Abstract
Bakgrunn
DNA metylering aberrasjon og mikroRNA (miRNA) deregulering har blitt observert i mange typer kreft. En systematisk studie av methylome og transkriptom i blæren urothelial carcinoma har aldri blitt rapportert.
Metodikk /hovedfunnene
DNA metylering ble profilert av modifisert metylering spesifikke digital karyotypering (MMSDK) og uttrykket av mRNA og mirnas ble analysert ved hjelp av digital genekspresjon (DGE) sekvensering i tumorer og matchet normale tilstøtende vev oppnådd fra 9 blære karsinom urothelial pasienter. Vi fant ut at et sett med betydelig beriket trasé forstyrret i blæren urothelial carcinoma primært relatert til «nevrogenese» og «celledifferensiering» av integrert analyse av -omics data. Videre identifiserte vi en spennende samling av kreftrelaterte gener som ble deregulert på nivåene av DNA metylering og mRNA uttrykk, og vi validert flere av disse genene (HIC1, SLIT2, RASAL1, og KRT17) ved Bisulfite Sequencing PCR og revers transkripsjon qPCR i et panel av 33 blære kreft prøver.
Konklusjon /Betydning
Vi preget profilene mellom methylome og transkriptom i blæren urothelial karsinom, identifisert et sett med betydelig beriket viktige veier, og vist fire abnormt denaturert og uttrykte gener. Sikkert, våre funn belyse en ny vei for grunn blærekreft forskning
Citation. Zhu J, Jiang Z, Gao F, Hu X, Zhou L, Chen J et al. (2011) en systematisk analyse av DNA Metylering og uttrykk for både mRNA og mikroRNA i blærekreft. PLoS ONE 6 (11): e28223. doi: 10,1371 /journal.pone.0028223
Redaktør: Amr H. Sawalha, University of Oklahoma og Oklahoma Medical Research Foundation, United States of America
mottatt: 5 juli 2011; Godkjent: 03.11.2011; Publisert: 30.11.2011
Copyright: © 2011 Zhu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National High Technology Research and Development Program of China (863 Program, 2009AA022707 til XZ), Promotion Program for Shenzhen Key Laboratory, Shenzhen, Kina (CXB200903090055A og CXB201005250016A til ZC). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
som genetiske og epigenetiske forandringer er observert i utviklingen av kreftceller [1], det har blitt teoretisert at de begge spiller viktige roller i onkogenese, indusere endringer i genaktivitet og kromosomstruktur [2]. Grunnforskning å avdekke mekanismene for kreftutvikling er svært viktig for diagnose, behandling og prognose av kreft i klinikken. Den aberrasjon av DNA metylering i kreft kan oppstå som global hypometylering eller locus-spesifikk hypermethylation i CpG island rike arrangører [3]. DNA hypometylering i en kreftcelle er antatt å føre til kromosom ustabilitet og onkogen aktivering [4]. Motsatt er avvikende promoter metylering eller hypermethylation av CpG øyer knyttet gener sterkt assosiert med transcriptional stanse av disse genene [5]. I tillegg til DNA metylering, kan deregulerte mirnas i kreft påvirker uttrykket av gener og veier som er involvert i kreft patogenesen hele veien fra start til metastaser. Noen mirnas tjene som mulige kreftdempere og andre fungere som onkogener [6].
Blærekreft er en av de vanligste kreftformene i verden. I 2008 ble anslagsvis 386,300 nye tilfeller diagnostisert, og 150,200 mennesker døde av blærekreft [7]. Urothelial karsinom i blære, den hyppigst forekommende histologisk type blærekreft, utgjør mer enn 90% av maligne tilfeller av blærekreft [8]. DNA hypometylering er et vanlig fenomen i blærekreft, [9], [10]. I mellomtiden har forholdet mellom DNA-metylering og blærekreft primært blitt studert med hensyn til promoteren hypermethylation av tumorsuppressorgener. Upassende stanse av disse genene hos arrangøren hypermethylation bidrar til kreft initiering, progresjon, invasjon og metastasering [11], [12], [13]. En rekke studier har undersøkt både små og store paneler av DNA metylering hendelser i blærekreft ved bruk av matrise-baserte teknologier [9], [10], [14]. Men genom-wide gjenkjenning studier for å oppnå høy oppløsning metylering data i blærekreft er sjeldne. Svulsten-suppressor og onkogene funksjoner av mirnas har blitt observert i blærekreft samt [15], [16], [17]. Flere miRNA profile av mikromatriser i blærekreft har også blitt gjennomført, men ingen konsekvent konklusjon kan alltid trekkes fra resultatene deres [18], [19], [20].
Basert på ovennevnte observasjoner, vi hypotese som en systematisk analyse på profiler av DNA metylering og uttrykk av både mRNA og mikroRNA i blærekreft vil bidra til å identifisere viktige endringer av blærekreft. Derfor gjennomførte vi et genom-wide metylering analyse i matchet tumor og normal tilstøtende vev fra 9 blære urothelial karsinom pasienter som bruker modifiserte metylering spesifikke digital karyotypering (MMSDK), kombinert med mRNA og miRNA uttrykk data (kombinert med resultatene av våre tidligere studier på mRNA [21] og miRNA [22] av blærekreft), som ble hentet fra tag sekvensering ved hjelp av andre generasjons sekvenseringsteknologi.
Resultater
En oversikt over methylome og transkriptom i blæren urothelial carcinoma
for DNA metylering, et gjennomsnitt på 4,445,972 og 4,525,269 entydig kartlagt koder som var 17 og 18 nt i lengde ble hentet fra 9 forskjellige blære uroteliale karsinom og deres matchede normale tilstøtende vev, henholdsvis. For genekspresjon, DGE bibliotekene generert 3,307,536 og 3,136,370 høy kvalitet koder for tumor og normalt vev, henholdsvis. I ikke-kodende liten RNA (sRNAs) sekvensering, leser totalt 14787388 og 12754928 høy kvalitet ble oppnådd for tumor- og normale vev, henholdsvis. I alt ble 16,236 gener og 543 mirnas oppdages uttrykt i minst ett av svulsten eller normale prøver tilstøtende vev.
For å få en oversikt over forskjellene i DNA metylering mønstre med hensyn til de genuttrykk profiler blære urothelial karsinomer og deres matchede normale tilstøtende vev, ble log2-transformerte, gjennomsnitt-fold endringer mellom tumor og normalt vev for de tre typer koder plottet for hele genomet (figur 1A). På en terskel på | log2Ratio | ≥1 observerte vi noen forskjeller i kodene som representerer metylering status på visse
Mlul
genomisk loci og mRNA uttrykk nivået mellom kreft vev og normale kontroller, Videre, en global opp -regulation av miRNAs i blærekreft ble observert.
A. Genome bredt DNA metylering, mRNA og miRNA profiler fra blærekreft vev og matchet normale tilstøtende vev. De log2-transformerte gjennomsnittsbrette endringer (svulst /normal) for metylering status (rød), mRNA-ekspresjonsnivået (grønn), og miRNA ekspresjonsnivået (blå) fra alle pasienter ble trukket over hele genomet. Y-aksen representerer den log2-forholdet, og de stiplede linjer representerer betydning terskel (| log2Ratio | = 1). B. Fordeling av metylering nivåer i ulike typer kallende regioner mellom blære kreft vev og matchet normale tilstøtende vev. Boksen-tomter for distribusjon av DNA metylering nivåer basert på log2-transform tag ganger endring (tumor /normal) fra MMSDK tvers av alle pasienter ble trukket. Typer inkluderer CpG-rike arrangører, CpG-fattige arrangører, eksoner og introner.
For ytterligere å undersøke metylering status på ulike genomiske regioner, vi sammenlignet de metylering profiler av arrangører med eller uten CpG øyer ( CGIer), eksoner og introner av blæren uroteliale karsinom vev og de matchet normale tilstøtende vev. En tilsvarende nivået på DNA metylering i de undersøkte genomiske regioner ble fordelt mellom to typer vev (Figur 1B, P 0,05, Wilcoxon rank sum test).
Identifikasjon av divergerende loci av DNA metylering og forskjellig uttrykt gener
for ytterligere å studere DNA metylering status på visse genomiske regioner, genomisk loci som svarer til
Mlul
gjenkjennelses var assosiert med gener i henhold til deres relative posisjon i det menneskelige genom. Opp til 9034 individuelle genomisk loci av 5656 unike gener ble identifisert, basert på UCSC Genome Browser. Vi har også identifisert 299 individuelle loci som tilsvarer 274 gener som viser en signifikant forskjellig DNA metylering nivå mellom svulster og kontroller (| log2Ratio | ≥1, FDR P-value≤0.05) (tabell S1). Av vesentlig forskjellige loci, ble 36 loci hypermethylated og 263 loci ble hypomethylated i tumor vevsprøver sammenlignet med matchede normale tilstøtende vevsprøver. BSP validering bekreftet 16 tilfeldig valgte
Mlul
genomisk loci som ble karakterisert som å ha forskjellige metylering nivåer med en gjennomsnittlig suksessrate på 93,8% (figur 2A).
A. Validering resultatene av MMSDK med BSP. For å sammenligne BSP-Sanger-sekvensering av data og dype sekvense MMSDK data,
Mlul
loci som var fast bestemt på å bli differensiert metylert i gjennomsnitt med dyp sekvensering ble validert ved hjelp av BSP. Høyden av søylene representerer den log2-transform gjennomsnitt gangers endring (svulst /normal) i metylering plan på tvers av de 9 pasienter. B. BSP og RT-qPCR resultater for fire kreftassosierte gener undersøkt i 33 pasienter med blærekreft. Metyleringen nivåer av promotorer av fire utvalgte gener (SLIT2, HIC1, RASRAl1, KRT17) og deres ekspresjonsnivå ble evaluert i et panel av 33 prøver. Høyden av søylene representerer den gjennomsnittlige log2 gangers endring (svulst /normal) i metylering nivå (blå) eller ekspresjonsnivået (rød) på tvers av alle pasienter. Stolpene representerer standardfeil. Antall prøver (n) som brukes i valideringen analysen er angitt ved siden av hver standard feil bar.
Mellom blærekreft vev og de matchet normale kontroller, ble 2975 gener oppdages så forskjellig uttrykt inkludert 1560 opp -regulated gener og 1415 nedregulert gener, og 196 mirnas ble uttrykt forskjellig inkludert 156 oppregulert og 40 nedregulert mirnas (| log2Ratio | ≥1, FDR P-value≤0.05) (tabell S2 og tabell S3, en del av mRNA og miRNA data kom fra våre tidligere studier på mRNA [21] og miRNA [22] av blærekreft). Ifølge målrette prediksjon, 56 ut av 196 forskjellig uttrykt mirnas ble spådd å målrette 285 forskjellige mRNA (tabell S4). Som vist i tabell 1, flere oppløste stoff bæreren familiemedlemmer (SLC) var gjennomgående under uttrykt i de fleste av blæren kreftsvulster undersøkt, inklusive et lettes glukosetransportør (SLC2A4), en mitokondriell bærer (SLC25A25), et natrium /kalsium-veksleren ( SLC8A1), en sink transportør (SLC39A14), en kationisk aminosyre transportør (SLC7A2), et stort nøytral aminosyre transportør (SLC43A1), og en monokarboksylsyre transportør (SLC16A1). I tillegg har vi registrert at to natrium-selektive ikke-spennings gated epithelial natriumkanalen (ENaC) gener (SCNN1B og SCNN1G) som er involvert i regulering av intracellulær natrium homeostase var signifikant oppregulert i vår studie [23], [24]. En hepatocytt-vekstfaktor-reseptor (HGFR), også kjent som MET, var også sterkt oppregulert i alle de undersøkte tumorer i vårt studium også. I samsvar med nylig publiserte studier, MIR-182, MIR-183, MIR-10A, MIR-203, og MIR-224 var signifikant oppregulert i svulstene, mens MIR-1, MIR-143, MIR-145 var signifikant nedregulert i tumorvev [25]. I tillegg ble en typisk nedregulering av MIR-133a, MIR-133b og MIR-125b påvist i vår studie også observert tidligere [26]. Bemerkelsesverdig, tumor suppressorer MIR-1 og MIR-133a var begge signifikant under uttrykt i vårt studium, noe som resulterer i aktivering av den forutsagte målgen transgelin 2 (TAGLN2), som har blitt identifisert som et potensielt onkogen. Dette resultatet er i samsvar med eksisterende kunnskap om genuttrykk endringer i blærekreft [16].
Vi utførte integrert analyse av utvalgte gener mellom DNA metylering og genuttrykk. I alt ble 4772 gener med både DNA-metylering data og genuttrykk data identifisert. Som vist i supplerende tabell S5, identifiserte vi 82 samtidig forskjellig denaturert og uttrykte gener ved å møte følgende vilkår: | log2Ratio | ≥1 justert P-value≤0.05, for både DNA metylering og genuttrykk data. Flere kjente kreftassosierte gener (inkludert ADAMTS9, CCND1, HIC1, etc.) utstilt konsekvent avbrutt metylering og uttrykk statuser i flertallet av blære urothelium kreftprøver.
Gene ontologi (GO) og KEGG sti berikelse analyse
for å generere ytterligere innsikt visning av veien forstyrrelse underliggende blærekreft, utførte vi GO og KEGG sti analyse på gensettene inneholder ulikt denaturert områder, forskjellig uttrykt gener identifisert fra mRNA-sekvensering og målet gener deregulerte miRNAs.
Blant alle de genene som inneholder avvikende DNA metylering loci, GO analyse for «biologiske prosesser» og «molekylære funksjon» viste en betydelig berikelse av 19 og 13 GO vilkår, henholdsvis ved hjelp av en FDR P-verdi cutoff av 0,05. De vesentligste beriket GO vilkår i «biologisk prosess» var «nervecellen utvikling», noe som tyder på en avgjørende rolle for differensial metylering i nevrogenese. Tilsvarende bare «axon veiledning» veien ble betydelig anriket (FDR P-verdi: 3.29E-13) via KEGG sti analyse, noe som reflekterer en samstemmighet med GO analyseresultat. Dette resultat antyder en viktig mekanisme for epigenetisk abnormitet i neuron gener som spiller en rolle i blærekreft, som kreft-relaterte axonogenesis og nevrogenesen er blitt observert i prostata kreft [27]. De resterende beriket GO vilkår fra «molekylære funksjon» analyse var hovedsakelig knyttet til ulike transporter aktiviteter (tabell S6).
For differensielt uttrykte gener, 226 GO vilkår i kategorien «biologisk prosess» og 8 GO vilkår i kategorien «molekylære funksjon» ble betydelig anriket på en FDR terskelen til P-value≤0.05 (tabell S7). Fra «biologiske prosesser» analyse, ble en forekomst av negative regulering gener observert i de typiske nedregulert gener. I mellomtiden har vi også merket en betydelig hyppig forekomst av gener involvert i regulering av cellesyklus og mitose blant oppregulert gener. De beriket GO form av «molekylære funksjon» var hovedsakelig knyttet til «protein kinase aktivitet». KEGG sti analyse viser også at flere kjente kreftfrem forbundet trasé ble betydelig forstyrret (FDR P-value≤0.05), f.eks ECM-reseptor-interaksjon, cellesyklus, p53-signalering, og kalsium signalveien. Ulike metabolske veier (slik som de som er involvert i aminosyre metabolisme) ble også observert å bli beriket i deregulerte gener er identifisert av vår studie (FDR P-value≤0.05).
For de målgener av alt det deregulerte mirnas, 149 GO termer ble beriket fra «biologiske prosesser» analyse ved hjelp av lignende terskel. Vanligvis cellulære prosessen, biologiske og metabolske prosess vilkårene ble funnet å være beriket blant miRNA-målgener som ble deregulert i vår studie. Den «molekylære funksjon» Analysen avdekket 11 GO termer som ble betydelig beriket av en FDR terskel på P-value≤0.05. Den mest betydelig anriket GO sikt var «protein-kinase-aktivitet», hvilket antyder en rolle i regulering av kinaseaktivitet. I tillegg pathway analyse av målene i de deregulerte mirnas viste også en betydelig forstyrrelse av cellesyklus, axon veiledning og MAPK signalveier (justert P-value≤0.05) (tabell S8).
For ytterligere å granske forbindelse mellom de tre kategoriene av -omics ble GO gjelder molekylære funksjoner og biologiske prosesser, samt KEGG trasé som ble beriket i mer enn én kategori videre analysert. Farten og KO vilkår beriket i mer enn én kategori er presentert i tabell S9. Så mange som 106 beriket GO vilkår og KEGG trasé ble beriket i vår studie, var de fleste som tett forbundet med kreft. Bemerkelsesverdig, overlapp av betydelig beriket GO vilkår og KEGG trasé mellom tre kategorier av -omics ble gjennomført senere, inkludert en nøkkel neural utvikling sti som heter «axon veiledning». Videre 7 beriket «biologisk prosess» GO vilkår og singelen «molekylære funksjon» GO sikt var hovedsakelig knyttet til «nevrogenese» og «celledifferensiering», noe som tyder på en kombinert regulering av viktige prosesser og funksjoner ved differensial metylering og mRNA og mirnas uttrykk regulering.
kreft-relaterte gener betydelig deregulerte i blærekreft
Gjennom GO sikt berikelse og KEGG sti analyse av utvalgte forskjellig regulert gener, observerte vi at visse gener var både forskjellig metylert og uttrykt som var involvert i betydelige perturbasjonsteknikker trasé, og disse banene ble nært knyttet til ulike tumorigenesis prosesser. For eksempel ble SLIT2 involvert i Axon veiledning vei, og CCND1 var involvert i cellesyklus og p53 signalveien. I tillegg identifiserte vi flere kanoniske kreftassosierte gener som ikke ble beriket i betydelig forstyrret trasé som ADAMTS9, HIC1, RASAL1, både i metylering statuser og uttrykk data (tabell 2).
som DNA metylering aberrasjon i genet arrangører er rapportert å påvirke sine uttrykk nivåer, ble disse metylering områder som ligger i promotorområdene analysert i detaljer. Hypermethylated i kreft 1 (HIC1) og slit homolog 2 (SLIT2) ble identifisert til å ha forskjellig oppregulert metylering status på sine promoter regioner og dramatisk nedregulert uttrykk nivå på tvers av alle blære uroteliale karsinom vevsprøver. Dessuten fant vi at RAS protein aktivator som en (RASAL1) og keratin 17 (KRT17) var tydelig hypomethylated i promoter-regionen og over-uttrykt i tumorprøver sammenlignet med kontrollene. Disse fire gener har blitt identifisert som mulige tumorsuppressorgener eller onkogener i studier av andre tumortyper, [28], [29], [30], [31], men har ikke vært implisert i blærekreft.
for ytterligere å undersøke metylering og uttrykk endringer av HIC1, SLIT2, RASAL1, og KRT17, massiv bisulfite sekvensering av PCR og revers transkripsjon qPCR ble utført i matchet par av kreft og normal tilstøtende vev fra flere ~33 blære urothelial karsinom pasienter (se metoder for detaljer ). Som vist i figur 2B, ble avvik av regional promoter metylering tett forbundet med endret genekspresjon i disse fire genene i blærekreft. I de humane blære urothelial carcinoma undersøkte prøvene, ble øket HIC1 promoter metylering detektert i 100% (30/30) av prøvene og redusert ekspresjon ble observert i 70,0% av 30 tumorprøver. Hypermethylation av SLIT2 promoteren ble observert i 58,6% (17/29) tilfeller, og en betydelig reduksjon av ekspresjon ble påvist ved en hastighet på 86,2% (25/29). Den reduserte Metyleringen frekvens for RASAL1 var 96,7% (29/30), og KRT17 hadde en frekvens på 93,9% (31/33). De tilsvarende økt genekspresjon prisene RASAL1 og KRT17 var 63,3% (19/30) og 78,8% (26/33), henholdsvis. Totalt økte HIC1 og SLIT2 promoter metylering og redusert ekspresjon ble observert på 70,0% og 51,7% av tumorprøver, respektivt. I mellomtiden, hypometylering av RASAL1 og KRT17 arrangører og nedregulering av deres uttrykk ble oppdaget ved en hastighet på 63,3% og 75,8%, henholdsvis.
Diskusjoner
MMSDK teknologi gir en effektiv og kostnads effektiv metode for å analysere på genom DNA-metylering profiler med et forholdsvis høy følsomhet [32]. Metylering nivå oppdaget av MMSDK korrelerer godt med disse validerings resultatene av bisulfite sekvensering av PCR i tilfeldig valgt
Mlul
loci i vår studie. DGE-sekvensering er også en nyttig og følsomt verktøy som gjør det mulig for nøyaktig deteksjon av et bredt spekter av ekspresjonsnivåene av både mRNA og mirnas og således gjør det mulig for differensial ekspresjon analyse av et større spekter av transkripter [33] [34]. Disse to teknologiene både par tag generasjon via enzymet fordøyelsen med neste generasjons dypt sekvensering og gi rom for en følsom komparativ analyse av DNA metylering og genuttrykk.
Generelt et lignende genom-wide metylering mønsteret ble funnet mellom blære tumor og normal tilstøtende vev. Metylering nivåer ved CpG rike og fattige arrangører, eksoner og introner var også lik mellom tumor og normalt vev, støtter de ovennevnte funn angående lignende globale metylering mønstre. På gennivå, er det vel kjent at inaktivering av tumor-suppressor-gener ved setespesifikk hypermethylation bidrar til initiering og progresjon av humane ondartede sykdommer [2], [35]. Hypermethylation av HIC1 og den tilhørende reduksjon i HIC1 uttrykk er et vanlig trekk i en rekke kreftformer, slik som human brystcancer [28], akutt myeloid leukemi [36], og prostatakreft [37]. I blærekreft, har en lignende studie også gjennomført at kvantitativ metylering spesifikke PCR ble gjort på 17-genet arrangører inkludert HIC1 i 96 ondartede og 30 normale uroteliale prøver [38]. funnet at metylering frekvensene av HIC1 promoter i ondartede og normale urothelium var 21,9% og 16,7%, respektivt. De viste ingen signifikant forskjell mellom ondartede og normale urothelial vev. Her rapporterte vi at hypermethylation av HIC1 og den resulterende redusert uttrykk for HIC1 mRNA i blærekreft. Forskjellen mellom vår studie og Yates DR undersøkelse kan forklares med den annen oppløsning av teknologier, som vi anvendt med høy oppløsning dyp sekvenseringsteknologi mens Yates DR-gruppen anvendes forholdsvis lav oppløsning teknologi for kvantitativ MSP, eller ved forskjellige prøvetakingsstrategi, som vi samlet nøyaktig matchet par prøver av tumorvev og normal tilstøtende vev fra de samme pasientene, mens de fleste av tumorvev at Yates DR gruppe samlet ikke har matchet normalt vev. HIC1 er en kandidat tumor suppressor lokalisert ved 17p13.3, en region ofte funnet å være hypermethylated eller slettes i mange typer utbredt humane tumorer [39]. Hele HIC1 genet regionen er omfattet innenfor et tett CpG øy som er normalt unmethylated. HIC1 (hypermethylated på kreft 1) er vist å være involvert i en kompleks signalveien som hemmer p53-mediert DNA-skade apoptotisk respons i ferd med tumorgenese [40], [41]. Epigenetisk inaktivering av HIC1 ville indusere deacetyleringen av p53, forstyrre dens funksjon og som resulterer i en redusert apoptotisk respons til DNA-skade, som fører til onkogenese og fremme tumorprogresjon [35], [41], [42]. Derfor vår forskning indikerte at arrangøren CpG island hypermethylation forårsaket HIC1 transkripsjon inaktivering og kan forstyrre den komplekse HIC1-p53 signalveien i blærekreft.
Slit genet familien (SLIT1, SLIT2, og SLIT3) er en nylig preget familie av utskilte insektfordrivende midler i axon veiledning og neuronal migrasjon under utvikling av sentralnervesystemet [43], [44]. Flere studier har vist at SLIT2 er epigenetiske til taushet ved hypermethylation av promotorområdet i et bredt spekter av andre tumorer, slik som lunge, bryst, gliom, tykktarm, og cervical cancer, som fører til inaktivering av SLIT2 uttrykk [29], [ ,,,0],45], [46], [47]. Det kondisjonerte medium fra SLIT2-transfekterte celler reduserer cellevekst og induserer apoptose av kolorektal karsinom-cellelinjer, som impliserer at SLIT2 har tumor-suppressor aktiviteter [45]. I tillegg har flere studier vist at SLIT2 hemmer tumorvekst og metastasering av en mekanisme som innebærer regulering av tumor migrasjon, invasjon, apoptose, og veksten i brystkreft, fibrosarkom, og plateepitelkarsinom [48], [49]. Hypermethylation på arrangører av gener (SLIT1, SLIT2, SLIT3, ROBO1, og ROBO3) involvert i Slit-Robo sti som resulterer i nedregulert genekspresjon ble også identifisert i invasiv livmorhalskreft [46]. Dette arbeidet identifisert at tumor suppressor genet, SLIT2, som hemmet tumorvekst og metastasering, ble funnet inaktivert av arrangøren hypermethylation i blæren urothelial carcinoma også.
Tidligere studier identifisert hypermethyled promoter regioner i noen vanlig metylert gener (RASSF1A , p16, MLH1, MGMT, HOXA9) i ulike typer kreft. Vi har forsøkt å bekrefte disse resultater i blæren urothelial carcinoma i tillegg. Dessverre var det ingen
Mlul
enzym fordøyelsen nettsider for å bli funnet i arrangører av disse genene, og dermed kunne vi ikke riktig adressere metylering nivåer av arrangører i disse ofte denaturert genene på grunn av teknologiske begrensninger. Men vi fant ut at MLH1 og HOXA9, men ikke de andre av disse ofte metylert genene, var betydelig under uttrykt i blærekreft, som var i samsvar med tidligere studier [10], [50].
I kontrast til hypermethylation, bidrar DNA hypometylering til tumorgenese av aktiverende proto-onkogener [5], noe som bidrar til kreftutvikling og progresjon [51]. Som nevnt i resultatene av massiv BSP og RT-qPCR tester, RASAL1 metylering nivåene var signifikant nedregulert, og uttrykket nivåer ble dramatisk økt i blæren kreftceller i 66,7% og 53,3%, henholdsvis av pasientene med blærekreft undersøkte. Men motstridende resultater indikerer at RASAL1 ble stille gjennom arrangøren CpG metylering i flere svulster [52] og at en reduksjon i RASAL1 uttrykk kan bidra til kreftutvikling og var assosiert med tumorprogresjon [30], [53] har blitt publisert. RASAL1 er en RAS-GTPase aktiverende protein som slår av RAS aktivitet ved å konvertere GTPase fra sin aktive, GTP bundet form til inaktiv, GDP-bundet form [54]. RAS-genfamilien er kjent som en av de mest vanlige aktiverte onkogener i humane cancere [55]. Overraskende, RASAL1, RAS signalet terminatoren, var høyt over-uttrykt og hypometylering av promotoren ble også observert i de fleste av de undersøkte blærekreft vev i vår forskning. Videre studier er nødvendig for å løse de mekanismene som ligger til grunn RASAL1 over-uttrykk og epigenetisk avvik i blærekreft.
Keratin 17, også kjent som cytokeratin 17, er involvert i dannelse og vedlikehold av ulike huden vedheng, spesielt i å bestemme form og orientering av hår. Ekspresjonen av KRT17 er blitt funnet å være oppregulert i cancervev i livmorhals [56], tunge [57], oral [58], og spiserøret squamous cell carcinomas [59]. Øket ekspresjon av keratin 17 i endotelceller kan bidra til angiogenese [60] og kan fremme epitelproliferasjon og tumorvekst [31]. Keratin 17 har også blitt rapportert som en mulig diagnostisk markør for oral plateepitelkarsinom [58], og det kan være knyttet til klinisk progresjon og differensiering av livmorhalskreft [61], [62]. Men det er få rapporter om epigenetisk regulering og uttrykk av keratin 17 i blærekreft. I denne studien, har vi identifisert en økning av KRT17 ekspresjon i blærecancer vev sammenlignet med deres normale motstykker. Vi har også observert hypometylering av KRT17 promoter i blæren urothelial karsinom. KRT17 kan være en antatt onkogen som aktiveres gjennom hypometylering på arrangøren.
Vår studie understreker også viktigheten av å undersøke de funksjonelle rollene til mRNA og mirnas i tumorigenesis av blæren urothelial karsinom. Met proto-onkogen (MET), en hepatocytt-vekstfaktor-reseptor (HGFR) som har blitt foreslått å spille en viktig rolle i utviklingen av ulike epiteliale og nonepithelial tumorer, ble funnet å være betydelig overuttrykt i vårt studium av blærekreft i samsvar med tidligere rapporter om blærekreft [63], hematopoetiske maligniteter [64], og nyrecellekarsinomer [65]. MET er konstitutivt aktivert som et proto-onkogen-reseptor-tyrosinkinase, som fremmer invasjon og migrering ved å aktivere en rekke signaloverføringsveier i mange typer av karsinomer [66]. Interessant, nedregulering av MIR-1, som retter seg mot MET, ble observert i vår studie, i likhet med tidligere studier i lungekreft og menneskelig rabdomyosakrom [67], [68]. MiR-1 antas å inhibere celleproliferering og migrering av negativ regulering av c-Met signalveien. Derfor ville karakterisering av onkogener målrettet av mirnas være av stor verdi i å forbedre vår forståelse av sykdomsfremkallende mekanismene bak blærekreft.
Det er allment anerkjent at forstyrret veier, ikke bare deregulerte enkelte gener, drive tumorigenesis prosessen . I vår søken etter funksjonelle relevansen av endrede metylering nivåer og genekspresjon, fant vi at KEGG «axon veiledning» veien ble betydelig anriket i de forskjellig uttrykte gener (mRNA og mirnas) og at det var lapper med trasé beriket for relevante gener med forskjellig denaturert loci. Axon veiledning representerer en viktig fase i løpet av hvilken axoner strekker seg til sine korrekte mål under dannelsen av nevrale nettverk og beslektede molekyler som ble antatt å være vidt uttrykt og som er involvert i tumorutvikling, angiogenese og metastase [69]. Vi har også observert slike overlappinger for betydelig beriket GO vilkår, som i hovedsak relatert til «nevrogenese» og «celledifferensiering» (f.eks neuron differensiering, neurogenesis, positiv regulering av celledifferensiering) mellom tre typer omics data.
