Abstract
Kreft i bukspyttkjertelen er en av de ledende kreftrelaterte dødsårsaker i den vestlige verden med et presserende behov for nye behandlingsstrategier. Nylig, hyperforin og nemorosone er blitt beskrevet som lovende anti-kreft blyforbindelser. Mens hyperforin har blitt grundig undersøkt
in vitro Hotell og
in vivo
,
in vivo
data for nemorosone er fortsatt savnet. Således undersøkte vi vekst-hemmende potensialet av nemorosone på kreft i bukspyttkjertelen xenotransplantater i NMRI-nu /nu-mus og bestemt grunnleggende farmakokinetiske parametere. Xenografttumorer ble behandlet med nemorosone og gemcitabin, dagens standard vare. Tumorsnitt ble utsatt for H E, samt kaspase 3 og Ki-67 farging. Nemorosone Plasmakinetikken ble bestemt ved HPLC og massespektrometri. Induksjon av CYP3A4 og andre enzymer ved nemorosone og hyperforin ble testet på primære hepatocytter ved hjelp QRT-PCR. Ved en dose på 50 mg /kg nemorosone per dag, ble en betydelig vekst-inhibitorisk effekt ble observert i kreft i bukspyttkjertelen xenotransplantater. Forbindelsen ble godt tolerert og hurtig absorberes i blodstrømmen med en halveringstid på ca. 30 min. Ulike metabolitter ble oppdaget, muligens likner CYP3A4-uavhengig oksidasjonsprodukter. Det konkluderes med at nemorosone er en potensiell anti-kreft blyforbindelse med god biotilgjengelighet, lite bivirkninger og lovende vekst-inhiberende effekter, således som representerer en verdifull forbindelse for en kombinasjonsterapi tilnærming
relasjon:. Wolf RJ, Hilger RA, Hoheisel JD, Werner J, Holtrup F (2013)
In Vivo
aktivitet og farmakokinetikk av Nemorosone på kreft i bukspyttkjertelen xenografter. PLoS ONE 8 (9): e74555. doi: 10,1371 /journal.pone.0074555
Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 7 juli 2013, Godkjent: 02.08.2013; Publisert: 05.09.2013
Copyright: © 2013 Wolf et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansielt støttet av en tre års stipendiatstilling fra Helmholtz International Graduate School for kreftforskning til FH. Finansiering fra det tyske føderale Kunnskapsdepartementet som en del av NGFN PaCaNet konsortiet er takknemlig erkjent. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
til tross for mange fremskritt innen kreftforskning og behandling, forblir bukspyttkjertelkreft en av de mest utfordrende svulster, med sin dødeligheten nesten matche insidensraten [1]. Dette er hovedsakelig på grunn av vanskeligheter i å diagnostisere kreft i bukspyttkjertelen i et tidlig stadium resectable og dens uttalt kjemoterapi-motstand. Således, mer enn 80% av pasientene til stede med et avansert stadium tumor allerede spredning til regionale lymfeknuter og leveren [2]. Gemcitabin, dagens standard vare for kreft i bukspyttkjertelen, forbedrer bare moderat median overlevelse ganger mellom 5 og 6 måneder [3], og dermed understreker behovet for å utforske nye terapeutiske forbindelser.
polysykliske polyprenylated acylphloroglucinols (PPAPs) er en klasse av forbindelser med forskjellige biologiske aktiviteter som strekker seg fra anti-beroligende, anti-kreft og anti-inflammatorisk anti-mikrobiell aktivitet [4]. Blant dem, hyperforin (figur 1), et middel fra johannesurt (
Hypericum
perforatum
), har fått offentlig interesse som et populært antidepressive av naturlig opprinnelse med en ny mekanisme virknings [5]. Det har også vist seg å ha anti-kreft egenskaper
in vitro Hotell og
in vivo product: [6-8]. Imidlertid via binding til den pregnan X reseptor (PXR), oppregulerer hyperforin sterkt ekspresjonen av CYP3A4, et medlem av cytokrom P450-familien som er involvert i metabolismen xenobiotika [9]. Dermed, hvis kombinert med chemo-terapeutiske legemidler som metaboliseres av CYP3A4, hyperforin vil sterkt redusere effekten av en potensiell anti-kreft kombinasjonsbehandling tilnærming siden det akselererer metabolization av stoffet (e) det er kombinert med.
Nært relaterte kjemiske strukturer av hyperforin (til venstre) og nemorosone (til høyre), to polysykliske polyprenylated acylphloroglucinols.
å være strukturelt relatert til hyperforin, har uttalt anti-kreft egenskaper også blitt demonstrert
in vitro
for nemorosone (figur 1) på cellelinjer av forskjellig opprinnelse, blant dem neuroblastom og leukemi [10,11]. Mer detaljerte analyser av virkningsmekanismen på kreft i bukspyttkjertelen celler viste rask heving av cyctosolic kalsiumnivåer og depolarisering av mitokondriemembranen etterfulgt av aktivering av apoptose via en stressrespons sti kjent som utfoldet protein respons [12]. Interessant nok ble differensierte normale celler funnet å være 10 ganger mindre følsomme overfor en behandling med nemorosone, og dermed åpne en potensiell terapeutisk vindu for å utforske også sin anti-kreft-aktivitet
in vivo
.
I denne studien, viser vi at, i motsetning til hyperforin, betyr nemorosone ikke indusere CYP3A4 og undersøke den biologiske aktivitet samt grunnleggende farmakokinetikk
in vivo
i en bukspyttkjertelkreft xenograft modell. Det er vist at nemorosone absorberes raskt i blodet og i stand til å hemme veksten av xenografttumorer.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av komité for etikk av dyreforsøk av Regionrådet Karlsruhe, Tyskland (Permit Number: G-204/09). Alle operasjoner ble utført under xylazine /ketamin anestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse.
Implantasjon og behandling av xenografttumorer
Seks til åtte uker gammel kvinnelig atymiske NMRI nu /nu hårløse mus (Charles River Laboratories, Sulzfeld, Tyskland) ble plassert i grupper på 4-6 i individuelt ventilerte bur (IVCs; Techniplast, Tyskland) ved 22 ° C med en 12 timers lys /mørke syklus og lov til å tilpasse seg de boforhold for en uke før implantasjon av tumorer. MIA PACA-2-celler ble opprettholdt som tidligere beskrevet [12], og 200 pl av en cellesuspensjon (2 x 10 ~
6) ble injisert s.c. inn i den høyre flanken til hver mus for å etablere subkutane xenograft tumorer. Tumor volum ble regelmessig overvåket ved hjelp av en digital caliper, og dyrene ble tilfeldig inndelt i behandlings- og kontrollgrupper når bety tumorvolumet nådd ca 100 mm
3.
Nemorosone, renset fra metanoliske blomst ekstrakter som rapportert tidligere [ ,,,0],12], ble oppløst i dimetylsulfoksid (DMSO) ved 50 mg /ml, og gemcitabin-hydroklorid (Eli Lilly, Tyskland) ble oppløst i 0,9% NaCl-oppløsning. Injiserbare løsninger ble sterilfiltrert og administrert intraperitonealt (i.p.) under anvendelse av 0,3 ml insulinsprøyter (Becton Dickinson, Tyskland) etter sterilisering av injeksjonsstedet. Kroppsvekten ble kontrollert på en daglig basis før i.p. injeksjon. 1 ul /g kroppsvekt ble injisert for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 50 og 120 mg /kg for nemorosone og gemcitabin, respektivt. Nemorosone ble injisert én gang daglig, mens for gemcitabin standard behandling planen for hver tredje dag i fire sykluser ble brukt [13].
immunhistokjemisk farging av xenografttumorer
En dag etter siste behandling, mus ble avlivet ved cervikal dislokasjon og xenograft tumorer ble tatt reseksjon, hurtigfrosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C. Svulster ble montert i en cryomicrotome (Leica, Tyskland) ved -25 ° C og 5 um stykker ble samlet fra tumormarginer og sentrene som skal overføres til glassplater
For hematoksylin og eosin (H E). Farging , tumorsnitt ble fiksert i 5 s i aceton ved -20 ° C, tørket og farget i hematoksylin (Carl Roth, Tyskland) i 15 s og sure 1,5% eosin i 96% EtOH (Merck, Tyskland) i 4 s. Etter dehydrering ved påfølgende inkubasjon i 70%, 96% og 2 x 100% EtOH, farging ble løst i RotiClear oppløsning (Carl Roth, Tyskland), og dekkglassene ble montert i overordnede monteringsmedium (DAKO, USA).
For immunhistokjemisk farging med Ki-67 og aktiv kaspase 3 antistoffer, seksjonene ble blokkert med 3% peroksidase i metanol etter fiksering i kaldt aceton og vasking i tris-bufret Sline (TBS) supplert med 0,1% (w /v) bovint serumalbumin (BSA). Etter et vasketrinn ble snittene inkubert over natten ved 4 ° C i 1: 100 fortynninger av kanin-anti-human Ki-67 eller aktiv kaspase 3 antistoffer (DAKO, USA) i TBS /0,1% BSA. Platene ble vasket i TBS /0,1% BSA supplert med 0,1% (v /v) Tween-20 og deretter i TBS /0,1% BSA før tilsetning av heste raddish (HRP) -konjugert geite-anti-kanin-IgG sekundært antistoff (DAKO , USA) i 45 minutter ved romtemperatur. Etter vasking ble snittene farget med væske 3,3 «diaminobenzidin (DAB) kromogen fortynnet 1: 500 i substrat buffer (DAKO, USA). Fargeutvikling ble overvåket mikroskopisk og stoppet i dH
2o. Seksjonene ble deretter kontra i hematoxylin, dehydrert og montert som nevnt ovenfor.
Analyse av nemorosone farmakokinetikk
50 mg /kg nemorosone ble administrert intraperitonealt og mus ble bedøvet med 7 mg /kg xylazin og 100 mg /kg ketamin 5, 20, 40, 60, 80, 100 og 120 minutter etter påføring av nemorosone. Blod ble trukket inn i hepariniserte sprøyter av hjerte tegnsetting og deretter sentrifugert i 10 minutter ved 16 000 x g for å fremstille plasma. Nemorosone ble ekstrahert fra plasma ved tilsetning av 400 ul acetonitril (ACN) i 100 pl plasma og sentrifugering ved 21 000 x g i 5 min ved romtemperatur. Supernatanten ble overført til en ny beholder, og konsentrert i vakuum konsentratoren. Den resulterende pellet ble oppløst i løsningsmidlet for høytrykks-væskekromatografi (HPLC) analyse (50% H
2o, 30% MeOH, 20% ACN). 10 ul av hver prøve ble injisert for analyse på en Waters 2690 HPLC-system (Waters, Tyskland) utstyrt med en 996 PDA og en ZQ2000 ESI-MS detektor (Waters, Tyskland). Separasjon ble utført ved anvendelse av en C18 symmetri reversert-fase-kolonne (5 um porestørrelse, 4,2 x 250 mm; Waters, Tyskland) og en konstant strømningshastighet på 1 ml /min ved anvendelse av en oppløsningsmiddel-gradient. Nemorosone absorbans ble registrert ved 303 nm.
Nemorosone topparealet i kromatogrammet ble kvantifisert ved hjelp av en kalibreringskurve (fig S3) avledet fra humane plasmaprøver tilsatt definerte konsentrasjoner av nemorosone (10 ng /ml til 100 ug /ml). HPLC chromatograms ble analysert ved hjelp av Empower 2-programvaren, og nemorosone plasmakonsentrasjonskinetikk etter i.p. injeksjon ble montert ved hjelp topfit 2.0 [14] under forutsetning av en to-kupé disposisjon etter en one-segment absorpsjon.
Analyse av uttrykk endringer av enzymer i primære humane hepatocytter
Om 7,5 × 10
5 primære humane hepatocytter (Zen-Bio, NC, USA) ble sådd ut i hver brønn av en kollagen i-belagt 12-brønn cellekultur plate i platekledning medium (Zen-Bio, NC, USA) og lov til å fest for 10 timer. Pletteringsmedium ble byttet ut med opprettholdelsesmedium (Zen-Bio, NC, USA) og celler ble dyrket til 80% konfluens før inkubering med 0,5 og 1 pM nemorosone og hyperforin dicyclohexylammonium salt (Sigma Aldrich, Tyskland) eller 10 pM rifampicin (Sigma Aldrich , Tyskland) i 48 timer. Cellene ble så høstet ved trypsinering, og total RNA ble isolert med en RNeasy Mini Kit (Qiagen, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. RNA ble underkastet kvantitativ real-time PCR-analyse ved bruk av QuantiFast SYBR grønn RT-PCR kit (Qiagen, Tyskland) og QuantiTect primere (Qiagen, Tyskland) som tidligere beskrevet [12].
Statistiske tester
Alle forsøk ble utført i det minste i tre paralleller, med mindre annet er angitt. For alle forsøkene, ble t-test (i Sigmaplot 10,0) som brukes for betydningen analyse av forskjellen mellom to grupper.
Resultater
Nemorosone ikke induserer CYP3A4 uttrykk i primære humane hepatocytter
metabolisering er en viktig del av de farmakokinetiske egenskapene til et medikament. De fleste xenobiotics metaboliseres via cytokrom P450 (CYP) familie i leveren etter å ha blitt oppdaget av kjernereseptorer [15-17]. Å være strukturelt svært lik nemorosone, hyperforin (figur 1) har vist seg å indusere CYP3A4 uttrykk ved å binde den pregnan X atom reseptor (PXR) og dermed en raskere metabolisme av legemidler gitt samtidig med hyperforin [9,18]. For å teste om også nemorosone oppdages av PXR og induserer ekspresjon av CYP3A4 samt andre viktige narkotika enzymer, primære humane hepatocytter ble dyrket i nærvær av nemorosone, hyperforin og rifampicin, et stoff kjent for å indusere CYP3A4 uttrykk ved binding til PXR-reseptoren (positiv kontroll). Etter 48 timers inkubering ble RNA ekstrahert fra hepatocytter og underkastet QRT-PCR-analyse for å vurdere ekspresjonen av utvalgte enzymer.
Primære humane hepatocytter ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av rifampicin, hyperforin, nemorosone eller kjøretøy bare. RNA ble ekstrahert etter 48 timer og underkastet QRT-PCR-analyse for å detektere endringer i uttrykk av utvalgte gener involvert i legemiddelmetabolisme. Expression verdier står i forhold til bilen kontroll og representerer middel ± SD av tredoble målinger.
Figur 2 viser at behandling av humane hepatocytter med hyperforin og rifampicin førte til en betydelig oppregulering av
CYP3A4
genekspresjon på 15 til 20 ganger sammenlignet med bærerkontroll. I motsetning til det, behandling med en mikrometer nemorosone bare indusert
CYP3A4
uttrykk tre ganger, mens det var nesten ingen induksjon ved behandling med 0,5 mikrometer nemorosone. Hyperforin behandling også litt oppregulert
CYP1A2
,
CYP1B1 Hotell og
CYP2B6
uttrykk, men det var ingen endring påvises for andre testet enzymer som aldehyd dehydrogenase 1A1 (ALDH1A1 ), epoksid hydrolase 1 (EPHX1) eller glutation S-transferase A2 (GSTA2). Således kan den hypotese fra disse data at hyperforin hovedsakelig metabolisert av CYP3A4 etter å ha blitt avfølt av PXR. Selv om å være strukturelt lik hyperforin, betyr nemorosone ikke synes å binde PXR og således enzymer er bare svakt induseres gjengivelse nemorosone potensielt nyttig i en anti-cancer kombinasjonsterapi tilnærming.
Nemorosone hemmer veksten av xenografttumorer in vivo
Figur 3 viser at daglig injeksjon av 50 mg /kg nemorosone resulterte i en betydelig og fullstendig opphevelse av tumorveksten sammenlignet med gjennomsnittet av kontroll tumorer som økte 5 ganger i volum. En lignende effekt ble observert i kontrollgruppen mottok 120 mg /kg gemcitabin. På samme tid, behandling med nemorosone viste en god toleranse, fordi kroppsvekt forble stabil over behandlingsperioden på 28 dager (Figur S1). Imidlertid må det bemerkes at dyrene som fikk nemorosone begynte å hyperventilere, kort tid etter injeksjon. Normal respirasjon ble restaurert igjen 5-10 minutter etter intraperitoneal søknad.
For å undersøke histologiske effekter av nemorosone behandling ble dyrene avlivet etter behandlingsperioden og svulster ble skåret ut. Behandlede og kontroll Vevet ble deretter farget for apoptose og sprednings markører.
Histologiske forskjeller mellom behandlede og kontroll tumorer var synlige i H deteksjon ved 303 nm)
Mus ble behandlet med daglig i.p.. injeksjoner av 50 mg /kg nemorosone, kjøretøy bare eller 120 mg /kg gemcitabin på angitte tidspunkter (grønne prikker). Tumor volum ble målt 2-3 ganger per uke ved hjelp av en digital caliper. Verdier representerer gjennomsnitt ± SD av 8 dyr per gruppe
* p 0,05, ** p 0,01 (i forhold til bilen kontroll).
Fem minutter etter i.p. søknad, ca 40 mikrogram /ml (80 mm) nemorosone ble påvist i mus plasma, som peker mot en svært rask absorpsjon i blodet (figur 5A). På det samme tidspunkt, ble 7 flere topper som ligner mulige metabolitter funnet i HPLC-kromatogrammet (figur 5A, Fig S2). Imidlertid, ble plasmakonsentrasjonen av mulige metabolitter (M01-M09) beregnet til å være 20 til 200 ganger lavere enn den for nemorosone. Over den observerte tid på 120 min, nedsatt nemorosone plasmakonsentrasjon logaritmisk fra 40 til 2,7 ug /ml med en halveringstid på ca. 30 min. Farmakokinetikk nemorosone etter i.p. applikasjon ble funnet å være best beskrives ved en to-disposisjonsmodell som gir et bifasisk linje i log-skala plottet i Figur 5B. Ifølge denne modellen er nemorosone raskt absorbert og fordelt i blodet i løpet av de første 10 min etter injeksjon. 20 minutter etter påføring, synes eliminering å være den dominerende fremgangsmåten karakteriseres ved den rette linje montert. Imidlertid må det bemerkes at prosessene forut for 5 min tidspunkt (absorpsjon og fordeling) ble antatt og krever ytterligere bekreftelse på en mer detaljert studie. Således kan toppkonsentrasjon i løpet av de første minuttene være mye høyere (~ 100 ug /ml)
Deler av 5 um av nemorosone-behandlede og kontroll tumorer ble farget med hematoksylin-eosin (H . E, A og B) eller immunhistokjemisk analysert med antistoffer rettet mot aktiv kaspase 3 (C og D) eller Ki-67 (E og F). Behandlede tumorer viste redusert tumormasse på grunn av apoptose /nekrose (sorte piler) og et lavere antall prolifererende celler sammenlignet med kontrollgruppen (mørkbrune celler).
Plasmaprøver ble tatt ved forhånds definerte tidspunkter etter ip anvendelse av 50 mg /kg nemorosone. Nemorosone og dens metabolitter ble kvantifisert ved RP-HPLC ved hjelp av en kalibreringskurve (fig S3). (A) plasmakonsentrasjon av nemorosone (øvre grønn linje) og dets potensielle metabolitter (M01 til M09). (B) Farmakokinetikk av nemorosone ble best beskrevet av en to-kupé modell med en halveringstid på 30 min.
identitet nemorosone ble ytterligere bekreftet ved en ESI massespektrometri detektoren viser molekyl topper for proton nemorosone og dens natrium- og kaliumsalter (fig S4). Videre ble massen av molekylet toppene av visse metabolitter funnet å være økt med 16 u, noe som tyder på at oksydasjon av nemorosone kan være en av de viktigste metabolisering trinn. Men på grunn av den lave oppløsningen av ESI-MS-detektor, strukturen av nemorosone metabolitter ble ikke karakterisert i detalj.
diskusjon
Hyperforin og nemorosone er blant de mest studerte medlemmer mangfoldig klasse av polysykliske polyprenylated acylphloroglucinols og begge anses blyforbindelser for utviklingen av kreftbehandling [4,6,12,19]. Men inntil nå kreft aktivitet
in vivo
har bare blitt demonstrert for hyperforin men ikke for nemorosone [6]. Dermed denne pilotstudien til hensikt å evaluere aktiviteten nemorosone mot bukspyttkjertelkreft xenografttumorer
in vivo
samt identifisere grunnleggende farmakokinetiske parametere som absorpsjonskinetikken og metabolization.
Våre resultater indikerer at nemorosone potente hemmer veksten av kreft i bukspyttkjertelen xenografter
in vivo Hotell og ser ut til å være enda mer effektive enn dagens standardbehandling gemcitabin (figur 3). Mens den administrerte nemorosone dose på 50 mg /kg pr dag ble godt tolerert i løpet av behandlingsperioden ble det observert hyperventilering direkte etter påføring av nemorosone indikerer noen systemisk aktivitet av denne forbindelsen direkte etter absorpsjon i blodet. Lignende observasjoner ble gjort for humulon, et strukturelt beslektede forbindelse isolert fra humle, etter intravenøs injeksjon i katter [20]. Dette indikerer sammenlignbare farmakodynamiske egenskaper som kan være på grunn av virkningen av disse forbindelser på kalsium homeostase i muskler. Denne hypotese understøttes av det øyeblikkelige nemorosone-indusert forstyrrelse av celle kalsiumhomøostase observert
in vitro product: [12]
Effekt av behandling på nemorosone xenograft tumorer ble bekreftet ved H . E farging av vev seksjoner samt immunhistokjemisk farging av aktiv kaspase 3 og formeringen markeringen Ki-67. Nemorosone-behandlede MIA-PACA-2 tumorer oppviste mer nekrotisk og /eller apoptotiske regioner, som var assosiert med forhøyet kaspase 3 aktivitet og et lavere antall prolifererende celler som uttrykker Ki-67, i samsvar med resultatene oppnådd i MIA-PACA-2-celler
in vitro product: [12].
Måling av plasmakinetikk etter ip injeksjon av 50 mg /kg nemorosone bekreftet biotilgjengelighet og absorpsjon av forbindelsen i blodstrømmen (figur 5). Fem minutter etter injeksjonen ble nemorosone plasmakonsentrasjon funnet å være 40 ug /ml (80 um) med logaritmisk eliminering dominerende 20 min etter injeksjon og nemorosone viser en plasmahalveringstid på omtrent 30 min. Målte verdier for plasmakinetikk ble beste utstyrt forutsatt en to-disposisjonsmodell som også observert i noen farmakokinetiske studier av hyperforin plasmakonsentrasjon ved oral administrasjon [21,22]. Beregnet maksimal plasmakonsentrasjon på nemorosone var ~ 100 mikrometer. Således, tatt i betraktning den høye dose i løpet av den første 5-10 min etter påføringen, den observerte akutte hyperventilering kan forklares ved nemorosone reversibelt å interferere med friske celler mellom maksimal plasmakonsentrasjon og utbruddet av eliminasjonsfase ca 10 minutter senere.
totalt 9 mulige metabolitter ble påvist i mus plasma, de fleste av dem var allerede til stede på 5 min etter ip injeksjon (figurene 5 og S2). Dette peker mot en rask metabolisering av nemorosone, i samsvar med den beregnede halveringstid på bare 30 minutter. Dessverre, strukturen av metabolitter ikke kunne oppnås på grunn av den lave oppløsning av ESI-MS detektor. Men tatt i betraktning det faktum at de observerte retensjonstider i RP-HPLC-kromatogram er lavere for alle metabolittene i forhold til nemorosone, oksidasjon eller hydroksylering prosesser kan antas. Denne antagelsen er videre støttet av det faktum at, sammenlignet med nemorosone, blir massen av utvalgte metabolitter økte med 16 u, den molekylære massen av oksygen (figur S4). For å få detaljert strukturell informasjon om metabolittene, en LC /ESI-MS system med høyere oppløsning eller en innledende tilnærming for NMR-analyse må etableres. Begge metoder har blitt anvendt for å hyperforin metabolisert i rottelever-mikrosomale systemer og resulterte i identifisering av fire hyperforin- metabolitter, hver hydroksylert ved terminalen metylengruppen av en av de fire sidekjedene prenyl [23]. Forfatterne spekulert i at to rotte cytokrom P450 isoformene ortolog til menneskelig CYP3A4 var hovedsakelig involvert i metaboliseringen av hyperforin. Dette er i overensstemmelse med det faktum at hyperforin induserer ekspresjon av
CYP3A4 via
binding til pregnan X reseptor (PXR) [9,24].
CYP3A4
ekspresjon ble også funnet å være sterkt indusert av hyperforin og rifampicin, en substans kjent for å aktivere PXR, ved behandling av humane primære hepatocytter i denne undersøkelsen (figur 2). Interessant, nemorosone var bare moderat effektiv i å indusere
CYP3A4
uttrykk: Inkubasjon av hepatocytter med en mikrometer nemorosone bare resulterte i en tre-dobling av
CYP3A4
mRNA i forhold til en 15-dobling på inkubasjon med en mikrometer hyperforin. Dette resultat er overraskende med tanke på svært fleksibel ligandbindende hulrommet i PXR som er blitt vist å binde alle hyperforin [24,25]. Dermed gis det nære strukturelle forhold til hyperforin, den PXR bør forventes også å binde og indusere
CYP3A4
uttrykk ved ekvimolare nemorosone konsentrasjoner. Dette synes ikke å være tilfelle, og gjør således høyere konsentrasjoner av nemorosone for kreftbehandling å foretrekke fremfor de av hyperforin hvor flere legemiddelinteraksjoner relatert til induksjon av CYP3A4 er blitt rapportert [9,18]. Tatt i betraktning det faktum at en forhøyet PXR uttrykk har også blitt observert i ulike bukspyttkjertelen celler [26], er mer sannsynlig å være vellykket med nemorosone snarere enn hyperforin behandling av bukspyttkjertelkreft med en kombinasjonsbehandling tilnærming.
I konklusjonen, vår studie viser en betydelig vekst-hemmende effekt av nemorosone på kreft i bukspyttkjertelen xenografter som samtidig er godt tolerert. Grunnleggende farmakokinetiske analyser antyder at nemorosone absorberes raskt og metabolisert via oksidasjon i en CYP3A4-uavhengig måte. Dette gjør nemorosone en svært lovende lead compound for kombinasjonsbehandlinger. Derfor bør mer detaljerte studier på ortotopiske xenograft modeller og analyser av høyere oppløsning gjennomføres.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
kroppsvekt av behandlede og kontrollmus. Kroppsvekt av behandlede og kontrollmus ble rutinemessig bestemt på en daglig basis før i.p. injeksjon. Verdier representerer gjennomsnitt ± SD av 8 dyr per gruppe
doi:. 10,1371 /journal.pone.0074555.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
HPLC kromatogrammer av nemorosone og dets metabolitter funnet i plasma. Overlegg av utvalgte HPLC kromatogrammer (deteksjon ved 303 nm) av mus (grønn) og menneske (blå) plasmaprøver samt humant plasma tilsatt 100 ng /ml nemorosone (rød) og mus plasma 5 min etter i.p. anvendelse av nemorosone (svart) er vist
doi:. 10,1371 /journal.pone.0074555.s002 plakater (TIF)
Figur S3.
Standard rad av humant plasma tilsatt økende nemorosone konsentrasjoner. En kalibrerings linje for nemorosone tilsatt i humane plasmaprøver ble beregnet og løpe parallelt med prøver ekstrahert fra museplasma for å tillate kvantifisering av nemorosone
doi:. 10,1371 /journal.pone.0074555.s003 plakater (TIF)
Figur S4.
ESI-MS spektra av nemorosone og utvalgte metabolitter. ESI-MS-spektra ble registrert for hver topp, og spektrene for nemorosone så vel som for metabolitter M01, M06 og M08 er vist. De molekyl ion toppene av protonert nemorosone (m /z = 503,2) så vel som dens natrium (m /z = 525,2) og kalium (m /z = 541.1) salter er markert med sorte piler. Potensielt oksidert nemorosone natrium (m /z = 541,1) og kalium (m /z = 557.2) salter er merket med grå piler
doi:. 10,1371 /journal.pone.0074555.s004 plakater (TIF)
Takk
forfatterne er takknemlige til DKFZ Laboratory Animal Facility og Sven Ruffer for teknisk hjelp under cellekultur og dyr arbeidet samt Dr. Shereen Keleg, European Pancreas Center, Heidelberg, for hennes hjelp med immunhistokjemisk farging.
