Abstract
Generelt aktivering av hypoksi-induserbar faktor (HIF) trasé er klassisk assosiert med negativ prognose i kreft og har blitt foreslått å bidra til onkogene stasjonen. I klart celle nyrekreft (CCRC) HIF veier er oppregulert ved inaktivering av von-Hippel-Lindau tumor suppressor. Men HIF-1α og HIF-2α har kontrasterende effekter på eksperimentelle tumorprogresjon. For bedre å forstå dette paradokset vi undersøkte pan-genomiske mønstre av HIF DNA bindende og tilhørende genuttrykk i respons til manipulering av HIF-1α og HIF-2α og relaterte funnene til CCRC prognose. Våre funn viser tydelig pan-genomisk organisering av kanoniske og ikke-kanonisk HIF isoform-spesifikke DNA-binding på tusenvis av nettsteder. ble observert Totalt assosiasjoner mellom HIF-1α-spesifikk binding, og gener assosiert med gunstig prognose og mellom HIF-2α-spesifikk binding og negativ prognose. Men innenfor hver isoform-spesifikt sett, enkelte genet foreninger var heterogene på fortegn og størrelse, noe som tyder på at aktivering av hver HIF-α isoform bidrar en svært kompleks blanding av pro- og anti-tumorigen effekter
Citation. Salama R, Masson N, Simpson P, Sciesielski LK, Sun M, Tian YM, et al. (2015) Heterogene effekten av direkte Hypoksi Pathway Activation i nyrekreft. PLoS ONE 10 (8): e0134645. doi: 10,1371 /journal.pone.0134645
Redaktør: Jörn Karhausen, Duke University Medical Center, UNITED STATES
mottatt: May 27, 2015; Godkjent: 10 juli 2015; Publisert: 11 august 2015
Copyright: © 2015 Salama et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Datatilgjengelighet: Data har vært deponert på NCBI Gene Expression Omnibus database (GSE67237, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE67237)
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en Cancer Research UK (tilskudd nummer A16016) til RS, NM og DRM, Ludwig Institute for Cancer Research til PJR og MS, Higher Education Funding Council for England til DRM, Wellcome Trust (tilskuddsnummer 078333 /Z /05 /Z, WT091857MA) til PJR, YMT og PS, og den tyske Research Foundation (tilskudd nummer SC132 /2-1) til LKS. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Hypoksi er sterkt assosiert med negativ prognose i kreft og hypoksi signalveier er ofte aktiveres under kreftutvikling [1-4]. Dette eksemplifiseres av klarcellet nyrekreft (CCRC) hvor inaktivering av von Hippel-Lindau tumor suppressor (pVHL) er en vanlig og tidlig hendelse [5-7]. pVHL er erkjennelsen komponenten i en E3 ubiquitin ligase kompleks som er rettet mot hypoksi induserbar faktor (HIF) a-subenheter for nedbrytning av ubiquitin-proteasom-reaksjonsveien, og inaktivering av pVHL resulterer i konstitutiv aktivering av HIF transkripsjonelle reaksjonsveien [8]. HIF transkripsjons mål inkluderer mange med funksjoner som forbinder med vanlige fenotypiske kjennetegn ved kreft (for eksempel økt angiogenese, feilregulert energi metabolisme, økt cellemotilitet), og det er vanlig å anta at onkogenese drives i stor grad av aggregering av de positive effektene av HIF aktivering på slike prosesser.
Transkripsjonell aktivering av HIF er hovedsakelig medieres gjennom binding av HIF α /p-heterodimerer til en kjerne konsensussekvens (RCGTG) i hypoksi responselementer (hRes) [9]. Selv om de to er best karakterisert HIF-a subenheter, HIF-1a og HIF-2a, manifest lignende domene arkitektur, og utvisket DNA-bindende sekvenser [10], transactivate de forskjellige målene og vise kontrast tumorigene roller [11,12]. Overraskende, er sterk oppregulering av HIF etter inaktivering av VHL i CCRC forbundet med en uvanlig skjevhet i HIF isoform uttrykk, mot HIF-2α [13]. Flere linjer med etterforskning tyder på at dette er funksjonelt viktig i utviklingen av CCRC. Genom-wide assosiasjonsstudier identifisert polymorfe varianter som påvirker mottakeligheten for CCRC på HIF-2α, men ikke HIF-1α, locus og loci innenfor HIF-2α transkripsjonen vei [14]. Omvendt, er HIF-1α genet dosering vanligvis redusert i CCRC ved tap av kromosom 14q [15], og den HIF-1α genet, men ikke den HIF-2α genet, er gjenstand for en liten, men signifikant økning av inaktiverende mutasjoner [16] . Videre HIF-2α men ikke HIF-1α, kan overstyre tumor suppressor aktivitet pVHL i eksperimentelle tumorsystemer [17,18]. Spesielt gjen uttrykk for HIF-1α i CCRC linjer som mangler villtype HIF-1α bremser vekst, mens overekspresjon av HIF-2α akselererer veksten i tumorxenotransplantater [11,15].
Disse observasjonene utfordre paradigme som generell aktivering av HIF signale stasjoner onkogenese gjennom aktivering av et lite antall adskilte transkripsjonelle mål, og foreslår et mer komplekst grensesnitt. For eksempel, pan-genomiske analyser viste hundrevis til tusenvis av direkte HIF transkripsjons mål [10,19-22]. Siden HIF-1α og HIF-2α potensielt kan konkurrere om binding til HIF-1β eller for innkvartering av hres, eller kan binde forskjellige sett med transkripsjons mål, er det uklart hvordan isoform bestemt manipulering av HIF-a virkninger på transkripsjons mønstre forbundet med CCRC.
for å studere dette vi utført detaljert chip seq og RNA-seq analyse av HIF-α isoform bindingssetet belegg og genuttrykk i pVHL-defekte CCRC 786-0 cellelinje, etter re-uttrykk av HIF-1α eller overekspresjon av HIF-2α, og knyttet disse funnene til prognostisk tilhørende genekspresjonsmønster i menneske CCRC svulster [6]. Våre funn viser et stort antall diskrete isoform spesifikke HIF-a bindingssteder som manifesterer en isoform spesifikke genomisk arkitektur, aktivere forskjellige mønstre av genekspresjon og forbinder med kontrast prognostiske genutrykksmønster i klinisk CCRC. Men selv om helhets foreninger ble observert mellom HIF-1a-forbundet gener og god klinisk prognose og mellom HIF-2α assosierte gener og dårlig klinisk prognose, denne motsetningen var ufullstendig. På nivået av enkeltgener, effektene var heterogene i begge fortegn og størrelse av effekt, noe som tyder på at selv i denne sammenhengen er definert, har hver HIF-α isoform potensielt både pro- og anti-tumorigen effekter.
Materials og metoder
Laboratoriemetoder metoder~~POS=HEADCOMP
Cell Culture.
786-O og HEK293T celler ble kjøpt fra ATCC (https://www.lgcstandards-atcc.org) og voksen i Dulbeccos modifiserte Eagle medium supplementert med 10% føtalt kalveserum, 2 mM L-glutamin, 100U penicillin og streptomycin 50 U /ml (v /v) (Sigma-Aldrich).
Fremstilling av 786-0 HIF -1α /HIF-2α celler.
HIF-1α og HIF-2α cDNA sekvenser [11] ble først klonet inn pRRL.IRES.EGFP (gaver fra Kamil Kranc, Glasgow) for å generere bicistronisk vektorer. Disse ble så ko-transfektert med pCMV-dR8.2 og PCMC-VSVG inn i HEK293T celler, og de resulterende virale partikler ble isolert ved sentrifugering og ultrafiltrering. 786-0 celler (ATCC) ble deretter omformet med enten kontroll (pRRL), HIF-1α (pRRL-HIF-1α) eller HIF-2α (pRRL-HIF-2α) uttrykker viruset.
ChIP-seq .
Enkel chip-seq analyser ble utført som tidligere beskrevet [19]. Chromatin ble immunopresipitert ved bruk av kanin polyklonale antisera til HIF-1α (PM14), HIF-2α (PM9) [23], HIF-1β (NB-100-110, Novus Biologicals, UK) eller pre-immunserum som kontroll.
PolyA + valgt RNA-seq
Total RNA ble dannet i tre eksemplarer med Mirvana miRNA Isolation Kit. (Ambion, Life Technologies Ltd, Paisley, UK) og behandlet med DNaseI (TURBO DNA-fri, Ambion ). PolyA + RNA bibliotekene ble deretter utarbeidet etter den ScriptSeq v2 RNA-Seq kit (Epicentre, Madison, WI, USA).
High-throughput sekvensering.
Alle bibliotekene ble utarbeidet etter Illumina protokoller og sekvensert på HiSeq 2000 plattform (Illumina, San Diego, CA, USA).
tiltredelses koder.
chip-seq og RNA-seq data er tilgjengelige fra Gene Expression Omnibus (GSE67237).
bioinformatiske analyse av chip-seq data
innledende analyse.
Illumina adapter sekvenser ble trimmet bruker Trimgalore (0.3.3) og leser ble justert til Genome Reference Consortium GRCh37 ( hg19) bruker BWA (0.7.5a-R405). Lav kvalitet kartlegging ble fjernet (MapQ 15) med SAMtools (0.1.19) [24] og leser kartlegging til Duke Socket svart liste regioner (https://hgwdev.cse.ucsc.edu/cgi-bin/hgFileUi?db = hg19 g = wgEncodeMapability) ble ekskludert ved hjelp BEDTools (2.17.0) [25]. Duplicate leser ble merket for eksklusjons hjelp Picard verktøy (1,106) (https://picard.sourceforge.net/). Les tettheter ble normalisert og uttrykt som leser per kilobase per million leser (RPKM) [26]. En million tilfeldige ikke-overlappende områder valgt fra KODE DNase Cluster II-topper (https://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/encodeDCC/wgEncodeRegDnaseClustered/) ble brukt som kontroll.
Peak Calling .
chip-seq toppene ble identifisert ved hjelp av T-PIC (Tre form Peak Identifikasjon for chip sekv) [27] og MACS (Modellbasert basert~~POS=HEADCOMP analyse av chip sekv) [28] i kontrollmodus. Peaks oppdaget av begge rush innringere ble filtrert kvantitativt ved hjelp av det totale antallet under toppen til å omfatte bare topper som var over 99.99th persentil av tilfeldige bakgrunns regioner valgt fra KODE DNase II cluster (p-verdi 0,0001).
De-novo Motif analyse.
Sekvenser som flankerer hver topp toppmøtet (± 150bp) ble gjentatt maskert ved hjelp RepeatMasker 4.0.3 (https://www.repeatmasker.org). De-novo motiver ble identifisert ved hjelp av Meme-chip (4.9.1) [29] og matchet ved hjelp av TomTom-modulen, til kjente transkripsjonsfaktor motiver i 2009 Jaspar kjernen database [30].
Principal Component Analysis (PCA).
bindende nettsteder for alle underenhetene som inngår i PCA ble slått sammen til en bindende sett. PCA ble utført ved hjelp singulærverdidekomposisjonen (Prcomp, R 3.1.1 -stats bibliotek, https://cran.r-project.org) for både individuelle bindingsseter og for helheten av chip-seq signal for hver underenhet. Biplots ble generert i R.
Varme kart
bindingssetet varme kartene ble generert ved hjelp Ngsplot (2,08) [31] med parametrene. FL = 50, MW = 5, RZ = 1 SC = 0-1, MQ = 15.
Motif Likelihood.
Hver HIF-α bindende region (toppmøtet ± 150bp) ble skannet for HRE (Jaspar /MA0259.1) og AP-1 (Jaspar /MA0491.1) binding motivene ved hjelp av posisjon vekt matriser (PWMs) hentet fra 2009 Jaspar Core-database [30]. Den normaliserte sannsynlighetsforhold (NLR) for hvert motiv ble beregnet i henhold til ligning 1. Den maksimale normaliserte sannsynlighetsforhold for hver bindingsregion ble rapportert for både HRE og AP-1-motivet som er gitt av ligning 2.
Ligning (1) ligning (2)
Hvor
j
er posisjonen i toppen,
i
er posisjonen i motivet,
L
er lengden på motiv,
PWM (b
,
i)
er PWM verdi på
i
for den tilsvarende base
b
,
B (b)
er bakgrunnen vekt for den tilsvarende base beregnet over en million tilfeldig DNase nettsider og
W
er topp og bredde.
bioinformatiske analyse av RNA-seq data
Første analyse.
Adapter sekvenser ble trimmet som ovenfor. Leser ble deretter justert til GRCh37 hjelp Tophat 2.0.8b (https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml) og bowtie 1.0.0 (https://bowtie-bio.sourceforge.net/index. Shtml) og ikke-entydig kartlegging fragmenter utelukket å bruke SAMtools (0.1.19) [24]. Totalt lese teller hver UCSC definert gen ble hentet ved hjelp HTSeq (0.5.4p3) [32] med «kryss-streng» -modus og betydelig regulerte gener ble identifisert ved hjelp av DESeq2 (ref. [33]).
Gene Sett Enrichment Analysis (GSEA).
GSEA berikelse analyse brukt 10000 permutasjoner, vektet berikelse score og pre-vurdering av gener [34]. Både differensial uttrykk betydning i henhold til DESeq2 og fold-forskjell mellom de to forholdene ble brukt til å rangere gener [35] (Eq 3) Equation 3.
Hvor φ
i er log2 fold-endring og
pv
i
er p-verdien for genet
i
.
The Cancer Genome Atlas (TCGA) GSEA.
Kliniske og RNA-seq V2 data for Nyre Nedsatt Clear cell carcinoma (KIRC) pasienter (https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/) [6] ble sammenstilt. Pasienter med manglende kliniske data eller flere RNA-seq datasett ble ekskludert. Normaliserte mRNA tellinger ble brukt som forutsatt. Pasientene ble delt inn i to grupper ved hjelp av en prognostisk poengsum, og legger en for hver av; alder over 60, patologisk stadium 3 eller 4, tilstedeværelse av metastaser, eller pasienten døde. God prognose pasientene skåret 0 eller 1 og dårlig prognose pasientene skåret 2, 3 eller 4. Differansen uttrykk for hvert gen mellom pasientgruppene ble vurdert av Likelihood Ratio Test for negative binomiske montert modeller ved hjelp glm.nb i R (3.1.1 ). Gener ble rangert for GSEA basert på kombinert betydning og fold-endring som ovenfor.
Sykdom merknad.
bindingssete berikelse ble beregnet ved hjelp -log10 av binomial test FDR (q-verdi) etter sTOR (Genomisk Regions Anriking av merknader Tool [36]) 2.0.2. Kreft undergrupper uten anrikning i enten chip seq datasettet ble fjernet.
Binding Gene Predictor.
Genes innenfor 10-kb områder med minst tre ganger forskjell mellom HIF-1α og HIF -2α binding ble valgt til å utforme et gen prediktor hjelp Overvåket Principle Component Analysis (SPCA) [37,38]. Først HIF-bindende gener som viser univariate signifikans (p 0,05) ble i forutsi pasientens prognose (Cox proporsjonal risikomodell) som er valgt. For hvert sett av gener (de bindende re-introdusert HIF-1α eller overuttrykt HIF-2α) singulærverdidekomposisjonen (SVD) på tvers av alle TCGA pasienter som ble brukt til å tildele gen vekter [37,38]. Hvert gen prediktor ble validert ved hjelp av «leave-one-out «kryssvalidering, sysselsetter 414 pasienter om gangen for å generere genet prediktor og deretter forutsi overlevelse av hvert venstre ut pasienten. Den endelige betydning og hasardratio på pasientens risiko prediktor ble vurdert likt univariat analyse.
Resultater
For det første, å definere HIF isoform spesifikke aktiviteter som er knyttet til kontrast effekter på vekst i CCRC -avledede VHL-defekte 786-0-celler, ble bassenger av celler infisert med virus som uttrykker tom vektor (VA), villtype HIF-1α, eller villtype HIF-2α, og pan-genomiske mønstre av HIF-binding og gen ekspresjon ble analysert ved chip seq og RNA-seq. HIF-1α og HIF-2α infeksjoner oppnådde omtrent like mRNA nivåer som var ca. 10 ganger høyere enn den endogene HIF-2α mRNA nivå (S1A fig). Tilsvarende HIF-2a proteinnivåer var tilnærmet 8 ganger høyere i HIF-2α infiserte celler enn i kontrollcellene, mens HIF-1α proteinnivåer ble 15-20-ganger høyere i HIF-1α infiserte celler enn i en annen celle CCRC linje (RCC4), som uttrykker full-lengde HIF-1α (S1B fig). I kontrollceller, ble totalt 1719 topper bindende endogene HIF-2α identifisert. Som forventet, disse nettstedene viser en høy grad av samsvar med HIF-1β signal, i samsvar med binding av en HIF-2α /1β heterodimer (S2 figur).
Vår RNA-seq analyse bekreftet tidligere funn [15] at mens 786-0 celler ikke uttrykker villtype HIF-1α, ikke uttrykk for flere avkortede og /eller fusjons transkripsjoner omfatter HIF-1α eksoner 1-9, men ikke mer distale sekvenser (S3 Fig), og er spådd til å være ute av stand til å kode et transkripsjonelt aktivt HIF-1α. Re-uttrykk for full lengde villtype HIF-1α i 786-0 celler har en negativ effekt på vekst som tumorxenotransplantater i mus. Vi begynte derfor med å undersøke pan-genomiske mønstre av DNA bindende for HIF-1α, HIF-1β og HIF-2α i slike celler, og sammenlignet disse med kontroll 786-0 celler.
Re-uttrykk for HIF- 1α ikke motvirke HIF-2α bindende
Siden HIF-1α og HIF-2α både dimerisere med HIF-1β, og gjenkjenne en lignende konsensus DNA sekvens, men har motstridende effekter i tumor xenograft vekst i 786-0, vi først vurdert muligheten for at gjen uttrykte HIF-1α kan motvirke HIF-2α DNA-bindende, enten gjennom direkte konkurranse om bindingsseter eller gjennom konkurranse for HIF-1β. Noe overraskende, genom-wide-analyse viste at HIF-2α bindende ble lite påvirket av gjen uttrykk for HIF-1α (fig 1A, sammenligne I og III). I samsvar med dette, prinsipal komponent analyse (PCA) av HIF-2α bindende i HIF-1α re-uttrykke celler viste sterk samvariasjon med HIF-2α binding i kontrollceller (fig 1B, sammenligne vektorer HIF-2α (VA) og HIF -2α (1αRE)). Disse analysene viser at HIF-2α binding er i stor grad upåvirket av HIF-1α re-uttrykk. For å teste dette mer kvantitativt sammenlignet vi den relative styrken av HIF-2 forpliktende signaler i HIF-1α re-uttrykke, versus kontrollceller, over 1719 endogen HIF-2a bindingssteder identifisert i kontrollceller. Denne analysen avslørte et stramt sammenheng sentrert på egenkapitalen på binding i de to cellelinjer, både for HIF-2α binding og for HIF-1β binding (S4 fig). Således, under disse betingelser, HIF-1α re-ekspresjon synes ikke å foreta en total antagonisere HIF-2α ved å forstyrre HIF-2α binding, enten ved direkte konkurranse om bindingsseter, eller ved å konkurrere HIF-1 p bort fra HIF-2α.
(A) HIF-1α bindingsseter i HIF-1α re-uttrykkende celler, ble identifisert ved topp ringer og rangert på den vertikale akse i samsvar med signalintensiteten. Varmekart av disse områdene (± 5kb den horisontale akse) som viser flis seq lese tetthet for de angitte HIF underenhetene ble generert for begge kontrollcellene (I, II) og HIF-1α re-uttrykkende celler med HIF-1α re- innføres (iii-v). Mønsteret av HIF-2α binding blir minimalt påvirket av den re-ekspresjon av full-lengde HIF-1α (sammenlign I og III). Nettsteder bindende re-uttrykt HIF-1α er i stor grad co-okkupert av HIF-1β (sammenlign iv og v). (B) Biplot viser Principal Component Analysis (PCA) chip-seq signalintensitet (RPKM verdier) for både individuelle bindingsseter (prikker) og HIF-subenheter (vektorer) på tvers av alle HIF-bindingsseter som er identifisert i kontrollceller og i HIF- 1α re-uttrykke celler. Nettsteder bindende endogen HIF-2α i kontrollceller er vist i blått, mens områder forpliktende gjen uttrykt HIF-1α er vist i rødt, sider bindende både er farget lilla og de resterende områdene er vist i grått. PCA for hver underenhet viser høy samvariasjon mellom HIF-2α binding i kontrollcellene og i HIF-1α re-uttrykke celler (sammenligningen HIF2α (VA) og (HIF2α (1αRE)). Dette viser bare minimal endring i HIF -2α binding som følge av HIF-1α re-ekspresjon. Derimot er HIF-1β vektor endres dramatisk med HIF-1α re-ekspresjon (sammenlign HIF1β (VA) med HIF1β (1αRE)) og justerer tett med vektoren for re-uttrykkes HIF-1α (HIF1α (1αRE)). den enkelte bindingsseter i kontroll og HIF-1 a re-uttrykkende celler (blå og røde prikker) på linje tett sammen med sine respektive PCA-vektorer. (C) Histogram av avstanden til nærmeste transkripsjon start hotellet (TSS) for HIF-1α bindingsseter i cellene re-uttrykke HIF-1α. (D) HIF-1α bindingsseter i re-uttrykke celler ble kategorisert i henhold til klassen (Ensemble) av nærmeste genet. den relative frekvensen for hver klasse er showet av kakediagram. (E) Gene sett berikelse analyse (GSEA) for settet av gener nærmeste til HIF-1α bindingssteder når genene er rangert etter fold-endring og betydning i mRNA uttrykket etter re ekspresjon av HIF-1α (horisontal akse).
Omfattende binding av re-uttrykt HIF-1α på nye funksjonelle nettsider
i motsetning til begrensede virkninger på eksisterende HIF-2 binding , re-uttrykk for HIF-1α ført til omfattende ny binding over genomet, med spesifikk HIF-1α signal identifisert på 5147 steder. Merket korrelasjon ble observert mellom HIF-1α og HIF-1β binding i disse HIF-1α re-uttrykke celler (fig 1A, sammenligne iv og v). I tråd med dette, PCA bekreftet sterk samvariasjon mellom HIF-1α og HIF-1β i HIF-1α re-uttrykke celler som indikerer at disse områdene er i stor grad forskjellig fra de bindende endogene HIF-2α (figur 1B, sammenligne vektorer HIF-1α ( 1αRE) og HIF-1β (1αRE) og kontrast med HIF-2α (VA) og HIF-1β (VA)). Samlet utgjør disse funnene tyder på at etter sin re-uttrykk HIF-1α binder seg til et stort antall nettsteder distinkte fra endogene HIF-2a områder, mest sannsynlig som en HIF-1α /HIF-1β heterodimer. Videre (leser antall kartleggings til peak regioner) total HIF-1β kromatin immunoprecipitation signal økt ca 2-3 ganger etter re-uttrykk for HIF-1α (se også S5 figur). Dette tyder på at HIF-1β protein overflod ikke er begrensende for endogen HIF bindende i VHL-defekte 786-0 celler, og at ytterligere HIF-1β kan rekrutteres til DNA-bindingssteder følgende økt uttrykk for en dimerization partner.
Analyse av HIF-1α bindende, indikerte at den pan-genomisk fordelingen var påfallende ikke-tilfeldig, blir sterkt beriket nær bestemte klasser av genet promoter (fig 1c og 1d), og tett ligner HIF-1a-spesifikke mønstre av binding i annen celletyper [10,20,22,39]. Annotering av HIF-1α «nærmeste-nabo» promotorer, ifølge transkripsjon klasse, viste at 68% er assosiert med protein-kodende gener, mens resten i hovedsak er knyttet til lange ikke-kodende RNA (lncRNAs) og antisens-RNA (fig 1D ); proporsjoner som ligner på de som er rapportert for HIF-1α i MCF7 brystkreftceller [39].
neste søkt å definere funksjonelle virkningene av denne nye HIF-1α bindende for genuttrykk. Pan-genomisk genekspresjon ble profilert i kontroll- og HIF-1a re-uttrykke celler ved RNA-seq. Gener ble rangert i henhold til en kombinasjon av fold-endring i transkripsjon nivå etter re-ekspresjon av HIF-1α og betydningen av denne endringen [35]. Ved hjelp av denne rangeringen, genet sett berikelse analyse (GSEA) [34] av nærmeste genet til hver HIF-1α bindingssetet viste en svært signifikant (p 0,001) sammenheng mellom HIF-1α bindende og positiv, men ikke negativ, regulering av disse transkripsjoner (fig 1E). Dette er i overensstemmelse med tidligere funn om at HIF opptrer hovedsakelig som en transkripsjonen aktivator [10,19]. Det indikerer også at den nye HIF-1α binding er funksjonelle, og har direkte og i stor grad positive effekter på uttrykk over et stort antall gener.
I kontrast, observerte vi noen effekter av HIF-1α re-uttrykk på karakterutskriften nivåer (nærmeste nabo) HIF-2α bindende gener. GSEA demonstrerte en positiv, men ikke signifikant (p = 0,15) virkning av HIF-1α re-ekspresjon på ekspresjon av HIF-2a-bindings gener (S6 Fig), antagelig som en direkte effekt av HIF-1α binding til noen av disse områder (fig 3C). Viktigere var det ingen tegn til store nedregulering av HIF-2a bindende gener (dvs. ingen berikelse av HIF-2α bindende gener blant downregulated gener) som følge av HIF-1α re-uttrykk i 786-O celler. Dette bekrefter funn som gjen uttrykte HIF-1α ikke signifikant motvirke HIF-2α aktivitet på tvers av genomet.
Overuttrykte HIF-2a videre aktiviserer sine endogene mål
Siden overekspresjon av HIF- 2α i 786-O celler har motsatt effekt på tumor xenograft vekst for å re-uttrykk for villtype HIF-1α [11], vi neste undersøkt effekten av å øke HIF-2α nivåer på HIF bindende og genuttrykk. Vi først søkt å skille om binding av HIF-2α i VHL defekte 786-O-celler er mettet eller om overekspresjon av HIF-2α ville øke bindingen på områder som allerede er okkupert i kontrollceller. For å teste dette, korrelert vi styrken i HIF-2α bindende signaler i cellene overekspresjon transfektert HIF-2α med det i kontrollcellene. Denne viste en økning i både HIF-2α signaler og HIF-1 p signaler ved de fleste av endogen HIF-2a bindingsseter følgende HIF-2α overekspresjon (S7 figur) indikerer at endogene nivåer av HIF-2α i 786-0 celler er ikke tilstrekkelig til fullt laste disse HIF-2α bindingssteder.
Omfattende ikke-kanoniske binding av overexpressed HIF-2α
Bemerkelsesverdig imidlertid pan-genomisk analyse avdekket totalt 5283 diskrete HIF-2a bindingssteder i 786-0 cellene overekspresjon HIF-2α. Disse områdene omfatter mange av dem okkupert av endogen HIF-2α. I motsetning til de funnene følgende gjen uttrykk for HIF-1α, varmekart analyse av HIF-2α og HIF-1β bindende indikerte at mange av disse områdene er okkupert utelukkende av HIF-2α, uten HIF-1β (figur 2A, sammenligne iii og iv). Overensstemmende med denne, PCA-analyse viste at transfektert HIF-2α og HIF-1β binding samtidig variere mindre utstrekning i celler som overuttrykker transfektert HIF-2α enn i kontrollcellene (figur 2B).
(A) HIF- 2a bindingssteder i HIF-2α overekspresjon celler ble identifisert ved topp ringer og rangert på den vertikale akse i samsvar med signalintensiteten. Varmekart av disse områdene (± 5kb på horisontalaksen) som viser flis seq lese tetthet for de angitte HIF underenhetene ble generert for begge kontrollcellene (I, II) og cellene med HIF-2α overuttrykt (III, IV). I motsetning til re-uttrykkes HIF-1α, binder overuttrykt HIF-2α til et stort antall steder (sammenlign I og III), uten HIF-1β (sammenlign iii og iv) og har liten effekt på fordelingen av HIF-1β ( sammenligne ii og iv). (B) Biplot viser Principal Component Analysis (PCA) chip-seq signalintensitet (RPKM verdier) for både individuelle bindingsseter (prikker) og HIF-subenheter (vektorer) på tvers av alle HIF-bindingsseter som er identifisert i kontrollceller og i HIF- 2α overekspresjon celler. Nettsteder bindende endogen HIF-2α i kontrollceller er vist i blått, mens områder bindende re-uttrykt HIF-1α er vist i rødt, sider bindende både er farget lilla og de resterende områdene er farget grå. PCA for HIF subenheter viser at HIF-2α og HIF-1β co-varierer nærmere i kontrollceller (sammenligne HIF2α (VA) og HIF1β (VA)) enn i overekspresjon celler (sammenlign HIF2α (2αOE) og HIF1β (2αOE) ). (C) Histogram av avstanden til nærmeste transkripsjon start hotellet (TSS) for HIF-2α bindingsseter i celler som overuttrykker HIF-2α. (D) HIF-2α bindingsseter i HIF-2a overekspresjon celler ble kategorisert i henhold til klassen (Ensemble) av nærmeste genet. Den relative frekvensen for hver klasse er vist med kakediagram. Gene sett berikelse analyse (GSEA) for settet av gener nærmest (E) HIF-2a bindingssteder i kontrollceller og (F) nylig identifiserte HIF-2α bindingsseter i overekspresjon cellene når gener rangeres etter til mappen endring og betydning i mRNA uttrykket etter overekspresjon av HIF-2α (horisontal akse).
Som med HIF-1α bindende i re-uttrykke celler, fordelingen av transfekterte HIF-2a bindingssteder var påfallende non -uniform tvers av genomet (figur 2C og 2D). Interessant, til tross for den store økningen i antall områder de dannet et mønster som ligner den som ble observert for endogen HIF-2α i begge disse (S8 figur) og ikke-CCRC (MCF7) celler [10,39], men forskjellig fra for HIF-1α. I motsetning til HIF-1α, fordelingen var mer promoter-distal (figur 2C). Videre, som med de endogene HIF-2α bindingsmønstre, annotering av «nærmeste nabo» gener viste at en vesentlig større andel var på ikke-kodende genet loci, enn det som ble observert for re-introdusert eller endogen HIF-1α (figur 2D). Disse forskjellene mellom HIF-a-isoformer, som ble observert uavhengig av celletype uttrykksnivå eller antall steder bundet, tyder på at evnen til å gjenkjenne promotor-fjern enhancers ved ikke-kodende genet loci versus promoter proksimale områder er en medfødt egenskap av HIF- α-isoformer.
til slutt, søkte vi å finne ut om økt belastning av eksisterende HIF-2α bindingsseter, eller binding av HIF-2α på nyoppdagede områder, eller begge deler, er assosiert med funksjonelle effekter på genuttrykk. Vi brukte GSEA å teste anrikning av HIF-bindende loci (nærmeste nabo-gener) blant gener hvis ekspresjon ble endret av HIF-2α overekspresjon (som målt ved RNA-seq). Vi utførte denne analysen for både bindingssetene som var opptatt av endogen HIF-2α, og de som nylig ble observert etter HIF-2α overekspresjon. En forening med positiv, men ikke negativ, var effektene på genekspresjon observert for begge grupper av bindende loci (figur 2E og 2F). Dermed er konstitutiv aktivering av HIF-2α i 786-0 celler submaksimal og økende HIF-2α fører til både kvantitative og kvalitative effekter på HIF målet genuttrykk.
Interessant, nær inspeksjon av de tilsynelatende nye bindingsseter ofte avslørt lave nivåer av HIF binding på disse stedene i kontrollcellene, som var under grensene for identifikasjon av vesentlig binding, men ovenfor de som ble observert ved et sett med kontrollregioner (S9A Fig). Dette tyder på at disse signalene er faktisk «ekte» og reflektere ujevn lasting av potensielle HIF bindingsseter (S9B figur).
Analyse av HIF-2α og HIF-1α bindende motiver
Siden HIF -1 og HIF-2 er rapportert å gjenkjenne en identisk kjerne DNA-bindende sekvens [10], er det uklart hvorfor binding av HIF-1α og HIF-2α fordeles så på en annen måte. For å løse dette vi startet ved å analysere immunoutfelt sekvenser for transkripsjonsfaktor bindende motivene ved hjelp MEME-chip. Som forventet, den kanoniske HRE motiv (Jaspar /MA0259.1) [40] ble beriket i alle sett av bindingssteder; de som er okkupert av endogene HIF-2α, overexpressed HIF-2α og re-uttrykkes HIF-1α og anrikning var positivt korrelert med styrken av HIF-1β signal (fig 3A og 3B og S8C Fig, blå linje). Den nest mest beriket motivet var en AP-1 (TRE) binding motiv (Jaspar /MA0491.1) [40]. Interessant, dette berikelse ble ganske ulikt fordelt mellom HIF-1α og HIF-2α bindende loci. Sterk anrikning ble observert i sekvenser bindingsoveruttrykt HIF-2α (figur 3B). Men i markert kontrast til den HRE motiv, i bindingen set for over-uttrykte HIF-2α, ble anrikning av AP-1-motivet omvendt korrelert med styrken av HIF-1β binding (figur 3B). Videre er det i settet av HIF-1α binding loci, AP-1-bindingsmotivet betydelig utarmet (figur 3A). Samlet differensial distribusjon av denne AP-1 motiv mellom HIF-1α og HIF-2α bindende loci var svært signifikant (p 10
-16).
