Abstract
Tumor utvikling krever angiogenese og anti-angiogene terapier har blitt innført i behandling av kreft. I denne sammenheng, heparan sulfat proteoglykaner (HSPGs) fremstå som interessante mål, på grunn av sin funksjon som co-reseptorer for store, pro-angiogene faktorer. Følgelig har tidligere studier antydet anti-tumor effekten av heparin,
dvs.
over-sulfaterte HS, og forskjellige heparin-etterligninger.; derimot, er en betydelig ulempe deres uspesifikke virkningsmekanisme og potensielt alvorlige bivirkninger relatert til deres antikoagulerende egenskaper. Her har vi undersøkt bruken av humane scFv anti-HS antistoffer (αHS) som en mer rasjonell tilnærming til målet HSPG funksjon i endotelceller (ECS). αHS ble opprinnelig valgt for sin anerkjennelse av HS epitoper lokalisert fortrinnsvis til blodkar av pasient glioblastom svulster,
dvs.
svært angiogene hjernesvulster. Uventet, fant vi at disse αHS utstilt potente pro-angiogene effekter i primære humane egenkapitalbevis. αHS ble vist å stimulere EC differensiering, som var assosiert med øket EC-rør-dannelse og proliferasjon. Videre αHS støttet EC overlevelse etter hypoksi og sult,
vil si.
Forhold typisk av svulsten mikromiljøet. Viktigere, αHS-mediert spredning ble effektivt motvirket av heparin og var fraværende i HSPG-mangel mutante celler, bekrefter HS-spesifikke effekter. På et mekanistisk nivå, binding av αHS til HSPGs av egenkapitalbevis samt glioblastom celler ble funnet å utløse p38 MAPK-avhengige signalering som resulterer i økt spredning. Vi konkluderer med at flere αHS som gjenkjenner HS epitoper rikelig i svulsten blodkar kan lokke fram en pro-angiogen respons, noe som har betydning for utvikling av antistoffbasert målretting av HSPGs i kreft
Citation. Christianson HC, van Kuppevelt TH, remmer M (2012) scFv Anti-heparansulfat Antistoffer Uventet Aktiver endotelceller og kreftceller gjennom p38 MAPK: implikasjoner for antistoff-basert målretting av heparansulfat Proteoglycans i Cancer. PLoS ONE 7 (11): e49092. doi: 10,1371 /journal.pone.0049092
Redaktør: Ramani Ramchandran, Medical College of Wisconsin, USA
mottatt: 21. august 2012; Godkjent: 08.10.2012; Publisert: 09.11.2012
Copyright: © 2012 Christianson et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra det svenske Cancer Fund; Vetenskapsrådet; den svenske Society of Medicine; den physiographic Society, Lund; de Gunnar Nilsson, Lundgren og Kamprad Foundations; de Skåne universitetssykehus gavemidlene; og den offentlige satsingen på klinisk forskning innenfor de nasjonale helsetjenestene (ALF). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
progresjon fra ondartet transformasjon til manifest svulst utvikling krever rekruttering av blodårer,
dvs.
angiogene bryter [1], [2]. Angiogenese er en flertrinnsprosess er avhengig av endotel (EF) proliferasjon, migrering inn i det omgivende vev og til slutt differensiering i et nytt fartøy. Binding av flere angiogene faktorer,
f.eks
VEGF-A, FGF, og HB-EGF til heparansulfat (HS) polysakkaridkjeder understreker viktigheten av HS proteoglykaner (PGS) i EF biologi [3] – [5] . HSPGs virker som ko-reseptorer som er tilstede vekstfaktorer til sin høye affinitet tyrosin kinase signale reseptorer på celleoverflaten [6], [7]. Omfattende postsynthetic modifikasjoner av de lineære HS kjeder, bestående av repeterende N-acetylglukosamin og glukuronsyre disakkaridenheter, omfatter sulfatering ved forskjellige posisjoner langs kjeden, hvilket resulterer i negativt ladet domener som gir bindingsseter for forskjellige vekstfaktorer, proteaser og cytokiner som er involvert i tumorutviklingen [3] – [7]. Følgelig mus embryo konstruert for å uttrykke en VEGF-A mangler HS-bindende sekvens viste en reduksjon i kapillar gren formasjon [8], og transgene musemodeller med enten en homozygot delesjon av HS-bindende motiv i PDGF-BB eller redusert HS sulfatering, viste defekt pericyte rekruttering og skjules mikrovaskulær anatomi [9], [10]. Endret uttrykk for regulatoriske enzymer involvert i å forme den fine strukturen i HS kjedene har vært innblandet i kreft,
f.eks
genet hypermethylation mediert genet Slå av 3-O sulfotransferaseaktivitet og HSulf-en ble funnet i flere typer kreft [11], og HSulf-2 over ekspresjon korrelert med økt angiogenese og vekstfaktorbindende kapasitet på brystkreft [12]. Videre har HS-nedverdigende heparanase vært forbundet med tumorprogresjon og dårlig pasient utfall gjennom ombygging av svulsten mikromiljøet [13]. HSPGs har dermed vært innblandet i flere aspekter av tumorutvikling og angiogenese; imidlertid fortsatt rollen HSPG som et mål for anti-angiogenese behandling for å bli definert. Faktisk har flere strategier blitt utforsket for å oppnå dette formålet, viktigst HS ligne heparin og dets derivater [14] – [18]. Store ulemper med disse forbindelsene er deres relative uspesifikke måter målretting, og betydelig risiko for blødning komplikasjoner forbundet med sine antikoagulerende aktiviteter. Andre mulige HS-målrettet behandling for kreftterapi involverer proteiner eller peptider med positivt ladede aminosyrerester som virker som konkurrerende inhibitorer av vekstfaktor bindende til HS kjedene [19].
antistoff-baserte terapi er en av de raskeste voksende terapiområder innen medisinsk onkologi og antistoffer rettet mot VEGF, epidermal vekstfaktor-reseptor 2 (HER-2), EGF reseptor eller CD20 er godkjent for behandling av
f.eks
metastatisk brystkreft og tykktarmskreft og aggressive B- cellelymfomer [20]. Mindre rekombinante antistoffer som single-kjeden variabel fragment (ScFv) antistoffer er interessante muligheter for bedret målretting grunn av sine gunstige farmakokinetikk [21] – [23]. Interessant, van Kuppevelt og medarbeidere har beskrevet utviklingen og karakteriseringen av flere epitop spesifikk, fagfremvisning avledet, scFv αHS å undersøke den strukturelle diversitet av HS-kjeder i forskjellige vev [24], [25]. I denne studien, søkte vi å identifisere scFv αHS som gjenkjenner HS epitoper uttrykt i blodkar av pasient glioblastom svulster, og videre undersøkt bruken av disse αHS som en antatt strategi for å hemme ulike aspekter av EF-funksjonen.
resultater
Identifikasjon av αHS kloner som gjenkjenner HS epitoper av tumorvaskulatur
Vi i utgangspunktet søkt å identifisere αHS kloner med kjent epitop spesifisitet (tabell 1) [26] som kan gjenkjenne den vaskulære nisje av pasient glioblastom svulster. Denne tumortype ble valgt på grunnlag av sin velkjente fenotypiske egenskaper ved hypoksi-indusert angiogenese manifestert ved dyp EC hyperplasia [27]. Som vist på fig. 1A-D, tre separate αHS kloner (AO4B08, EV3C3, og HS4E4) fortrinnsvis farget for HS epitoper lokalisert til svulsten blodkar,
dvs.
αHS viste sterk samlokalisering med EF markører von Willebrand faktor (vWF) og integrin αvβ3, sistnevnte er en kjent markør av aktivert endotel [28]. HS-epitoper gjenkjent av de samme sett av αHS antistoffer ble funnet å bli uttrykt også i primære humane ECS (HUVECs) (Fig. S1A-C). Spesifisiteten til αHS for HS
in vitro
ble vist av betydelig redusert binding til egenkapitalbevis etter behandling med heparanase lyase som enzymatisk degraderer HS (Fig. S1D). Spesifisiteten til αHS for HS var også til stede
in vivo
i glioblastom xenograft tumorseksjoner, som heparanase behandling resulterte i et fullstendig tap av αHS farging (fig. 1E, høyre øvre panel). Vi neste utført stainings med et antistoff (3G10) som er kjent for å spesifikt gjenkjenne HSPG kjerne protein med en gjenværende HS spire etter behandling med heparanase, men som ikke anerkjenner enten gratis HS kjettinger eller intakt HSPG [29]. Ubehandlede tumorsnitt viste ingen farging med 3G10 (Fig. 1E, nedre venstre panel), mens tumorsnitt behandlet med heparanase vises betydelig positivitet for 3G10 epitop hovedsakelig lokalisert til fartøy-lignende strukturer som lignet de αHS flekker mønster (se fig. 1E, høyre panel nedre og øvre venstre panel). Sammen utgjør disse studiene identifisere flere αHS kloner som gjenkjenner HS epitoper assosiert med intakte HSPGs rikelig i den vaskulære nisje av glioblastom svulster.
, pasient glioblastom tumorsnitt ble farget for HS bruker αHS antistoffer AO4B08 (A og D) , EV3C3 (B) eller HS4E4 (C) (grønn) og for vWF (A-C, endotel-markør, rød) eller integrin αvβ3 (D, men da av aktivert endotel, rød), og analysert ved fluorescens mikroskopi. Sterk co-sammenheng mellom HS epitoper og tumor blodkar er angitt med flettede bilder (A-D, høyre panel, gul). Bilder vist er representative for tre forskjellige svulster og minst fem deler per svulst, og ble oppnådd ved 20 × forstørrelse. Scale bar, 50 mikrometer. E, Øvre paneler: Spesifisitet av αHS ble vurdert ved AO4B08 farging av U-87 MG glioblastom xenograft tumor seksjoner etter enten ingen behandling (Ctrl) eller forbehandling med heparinase III lyase (HS lyase) for å fordøye HS. Lavere paneler: 3G10 antistoff ble brukt til å oppdage HS stubber av HSPGs som gjenstår etter HS lyase fordøyelsen. Expecedly, 3G10 farging var ikke påvises i ubehandlede kreft seksjoner med intakt HS (Ctrl, venstre panel); Men 3G10 farging av HS lyase behandlet prøvene (panel høyre) viser et fartøy som mønster som i stor grad ligner på AO4B08 flekker (øvre venstre panel). Scale bar, 20 mikrometer
funksjonelle effekter av αHS i Primær Menneskelig egenkapitalbevis
Basert på hypotesen om at HSPGs er egnet mål for anti-angiogen behandling [3]. – [10], [13] – [18] vi neste utført en rekke funksjonelle studier med primær menneskelig egenkapitalbevis. I overensstemmelse med en rolle av HSPGs i EC funksjon, HS mimetiske heparin markert redusert EC proliferasjon på en doseavhengig måte (fig. 2A). Det samme var tilfelle for lavmolekylært heparin forbindelse tinzaparin (Fig. 2B), som er en mye brukt antikoagulant, og det er for tiden under undersøkelse for sin tumorinhiberende effekter hos lungekreftpasienter (https://clinicaltrials.gov/ct2/? vis /NCT00475098 uttrykket = tinzaparincancer . rang = 7)
, HUVECs ble dyrket i serumfritt medium i nærvær av de angitte konsentrasjoner av enten heparin (A) eller med lav molekylvekt heparin, Tinzaparin (B ). Celleformering ble bestemt ved måling av inkorporert [
3H] tymidin i løpet av et tidsrom på 48 timer. C, HUVECs ble dyrket i serumfritt medium i fravær (Ctrl) eller nærvær av AO4B08 (αHS, 3 ug /ml) i 72 timer. Cell morfologi ble visualisert ved krystallfiolett farging, og tatt med en omvendt lysmikroskop utstyrt med et digitalt kamera. Venstre og midten av panelene viser representative bilder av en langstrakt EC fenotype i αHS behandlet sammenlignet med kontrollceller. Høyre panel viser kvantitativ analyse av lengden av individuelle celler i tre separate mikroskopiske felt per brønn (n = 4), ved hjelp av Image J programvare. D, HUVECs ble dyrket på Matrigel,
ie
en tumoravledet ekstracellulær matriks, i serumfritt medium i fravær (Ctrl) eller nærvær av AO4B08 (αHS, 3 ug /ml) og ble tillatt å danne rørene i omtrent 20 timer. Venstre og midten av panelene viser representative bilder av øket rør formasjonen i αHS-behandlede sammenlignet med kontrollceller fra minst tre uavhengige eksperimenter. Høyre panel viser kvantitativ analyse av antall intakte rør fra tre mikroskopiske felt per brønn (n = 4) ved hjelp av Image J programvare. E og F, stimulerer αHS EC proliferasjon: HUVECs ble dyrket i serumfritt medium i fravær eller nærvær av AO4B08 (αHS) ved de angitte konsentrasjoner og bedømt for spredning av [
3H] tymidininkorporering over en periode på 3 timer. F, HUVECs ble utsatt for cellesyklus fase analyse etter 6 timer uten (Ctrl) eller med AO4B08 (αHS) behandling. Fraksjon av celler i de respektive cellesyklus fase ble bestemt ved hjelp av strømningscytometri følgende nukleær farging med propidiumjodid. Data er presentert som gjennomsnitt ± S.D. * Statistisk forskjellig fra ubehandlet Ctrl, P . 0,05
En vesentlig ulempe med hepariner er deres uspesifikke virkningsmekanisme og potensielt alvorlige bivirkninger. Vi besluttet derfor å utforske muligheten for antistoffbasert målretting av HS som en mer spesifikk og rasjonell antiangiogene strategi, i første omgang å studere en av de tidligere valgte αHS,
dvs.
AO4B08, på EC funksjon. AO4B08 behandlet ECS viste et langstrakt morfologi med en tilnærmet 75% økning i midlere cellelengde sammenlignet med ubehandlede celler (fig. 2C). EC forlengelse er kjent for å være forbundet med et rør som danner og spirende EC fenotype [30]. Følgelig AO4B08 ble funnet å fremme dannelsen rør to ganger sammenlignet med kontrollceller (figur 2D.). Videre αHS ble funnet å øke EC proliferasjon på en doseavhengig måte med en maksimal stimulering av ca 3,5 ganger sammenlignet med kontrollen (fig. 2E). Spesielt, ble AO4B08 mediert stimulering av EC proliferasjon vist allerede ved 3 timers behandling, noe som tyder på en forholdsvis hurtig reaksjon. Effekten av AO4B08 på EC proliferasjon ble opprettholdt etter 24 timer med AO4B08 behandling (fig. S2). Stimulering av EC proliferasjon av AO4B08 ble ytterligere understøttet av en øket andel av celler i S-fase, og en tilsvarende reduksjon av G1-fase i AO4B08 behandlede sammenlignet med kontrollceller (fig. 2F).
αHS Beskytter primære, humane ECS fra hypoksi og sult Associated celle-død
hypoksi og næringsmangel er karakteristiske trekk ved svulsten mikromiljøet [31], og som hypoksi har vist seg å modulere celleoverflate HS sammensetningen av ECS i en økt vekstfaktorbindende kapasitet [32], begrunnet vi at antistoff-mediert blokkering av HS kan sensibilisere ECS i forbindelse med hypoksi og sult. For dette formål, ECS ble dyrket ved hypoksi (1% O
2) i nærvær eller fravær av AO4B08, og vurdert for apoptose ved analyse av spaltede caspaser. Serum utsulting av hypoksiske egenkapitalbevis indusert caspase 3 og 7 aktivering i egenkapitalbevis og interessant, caspase cleavage ble effektivt motvirkes ved AO4B08 behandling (fig. 3A). I ytterligere støtte av disse data ble AO4B08 vist til en betydelig økning i antall levedyktige ECS ved hypoksisk og serum-mangel betingelser (Fig. 3B). Til sammen ovennevnte data tyder på at en αHS vist seg å gjenkjenne tumorvaskulatur-resident HS strukturer kan utøve pro-angiogene effekter i egenkapitalbevis.
, HUVECs ble dyrket i 72 timer i fullstendig medium (10% FBS), serum fritt medium, eller i serumfritt medium supplert med AO4B08 (αHS, 3 ug /ml), som angitt under hypoksiske betingelser (1% O
2). Cellelysater ble analysert for total og spaltet caspase-3 og 7 samt α-tubulin ved immunblotting. Øvre panel viser representative immunoblotter fra tre uavhengige forsøk. Lavere panelene viser kvantifisering av spaltede caspase /total caspase forholdstall fra et representativt eksperiment. B, HUVECs ble dyrket i serumfritt medium i fravær (Ctrl) eller nærvær av AO4B08 (αHS, 3 ug /ml) under hypoksiske betingelser i 72 timer, og deretter farget med krystallfiolett. Venstre panel viser representative bilder av fargede celler. Høyre panel viser kvantitativ analyse av levedyktige celler. Data er presentert som gjennomsnitt ± S.D. * Statistisk forskjellig fra ubehandlet Ctrl, P . 0,05
αHS Mediert Cell stimulering er spesifikk for HS, men er ikke HS epitop eller Cell Spesifikk
Vi neste undersøkt spesifisiteten av funksjonell effekter av αHS. AO4B08 stimulering av EC spredning først strengt avhengig av HS-binding som indikert ved effektiv reversering av heparin på en doseavhengig måte (fig. 4A). Allerede på det laveste heparin anvendte konsentrasjon (10 ug /ml), ble omtrent 75% av AO4B08-avhengige proliferasjon hemmet, og ved 100 ug /ml effekten var fullstendig avskaffet (Fig. 4A). Viktigere, fant videre at ytterligere αHS kloner vist seg å gjenkjenne glioblastom tumor vaskulaturen, HS4E4 og EV3C3 (fig. 1), som også stimulerte EC proliferasjon, og at denne effekten var effektivt motvirket av heparin (fig. 4C). Det skal bemerkes at i de sprednings eksperimentene er vist på fig. 2A,-celler ble behandlet med heparin i 48 timer, mens i de αHS reverserings forsøkene celler ble inkubert med heparin bare i 3 timer (fig. 4A og C). Viktigere, ulike varianter av CS,
dvs.
En glycosaminoglycan nært knyttet til heparin, var ikke i stand til å reversere den stimulerende effekten av αHS (Fig. 4B). Dessuten, under disse betingelser, heparin (10 ug /ml) inhiberte effektivt αHS celleoverflatebinding (fig. S3b). Selv om disse resultater indikerer at αHS-medierte effekter på EC-spredning er HS bestemt, men ikke begrenset til en spesifikk epitop HS, ble den stimulerende virkning mest uttalt for EV3C3 fulgt av AO4B08 og HS4E4 (fig. 4C). Disse resultatene så ut til å samsvare med det celleoverflate overflod av den respektive αHS epitop,
dvs.
ECS fortrinnsvis bundet αHS i størrelsesorden EV3C3 . AO4B08 HS4E4 (Fig S3A.). Videre, er effekten av de forskjellige αHS klonene syntes ikke å være direkte knyttet til den cellulære fordelingen av deres respektive epitop, som AO4B08 og HS4E4 stainings viste et lignende mønster langs cellens omkrets, mens EV3C3 viste en mer diffus farging med økt tetthet langs perinukleær region (fig S1 A-C.)
A, HUVECs ble dyrket i serumfritt medium i fravær (hvite søyler) eller tilstedeværelse av AO4B08 (svarte striper, 1,25 mg /ml). og med den angitte konsentrasjon av heparin i 3 timer og vurderes for celleproliferasjon ved [
3H] tymidin inkorporering analysen. * Statistisk forskjellig fra ubehandlet kontroll, P 0,05; # Statistisk forskjellig fra AO4B08 behandlet, P 0,05. Kontrollceller ble inkubert uten antistoff. B, HUVECs ble dyrket i serumfritt medium i fravær (hvite stolper) eller i nærvær av AO4B08 (sorte stolper, 1,25 ug /ml) uten (Ctrl) eller med CS-6, CS4, eller CS-0 (10 ug /ml), som angitt. Celleproliferasjon ble bestemt av [
3H] tymidin inkorporering analysen. * Statistisk forskjellig fra ubehandlet kontroll, P 0,05. C, HUVECs ble dyrket i serumfritt medium i fravær (hvite stolper) eller i nærvær av heparin (sorte stolper; 10 ug /ml) uten eller med de forskjellige αHS antistoff kloner (1,25 ug /ml), som angitt. Celleproliferasjon ble bestemt av [
3H] tymidin inkorporering analysen. * Statistisk forskjellig fra ubehandlet kontroll, P 0,05; # Statistisk forskjellig fra αHS-behandlet, P 0,05. D, Villtype (CHO-K1) celler og PG- mangel (PgsA-745) CHO-celler ble dyrket i serumfritt medium i fravær eller nærvær av forskjellige αHS antistoff kloner (1,25 ug /ml), som angitt. Celleproliferasjon ble bestemt av [
3H] tymidin inkorporering analysen. * Statistisk forskjellig fra ubehandlet kontroll, P 0,05; # Statistisk forskjellig fra αHS-behandlede CHO-K1 celler, P 0,05. E og F, human umbilical artery ECS (HUAECs, E) og U-87 MG glioblastom celler (F) ble dyrket i serumfritt medium i nærvær av AO4B08 (αHS) ved de angitte konsentrasjoner og proliferasjon ble bestemt ved [
3H] tymidin inkorporering analysen. * Statistisk forskjellig fra ubehandlet kontroll, P . 0,05
spesifisitet αHS og avhengighet HSPG for sine stimulerende effekt var ved undersøkt ved hjelp av villtype (CHO-K1) og mutant (pgsA- 745) CHO-celler, genetisk mangelfull i xylosyl transferase (XT). XT katalyserer det første trinnet i HSPG montering,
, dvs.
. tilknytning av xylose til spesifikke serinrester i PG-kjerneprotein. PgsA celler uttrykker omtrent 5% HSPG sammenlignet med villtype-celler [33]. Behandling av CHO-K1-celler med AO4B08, EV3C3 samt HS4E4 resulterte i en nesten to gangers økning i proliferasjon, og viser at de stimulerende virkninger av αHS ikke var begrenset til HUVECs (fig. 4D). Denne forestillingen ble forsterket ved det funn at αHS indusert proliferasjon av human navlestreng arterie ECS (HUAEC),
ie
en annen kilde av primære humane ECS, så vel som human glioblastoma cellelinje U-87 MG i en doseavhengig måte og i samme grad som i HUVECs (fig. 4E og F). Viktigere, HSPG-mangel mutante celler var ikke svarer til alle de studerte αHS (fig. 4D), som gir genetisk bevis for at αHS-mediert aktivering av celledeling krever uaffisert HS funksjon.
αHS Avhengig Stimulering av Proliferation Innebærer p38 MAPK Signa Aktivering
siden ønsket å belyse hvorvidt αHS indusert celleproliferasjon involvert en bestemt signalveien. Ved hjelp av en fosforylering-spesifikk reseptor-tyrosinkinase matrise, har vi funnet at αHS behandling ikke aktiverte reseptorer ved kjente HS-bindende vekstfaktorer,
ie
FGF’er, PDGFs, og VEGFs, sammenlignet med ubehandlet ECS (fig. 5A ). Disse resultatene tyder på at mekanismen for αHS-mediert stimulering av ECS ikke skyldes en direkte etterligning effekt av HS-bindende ligander. Interessant, ved hjelp av en fosforylering-spesifikke kinase matrise, ble αHS behandling funnet å betydelig induserer fosforylering av p38 MAPK (ca. 2,5 ganger) sammenlignet med ubehandlet ECS (Fig. 5B). Matrisen data ble bekreftet ved Western-blotting som viser tidsavhengig og forbigående induksjon av p-p38 MAPK ved αHS (fig. 5C). Videre fosforylering av CREB, en kjent nedstrøms mål for p38 MAPK [34], som syntes å være økt ved αHS behandling (med ca. 35% sammenlignet med kontroll) (Fig. 5B). Imidlertid fosforylering av MAPK en annen allment implisert i proliferasjonen signalering, ekstracellulære signal regulert kinase 1/2 (ERK1 /2), var upåvirket av αHS behandling (Fig. 5B). Effekten av αHS på p38 MAPK signaleringsaktivering så ut til å være et mer generelt fenomen, som en tilsvarende reaksjon ble funnet i mikrovaskulære ECS isolert fra (fig. 5D) muselunge [35] samt i U-87 MG glioblastom-celler (Fig . S4A)
HUVECs ble inkubert i serumfritt medium med eller uten αHS (AO4B08;. 1,5 ug /ml) i 5, 15, 45, og 60 min, og fosforylerte reseptor-tyrosin-kinase-proteiner ble bestemt på sammenslått cellelysater av humant anti-fosfor reseptortyrosinkinasehemming antistoff rekke analyse som beskrevet under
Metoder
. Vist er representative immunoblotter fra to uavhengige forsøk. Angitte områdene viser FGFR, kolonne 1: FGFR1; 2: FGFR2; 3: FGFR3; 4: FGFR4. PDGFR, kolonne 1: PDGFRα; 2: PDGFRp; 3: SCFR; 4: Flt3. VEGFR, kolonne 1: VEGFR1; 2: VEGFR2; 3: VEGFR3. B, HUVECs ble inkubert i serumfritt medium med eller uten αHS (EV3C3; 1,5 ug /ml) i 5, 15, 45, og 60 min, og fosforylerte kinase-proteiner ble bestemt på samlede cellelysater fra humane anti-fosfo-kinase-antistoff matrise analyse som beskrevet under
Metoder
. Venstre panelene viser representative immunoblotter fra tre uavhengige forsøk. Høyre panel viser kvantifisering av p-p38 MAPK, p-CREB, og p-ERK1 /2 nivåer på ulike forhold, presentert som relative intensiteter
vs.
Rekke referanse (rød boks). C, HUVECs var enten ubehandlet (Ctrl) eller inkubert med αHS (AO4B08; 1,25 ug /ml) for de angitte tidsperiodene etterfulgt av immunblotting for fosfo-p38 MAPK, total p38 MAPK og α-tubulin. Venstre panel viser representative immunoblotter av tre separate forsøk. Høyre panel viser kvantifisering av relative fosfor-p38 MAPK nivåer (P-p38 /α-tubulin) fra et representativt eksperiment. D, Samme eksperiment som i (C) ble utført med mus lunge mikrovaskulær ECS, som viser sammenlignbar induksjon av p38 MAPK fosforylering av αHS som i HUVECs. E-F, avhenger αHS-indusert spredning på p38 MAPK. Proliferasjon ble bestemt ved [
3H] tymidin inkorporering i mus ECS (E) og U-87 MG glioblastom-celler (F) etter behandling med det p38 MAPK-inhibitor SB203580 (1 uM) og /eller αHS (AO4B08; 1,25 ug /ml) i 3 timer, som angitt. Basal celleproliferasjon ble ikke signifikant påvirket av p38 MAPK hemming mens αHS indusert spredning ble nesten fullstendig reversert. * Statistisk forskjellig fra ubehandlet kontroll, P 0,05; # Statistisk forskjellig fra αHS-behandlet, P . 0,05
Flere vekstfaktorer, kanskje viktigst av pro-angiogene FGF, VEGF, og PDGF har vist seg å utløse p38 MAPK-aktivering i visse celletyper [ ,,,0],36]. Vi utførte således en serie av angiogenese og tyrosinkinase-reseptor-antistoff fosforylering array-eksperimenter for å belyse hvorvidt celle stimulerende virkninger og p38 MAPK-aktivering av αHS kan være sekundært til induksjon av spesifikke vekstfaktorer og deres respektive signalerings reseptorer. Men vi klarte ikke å finne signifikant induksjon av αHS enten av disse vekstfaktorer eller deres reseptorer (data ikke vist). Til direkte studere den funksjonelle betydningen av p38 MAPK signal i αHS-mediert spredning, benyttet vi den veletablerte p38 MAPK hemmer SB203580 [34], [37]. Ventet, inhibitoren effektivt motvirkes p38 MAPK-aktivering i HUVECs (fig. S4B), og redusert serum, så vel som αHS-mediert aktivering av p38 MAPK nedstrøms target CREB (fig. S4C). SB203580 ble vist å inhibere basal p-CREB (fig. S4C) og proliferasjon i ikke-stimulerte HUVECs (data ikke vist), men ikke i mus ECS og U-87 MG glioblastom-celler (fig. 5E og F),
dvs.
ytterligere studier ble utført i de sistnevnte celletyper. Interessant, αHS-indusert proliferasjon av muse-ECS (fig. 5E), så vel som glioblastom-celler (fig. 5F) ble effektivt dempet av p38 MAPK-inhibering. Sammen utgjør disse dataene indikerer at bindingen av αHS til celleoverflate HSPGs av egenkapitalbevis samt glioblastom celler utløser en p38 MAPK-avhengige signalveien som fører til økt spredning.
Diskusjoner
Antistoff basert svulst vaskulær målretting for behandling av kreft er basert på det faktum at tumorer krever angiogenese for å ekspandere og metastasere, og at ECS vender mot hulrommet av blodkar og er således relativt tilgjengelig for systemisk terapi. Begrunnelsen for HSPG-rettede antitumorbehandling, er muligheten for samtidig multi-målretting av noen viktige pro-angiogene proteiner, viktigst av VEGF-A, FGF, HB-EGF, PDGF, og IL-8, som kan fremme tumor angiogenese i en delvis overflødig måte med implikasjoner for behandling motstand. I denne studien har vi identifisert flere αHS kloner som gjenkjenner HS epitoper rikelig uttrykt i blodkar av ondartede glioma svulster. Uventet, finner vi at disse αHS stimulere flere aspekter av EF-funksjonen,
dvs.
Differensiering, tube formasjon, spredning og motstand mot hypoksi og sult avhengige celle-død. Vi gir bevis for at disse effektene er spesielt avhengig av αHS bindende, og er ikke relatert til uspesifikke interaksjoner. Viktigere, stimulerende virkninger viste seg å innebære flere HS epitoper, som AO4B08, EV3C3 samt HS4E4 alle viste stimulerende aktivitet, som syntes å være direkte korrelert med deres respektive celleoverflate overflod i ECS. Videre ble αHS-indusert stimulering funnet i tre forskjellige typer av primær ECS,
ie
HUVECs, HUAECs, og mus lunge mikrovaskulær ECS, så vel som i transformerte CHO-celler og humane U-87 MG glioblastom-celler, noe som antyder . at våre funn har mer generell relevans
Tidligere studier gir støtte til forestillingen om HSPG som et relevant mål for kreftbehandling [7] – [18]. Disse strategiene har i hovedsak vært rettet mot heparin, dets derivater, og andre polyanioniske forbindelser, slik som suramin [18]. Andre strategier for å forstyrre HSPG funksjon inkluderer falske substrater for HS biosyntese,
dvs.
Xylosides [38], hemming av HS-nedbrytende enzymer [39], og genetisk manipulering av HS biosyntetiske maskiner [40]. De viste inhiberende virkninger av disse forbindelser kan hovedsakelig forklares ved direkte konkurrerende blokkering av ligand-HSPG interaksjoner og dermed demping av nedstrøms reseptor signaleringsaktivering (polyanioniske forbindelser), eller ved å modulere den biologiske tilgjengeligheten av HSPGs for ligandbinding (xylosides, enzymer, genetisk strategier). Interessant, våre data indikerer at den dominerende effekten av antistoff-binding til cellulære HSPGs er til direkte å fremme celleaktivering, snarere enn å blokkere HS ligand-avhengig celleaktivering. På et mekanistisk nivå, binding av αHS til HSPGs av egenkapitalbevis samt glioblastom celler ble funnet å utløse p38 MAPK-avhengige signalering, og uaffisert p38 MAPK funksjon var nødvendig for αHS-mediert celle stimulering. I denne sammenheng er det kjent at andre HS-bindende ligander er blitt vist å stimulere ECS via p38 MAPK-reaksjonsveien [41]. Denne intracellulær kinase ble først identifisert som et vesentlig pro-inflammatorisk mediator og ble senere funnet å være involvert i mange cellulære prosesser og ved sykdommer, inkludert kreft [36]. Faktisk har p38 MAPK vært implisert som en suppressor av ondartede prosesser,
f.eks.
Oncogen-mediert celle alderdom og kontakt-inhibering. Andre studier har imidlertid vist pro-trekkende og invasive virkningene av p38 MAPK-aktivering i kreftceller og stromale celler [36]. Som andre MAPK, funksjonene til p38 er avhengig av dens nedstrøms kinaser, blant serin /treonin kinaser så som p38-kontrollert /aktivert kinase (Prak) og MAPK-aktivert kinase-2, og mange forskjellige oppstrøms kinaser, for eksempel som MKK3 /6, MKK4, samt MAPKK uavhengige signaler. Cell spesifikke samt subcellulære lokalisering spesifikke effekter legge til kompleksiteten av p38-funksjon. I sammenheng med tumorangiogenese det er av spesiell interesse som p38 ble nylig vist å aktivere tumor ECS gjennom Prak [42]. Fremtidige studier vil måtte avklare om Prak og hvilke alternative p38 nedstrøms signalmekanismer er involvert i αHS-mediert pro-angiogene effekter. Videre ble våre studier begrenset til de kinaser oppdaget av antistoffet array,
dvs.
andre kinaser ikke inkludert i matrisen kan aktiveres ved αHS i tillegg til p38.
Det dominerende celleoverflaten
