAAGTCAGGATATGTGC (fwd); AGCATAACCCTCGATCAGAACA (rev) Crim 1 primere].
Mikromatriser
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp av en RNeasy Mini Kit, i henhold til produsentens retningslinjer (QIAGEN). Prøvene ble biotin merket og hybridisert on Human Genome U133 Plus 2,0 oligonukleotid arrays (PC3), i henhold til produsentens anbefalinger (Affymetrix, Santa Clara, CA. USA). Dataanalyse ble utført som tidligere beskrevet [36].
Immunfarging og aktin-farging
Immunofluorescent og phalloidin-TRITC-farging ble utført på celler fiksert i 4% paraformaldehyd i 15 minutter og permeabilisert med 0,1 % Triton X-100 i 5 minutter [anti-CRIM1 (HPA000556, Sigma) ved 1: 100; anti-Active-β-catenin (05-665, Millipore) ved 1: 1000]. For å farge for F-aktin, ble celler inkubert med 50 ug /ml phalloidin-TRITC (Sigma) i 40 min. Imaging ble gjort på Leica DM50000B og Zeiss LSM 510 Meta confocal mikroskoper. Maksimal intensitet anslagene ble utarbeidet etter ImageJ (NCBI).
Scanning elektronmikroskopi
PC3 celler (1X10
5) ble sådd ut på 13 mm dekkglass, deretter dyrket i 48 timer i serum frie medier med eller uten rekombinant protein. Cellene ble deretter fiksert i 4% paraformaldehyde og behandlet som tidligere beskrevet [37].
Xenotransplantat
PC3,
PC3
DKK1 Hotell og
PC3
SOST
-celler ble injisert inn i halevenen (IV) eller intrafemorally (IF) som tidligere beskrevet [38]. NSG (NOD.Cg-
Prkdc
SCID
Il2rg
tm1Wjl Twitter /SzJ) mus som fikk PC-celler IV (1X10
6) ble avlivet 10 uker etter injeksjonen og vev (lunge, ben, hjerte, lever, nyre, milt, og hjernen) ble oppsamlet og undersøkt med hensyn til nærvær av mikro tumorer. Mus som mottok PC-celler IF (1×10
5) ble avlivet 4 uker etter injeksjon, lårben ble dissekert (N = 6), røntgen, og benvolum av den proksimale halvdel av hver femur ble kvantifisert ved mikro beregnet tomografi (μCT 35, SCANCO, Brüttisellen, Sveits: energi 55 kVp, intensitet 114 mA, integrasjon tid 900 ms, 10 mikrometer nominell voxel størrelse).
Statistical Analysis
signifikante forskjeller ble undersøkt ved hjelp av ANOVA og paret t-test.
Post hoc
sammenligninger ble gjort ved hjelp av Tukey sin [39]. Sannsynlighetsverdier 0,05 ble tatt som betydelig. Sannsynlighetsverdier er vist i figurene tilsvarer *
p
0,05; **
p
0,01; ***
p
. 0,001
Diskusjon
Resultater og SOST hemmer prostatakreft invasivitet
For å undersøke effekten av Wnt inhibitor Sclerostin (Sost ) på invasiv potensialet i PC-celler, dyrket vi PC3 celler med rekombinant SOST (rhSOST) og målte deres invasivitet inn en matrigel (fig 1A) i forhold til Wnt3a [32], parathyroid-relatert protein (PTHrP) [40], og transformere vekstfaktor beta (TGFp) [41, 42] som ble behandlet PC3s. Vi undersøkte også Wnt antagonist DKK1, som er kjent til enten å fremme eller hemme invasjon kreft [28, 32, 43] i en kontekstavhengig måte. Wnt3a, PTHrP og TGFp øket PC3 invasiv potensial ved ~ 3 ganger (fig 1B) og DKK1 økt invasjon av syv ganger i forhold til PC3 alene, og 3,5 ganger i forhold til Wnt3a (figur 1B og 1I). I motsetning til dette hemmet rhSOST PC3 celle invasjon ved ~ 8-fold (fig 1B og 1J). Den økte invasivitet følgende WNT3a og DKK1 inkubasjon var konsistent i alle tre PC-cellelinjer undersøkt [(1) svært invasiv osteolytic lesjon-induserende PC3; (2) den meget inngripende osteoblastiske lesjon-induserende DU-145; (3) invasiv blandede fenotype C4-2Bm prostata kreft cellelinjer]. Videre rhSOST vesentlig hemmet invasiv potensialet av PC3-celler og avstumpet den Wnt3a-mediert invasivitet av DU145 og C4-2Bm-celler (figur 1C).
A, skjematisk fremstilling av invasjonen analysen. B, krenkende potensialet i PC3 celler etter 48 timer med co-kultur med rekombinante proteiner. C, effekten av rWNT3a, rDKK1, og rSOST på invasjonen av PC3, DU145, og C4-2Bm. D-E, doseresponskurve for PC3 celler til rSOST eller rDKK1. F-G, doseresponskurvene på PC3 celle invasjon når enten rDKK1 eller rSOST ble holdt konstant, og den andre ble gradvis øket. H-K, representative bilder av PC3-mKate celler etter co-kultur forhold. Resultatene er uttrykt som ganger endring ± SEM. * P 0,5, ** P 0,1, *** P. 0,01
For å bestemme dose respons og utvalgene av kompetitiv hemming vi utsatt PC3 celler til økende konsentrasjoner av rhSOST og rhDKK1 og målte rhSOST invasjon. Økende konsentrasjoner av rhSOST resulterte i en doseavhengig reduksjon i invasjon, med signifikant inhibering forekommer så lite som 2,5 ng /ml og metning ved 25 ng /ml (Fig 1 D). Tilsvarende rhDKK1 også endret invasjon i en doseavhengig måte; maksimal invasivitet ble observert ved 50 ng /ml (figur 1E). For å undersøke om rhSOST kunne modulere rhDKK1-indusert invasivitet vi co-dyrkede PC3 celler med 100 ng /ml rhDKK1 i kombinasjon med økende mengder rhSOST. Disse dataene indikerer at rhSOST blunts rhDKK1-indusert invasjon selv ved de laveste doser (Fig 1F). Low-end rhSOST konsentrasjonene som ble brukt var innenfor det forventede fysiologiske området av serum SOST nivåer [44]. I motsetning til dette øker den rhDKK1 konsentrasjonen bare var i stand til å overvinne rhSOST-mediert inhibering ved konsentrasjoner 200 ng /ml (figur 1G), hvilket antyder at SOST er en meget potent inhibitor av PC3 invasjon. Disse rhSOST hemmende effekter ble også visualisert i kulturer av PC3 celler som uttrykker den røde fluorescerende protein, pmKate2 (Fig 1J og 1K), der rhSOST dramatisk hemmet DKK1-mediert PC3 invasjons (Fig 1I og 1K).
PC3 celler co-kultivert med
Sost
kO
osteoblasts viser økt invasivitet
Neste vi undersøkt om primære osteoblaster (OB) med varierende grad av Wnt aktivitet kan modulere PC3 invasjon . For disse eksperimentene, osteoblasts isolert fra calvaria av
Sost
knockout (KO) (OB
SostKO
),
Lrp5
KO (OB
Lrp5KO
) eller C57BL /6N kontroll mus (OB
WT
) var co-kultivert uten fysisk kontakt med PC3 celler (figur 2A) og invasjonen ble vurdert både kvantitativt og visuelt. I samsvar med tidligere resultater, OB
WT
co-kulturen indusert en 2-ganger økning i PC3 invasjon. OBS mangler
Sost
økt PC3 invasjon av seks ganger, mens OBS mangler
Lrp5
reseptor avskaffet denne effekten, redusere invasjon til nivået av PC3 monokulturer. Disse dataene indikerer at OB lav-avledet Wnt signalering alene er tilstrekkelig til å dempe evnen til OB
WT
for å fremme PC3 invasjon,
in vitro plakater (Fig 2B-2F). I likhet med PC3 celler, DU145 og C4-2Bm celler også favoriserte OB
WT
mikromiljøet og lettere invadert inn i matrigel ved samtidig dyrket med OB
SostKO product: ( fig 2G og 2H). I tillegg OB
Lrp5KO
hemmet invasivitet av C4-2Bm, men bare litt avstumpet invasive av DU145 cellene, noe som tyder på at det i forbindelse med denne co-kulturen invasiv potensialet i DU145 cellene kan ikke helt avhengige av Wnt signalering og kan ansette andre molekylære stier (fig 2G og 2H). Verken relativt ikke-invasiv LNCaP cellelinje av lymfatisk metastaser opprinnelse eller de prostata epitelceller (HPrEC) ble påvirket av co-kultur med ONS (Fig 2I og 2j). Disse data indikerer at osteophilic PC cellelinjer er lett moduleres av benet mikromiljøet, og at små forandringer i mengden av OB-avledede Wnt signalering kan endre sitt invasive potensial,
in vitro
. I kontrast er LNCaP-celler som ikke lett metastaserer til benet ikke påvirket av modulerte nivåer av Wnt signalisering i nabo osteoblaster, noe som tyder på at prostata cancer metastaser i ben krever en gjensidig reaksjon fremmes av ben-kreft-interaksjon.
A, skjematisk fremstilling som viser OBS dyrket på bunnen av kammeret. B, krenkende potensialet i PC3 cellene mot kontroll OBS, OBS med forhøyet Wnt signal og OBS mangler Wnt signalering. C-F, representative bilder av PC3-mKate celler etter co-kultur forhold. G-J, krenkende potensialet i PCA celler med forskjellig osteolytic potensial mot hverandre OB. Resultatene er uttrykt som ganger endring ± SEM. * P 0,5, ** P 0,1, *** P. 0,01
rhDKK1 aktiverer Wnt signal i PC3 cellene
DKK1 og SOST er kjent hemmere av Wnt signalering i bein [45], men de har motstridende effekter på PC invasjonen (figur 1B). Vi neste undersøkt tilstanden Wnt signal i denne co-kultur invasjon modell. TopFlash reporter uttrykker utskilt Luciferase ble transfektert inn PC3 celler (PC3
CLucTF
). Wnt3a forbedret relativ luminescens i en dose- og tidsavhengig måte (fig S1). Co-kulturen i PC3
CLucTF
med OB
WT
eller OB
SostKO
betydelig økt reporter aktivitet, en effekt blokkert av rhSOST ( figur 3A). Co-kultur med OB
LRP5KO
hadde ingen signifikant effekt på Wnt signalering. Disse dataene tyder på at PC-celler kan stole på Wnt signal aktiviteten i omkringliggende bein miljøet og tap eller gevinst på Wnt signal i benet kan ha dyptgripende virkninger på Wnt signalaktiviteten i nabo /invaderende kreftceller. Selv om første rhDKK1 behandling trykt Wnt reporter aktivitet, det betydelig økt PC3
CLucTF
luciferase aktivitet ved 24 timer etter rhDKK1 administrasjon og senere tidspunkter (Fig 3B).
A, TopFlash reporter luciferase assay i PC3 celler co-dyrket med Obs. B, TopFlash reporter analysen i PC3 celler co-dyrket med DKK1. C-J, aktivert β-catenin (ABC) immunhistokjemi i PC3 cellene under flere forhold; grønt (ABC), blå (DAPI). Resultatene er uttrykt som ganger endring ± SEM. * P 0,5, ** P 0,1, *** P. 0,01
For å underbygge de mekanismene som er involvert i rhDKK1 Wnt agonist aktivitet på TopFlash reporter transgenet, vi neste undersøkt nivåer av aktiverte β -catenin (ABC) i PC3 celler etter en 48-timers co-kultur, via immunocytochemistry. PC3 celler alene uttrykt ubetydelig ABC (figur 3C). Administrasjon av rhWnt3a forbedret ABC signal innenfor både cytoplasma og i kjernen av PC3 celler (figur 3D) og denne effekten ble merkbart hemmet av rhSOST samtidig administrasjon (Fig 3E). I samsvar med den PC3
CLucTF
data, økt rhDKK1 ABC i PC3 celler (Fig 3F). PC3 celler co-dyrket med OB
WT
også økt ABC nivåer (Fig 3G), en effekt kraftig forbedret i OB
SostKO
co-kulturer (Fig 3H) og redusert i OB
LrpKO
co-kulturer (fig 3i). Videre samtidig administrasjon av både Wnt3A og DKK1 til PC3 celler resulterte i hyper aktivering av ABC i en undergruppe av PC3 celler, noe som tyder på en synergistisk og additiv effekt på aktivering av kanoniske Wnt signal i disse cellene. Disse resultatene markere betydningen av benet mikromiljøet på invaderende prostata kreft celler, og evnen til bein-avledet Wnt signal å aktivere Wnt signal i disse cellene. Korrelasjonen mellom høye DKK1 nivåer og økt β-catenin nivåer er konsistent med tidligere rapporterte data der pasient avledet svulster med forhøyet DKK1, β-catenin, eller begge hadde var mer sannsynlig å ha en dårlig levercellekarsinom prognose [46].
Filopodia dannelse økes i DKK1 og CRIM1 behandlede celler
Etter å ha fastslått at Sost-mangel OBS eller OBS behandlet med rhDKK1 øke PC3 invasivitet vi videre utforsket de delte molekylære endringer i disse co-kultivert PC3 cellene gjennom transkripsjon analyse. Vi sammenlignet genuttrykk endringer i PC3 celler co-dyrket med (1) OB
SostKO
, (2) OB
WT
+ rhDKK1, og (3) OB
WT
+ rhSOST (fig 4A). Vi fant 132 oppregulert gener og 30 downregulated gener i både OB
SostKO Hotell og OB
WT
+ rhDKK1 co-dyrket med PC3 celler (S1 Table). Blant disse transkripsjoner 21 ble oppregulert og 25 ble nedregulert i OB
WT
+ rhSOST PC3 co-kulturer (S2 Table). De oppregulert transkripter i sterkt invasive PC3-celler ble anriket for molekyler som har vist seg å være involvert i regulering av celleform, cellemigrering /motilitet, og celleadhesjon. Oppregulert gener som følger med:
sept7 product: [47],
myo10 product: [48],
PKP4 product: [49],
cnn3 product: [50],
Fgfr2 product: [51], og
crim1 product: [52] (figur 4B). Av spesiell interesse, det cysteinrike motor neuron protein 1 eller Crim1 er en enkelt-pass (type 1) transmembranprotein som nylig er blitt vist å kompleks med β-catenin og cadherins. Crim1 tap av funksjons eksperimenter i
Xenopus
avslørt Crim1 å være kritiske for celle-celle adhesjon under neural utvikling [52]. Forhøyede nivåer av β-catenin (Fig 3H) ledsaget av forhøyede nivåer av Crim1 (S1 Table) i co-kultivert PC3 celler førte oss til hypoteser som Crim1 kan oppregulert ved ben-avledet Wnt signalering og kan være involvert i å fremme celle invasjon og eller celle adhesjon.
En analyser microarray av PC3 celler co-dyrket med OB
SostKO
, OB
WT
+ rhDKK1, og OB
WT
+ rhSOST sammenlignet med monokulturer; overlegg representasjon av oppregulert (grønn) og nedregulert (røde) gener. B, representativ liste over oppregulert transkripsjoner. C, representative bilder av CRIM1 protein uttrykk modulering av rhDKK1 og rhSOST; grønn (CRIM1), blå (DAPI). Resultatene er uttrykt som ganger endring ± SEM. * P 0,5, ** P 0,1, *** P 0,01. D, PC3 transfektert med en CMV-Crim1 ekspresjonsvektor var signifikant mer invasive deretter PC3 celler (
p
-verdi 0,006).
For å finne ut om CRIM1 protein uttrykk moduleres av rhDKK1 og rhSOST, i samsvar med genuttrykk data, kvantifisert vi den relative fluorescensintensiteten av CRIM1 i PC3 celle behandlet med rhDKK1 og rhSOST. Vi fant rhDKK1 behandlede celler til å være 20% lysere [0,345 (PC3 + hrDKK1) vs 0,285 (PC3) mener fluorescens /celle] mens rhSOST behandlet PC3 celler var 85% dimmer [0,038 (PC3 + hrSOST) vs 0,285 (PC3) mener fluorescens /celle] enn ubehandlede PC3 celler (fig 4C). Videre er overekspresjon av CRIM1 protein [ 12 gangers overekspresjon som bestemt ved qPCR], i PC3 transfektert med et CMV-Crim1 konstruert viste en signifikant økning i invasjon (
p
verdi = 0,006), i transwell assay (fig 4D).
for å undersøke om effektene av DKK1 og CRIM1 på kreftcelle invasjon og metastasering er forbundet med actin filamenter, undersøkte vi morfologiske endringer i PC3 celler behandlet med rhDKK1 og rhSOST.
PC3
celler behandlet med DKK1 var langstrakt, viser fibroblast-lignende morfologi med mange flere filopodia anslag i forhold til enten ubehandlet eller rhSOST behandlet PC3 celler (figur 5A-5C), som var mer avrundet og hadde færre filopodia. Videre både ubehandlede og rhSOST behandlet PC3 celler levd mindre sterkt til plastoverflaten og tendens til å være mer klumpet seg sammen danner aggregater. Morfologisk utseende var i overensstemmelse med den underliggende cytoskeletal organisasjonen; phalloidin farging viste forbedret aktin organisasjon i rhDKK1 og rhWNT3A behandlet PC3 celler, i forhold til PC3 og rhSOST behandlede celler (figur 5D-5H). Tilsvarende eksogene tillegg av en utskilt form av CRIM1 også fremmet dannelsen av lamellipodia og filopodia, som visualiseres ved phalloidin-farget aktin i PC3 celler behandlet med CRIM1. Kollektivt, disse funnene tyder på at både DKK1 og CRIM1 fremme filopodia formasjonen i svært invasive PC3 celler og at denne prosessen er knyttet til omorganiseringen av actin filamenter.
AC, Representant SEM bilder (1500X) av PC3 celler behandlet med rhDKK1 (B, b), eller rhSOST (C, c). D-H, Immunofluorescens farging av PC3-celler behandlet med rhDKK1 (E), rhSOST (F), rhCRIM1 (G) og rhWNT3A (H); anti-CRIM1 (grønn) og rhodaminkonjugert phalloidin (blå).
SOST overekspresjon hemmer metastase og blunts osteolyse
For å avgjøre om SOST påvirker metastaser, NSG mus vi injisert intravenøst med PC3, PC3
DKK1
eller PC3
SOST Hotell og vev ble undersøkt for forekomst av svulster 10 uker etter injeksjonen. Intravenøs levering av PC3 celler resulterte i en 80% tumor rate (8/10 mus) med lunger og nyrer blir de hyppigste områdene av metastasering. PC3
DKK1
celler opptrådt svært lik PC3 celler, mens PC3
SOST
-injected mus hadde signifikant lavere forekomst av metastaser, med bare 1/9 mus (milt) viser synlig makroskopisk metastase 10 uker etter injeksjon (tabell 1). Disse data antydet at SOST-indusert hemming av Wnt signale reduserer PC3 invasjon og metastasering,
in vivo
betydelig. Neste vi undersøkt om overekspresjon av
SOST
i PC3 cellene reduserer osteolytic svulstdannelse. Ti NSG mus per gruppe fikk 5×10
5 PC3, PC3
DKK1
eller PC3
SOST
celler intrafemorally. Fire uker etter injeksjoner bein volumet ble kvantifisert ved hjelp av mikro-CT. Mens alle tre gruppene viste bentap og skade på den distale området der nålen ble satt inn for å levere kreftcellene, skanner viste dramatisk tap av bein i proksimale femur av PC3 og PC3
DKK1
, men betydelig mindre bentap i PC3
SOST
injisert lårben (fig 6A-6C). For å vurdere bentap forskjeller på grunn av osteolyse vi trukket benet volumet på PC injisert femur fra kontralateral injiserte femur og fant PC3
SOST celler for å indusere betydelig mindre bentap enn PC3 eller PC3
DKK1
. Disse funnene tyder på at overekspresjon av SOST i PC3 cellene blunts osteolyse og reduserer tumordannelse rate.
Representant femur mikro-CT-skanner fra
PC3 product: (A),
PC3
DKK1 product: (B) og
PC3
SOST product: (C) injisert NSG mus (N = 6 /gruppe). Benvolum ble kvantifisert for både PC injiserte og uinjiserte kontralaterale femur, og relativ bentap på grunn av osteolyse ble beregnet for hver gruppe ved å subtrahere den injiserte (L) fra uinjiserte (R) verdier (D).
PC
SOST
injisert lårben opplevde betydelig mindre bentap på grunn av avanserte osteolytiske lesjoner (* p 0,05)
Diskusjoner
i denne rapporten undersøkte vi de molekylære mekanismene som moduleres av Wnt signal som kan bidra til godt dokumentert høy tropisme av prostatakreft til bein, under metastase. Vi antok at benet stammer Wnt signal utløser genuttrykk endringer i kreftcellene som forbedrer deres tilknytning og homing til ben samt fremmer bein maligniteter. For å teste denne hypotesen, utsatte vi PC-celler til Wnt antagonister DKK1 og SOST, og fant DKK1 å fremme, og SOST å hemme PC invasjonen. Videre osteoblaster isolert fra
Sost
knockout mus hadde en potent positiv effekt på PC invasjonen; en effekt som ble dramatisk avstumpet ved tilsetning av rekombinant SOST protein.
