Abstract
MUC16 (ca125) tilhører en familie av høy molekylvekt O-glykosylert proteiner som kalles slimstoffer. Mens MUC16 er godt kjent som en biomarkør i eggstokkreft, sitt uttrykk mønster i bukspyttkjertelkreft (PC), den fjerde største årsaken til kreft dødsfall i USA, er fortsatt ukjent. Målet med vår studie var å analysere uttrykk for MUC16 under innvielsen, progresjon og metastasering av PC for mulige innblanding i PC diagnose, prognose og terapi. I denne studien ble en microarray som inneholder vev fra friske og PC-pasienter brukes til å undersøke differensial protein uttrykk for MUC16 i PC. MUC16 mRNA-nivåer ble også målt ved hjelp av RT-PCR i de normale humane pankreas, pankreatitt, og PC-vev. For å undersøke dens uttrykk mønster under PC metastaser, ble vevsprøver fra den primære bukspyttkjertelen tumor og metastaser (fra samme pasient) i lymfeknuter, lever, lunge og omentum fra PC-pasienter Stage IV analysert. For å bestemme sin tilknytning i initiering av PC, ble vev fra PC-pasienter inneholder pre-neoplastiske lesjoner av varierende karakterer farget for MUC16. Til slutt ble MUC16 ekspresjon analysert i 18 humane PC-cellelinjer. MUC16 er ikke uttrykt i normal pancreatic kanaler og er sterkt oppregulert i PC og oppdaget i pankreatitt vev. Det er første gang påvist i høy grad pre-neoplastiske lesjoner foregå invasiv adenokarsinom, noe som tyder på at dens oppregulering er en sen hendelse under initiering av denne sykdommen. MUC16 ekspresjon synes å være sterkere i metastatiske lesjoner sammenlignet med den primære tumor, noe som tyder på en rolle i PC-metastasering. Vi har også identifisert PC-cellelinjer som uttrykker MUC16, som kan anvendes i fremtidige studier for å klargjøre dets funksjonelle rolle i PC. Til sammen våre resultater viser at MUC16 uttrykk er betydelig økt i PC og kan spille en potensiell rolle i utviklingen av denne sykdommen
Citation. Haridas D, Chakraborty S, Ponnusamy MP, Lakshmanan jeg, Rachagani S, Cruz E, et al. (2011) Pathobiological Konsekvenser av MUC16 Expression i kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE 6 (10): e26839. doi: 10,1371 /journal.pone.0026839
Redaktør: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, USA
mottatt: 30 juli 2011; Godkjent: 04.10.2011; Publisert: 31 oktober 2011
Copyright: © 2011 Haridas et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Institutes of Health (RO1 CA78590, RO1 CA131944, UO1 EDRN CA111294 og P50 SPORE CA127297), Department of Defense (BC101014), Susan G. Komen Foundation (KG070826), NCI Cancer Center Support Grant 5 P30 CA036727-2452 og Nebraska Department of Health Institutional LB595 Grant for kreft og røyking Disease Research. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen (PC) er en ekstremt dødelig malignitet. Ifølge American Cancer Society, anslått antall nye tilfeller og dødsfall på grunn av PC i USA i 2010 var 43 140 og 36 800 henholdsvis med en fem års overlevelse på 6% [1]. Adenokarsinom av pancreatic kanaler står for nesten 95% av alle pankreastumorer [2] og er forbundet med en median overlevelse på bare 3-6 måneder. Den dårlige utsikter for PC-pasienter skyldes i stor grad til klinisk stille natur dette malignitet som ofte fører til sin diagnose på et avansert og ofte inoperabel stadium av sykdommen.
Flere proteiner har blitt rapportert å være dysregulerte under initiering og progresjon av PC. En slik familie av proteiner som uttrykk er abnormt oppregulert i PC er slimstoffer. Disse er av høy molekylvekt, tungt glykosylerte proteiner som tjener flere funksjoner i normale vev, inkludert smøring og dannelse av skadelige patogener [3] – [7]. Deres uttrykk er tydeligvis endret på flere maligne tilstander, inkludert PC [8].
CA125 (MUC16) er en celleoverflateglykoprotein som først ble identifisert ved Bast
et al
i 1981 [9]. MUC16 spaltes og kaster inn i blodet, og har vært gjenstand for aktiv forskning som en biomarkør i serum for en rekke krefttyper [10]. Det er foreløpig den eneste serum svulst markør rutinemessig brukt i klinikker for diagnostisering og spesielt forutsi prognose i eggstokkreft pasienter [11]. CA125 er den mest kjente antistoff som gjenkjenner MUC16 både i vev, og i kroppsvæsker og er rettet mot en epitop lokalisert i tandem gjentagelse region av proteinet MUC16 [4], [12].
strukturelt protein MUC16 består av et ekstracellulært N-terminalt domene som består av mer enn 22.000 aminosyrerester og menes å være tungt glykosylert. Den sentrale domenet inneholder opp til 60 glykosylerte peptidsekvenser gjentatt i tandem (et karakteristisk trekk ved mucin familien) etterfulgt av et C-terminalt domene som inneholder en potensiell proteolytisk spaltingssete, et transmembrandomene og en kort cytoplasmatisk hale med flere potensielle steder av fosforylering [13], [14].
i denne studien har vi analysert uttrykket av MUC16 i PC vev og cellelinjer ved hjelp av CA125 monoklonalt antistoff. Videre har vi analysert ekspresjon av dens mRNA i vev isolert fra PC og pankreatitt hos pasienter ved RT-PCR. Det overordnede målet med vår studie var å undersøke om det er en differensial uttrykk for MUC16 under progresjon og utvikling av PC og til å undersøke en mulig sammenheng mellom MUC16 uttrykk og tumor egenskaper. Vår studie tyder på at MUC16 ikke er uttrykt i normal bukspyttkjertelen kanaler men oppregulert i løpet av PC progresjon og utvikling, og dermed tyder på en mulig rolle for MUC16 i PC patogenesen og dens klinisk diagnose.
Materialer og metoder
Etikk Uttalelse
En skriftlig informert samtykke ble innhentet for alle ikke-arkiv vev før vev samling for alle prøver tatt gjennom UNMC.
vevsprøve og cellelinjer
Femti -eight PC og 8 prøver normale bukspyttkjertelen vev (formalinfiksert og parafin-embedded) ble hentet fra Accumax (Array antall A207IV). Matrisen inneholdt vev klassifisert som ikke-neoplastiske (8 plasser), godt differensiert adenokarsinom (12 plasser), moderat differensiert adenokarsinom (22 flekker) og dårlig differensiert adenokarsinom (24 flekker). Uttrykk for MUC16 ble analysert ved RT-PCR fra 2 normale menneskelige bukspyttkjertelen vev, 6 pankreatitt og 17 kreft i bukspyttkjertelen vev som ble hentet etter godkjenning av protokollen av IRB (IRB-491-97) ved University of Nebraska Medical Center, Omaha , NE. MRNA ble omdannet til cDNA ved anvendelse av oligo dT primere. Primerne som brukes for å kontrollere om MUC16 ekspresjon er MUC16_F-5 «GTCCCCAACAGGCACCACACCG-3» og MUC16_R-5’GGGCACTGTTGCTGGACGTTGTATT-3 «og PCR-produktet ble sekvensen verifisert ved DNA-sekvensering UNMC innretningen.
Videre formalinfiksert og parafin innebygd (FFPE) PC vevsprøver fra 34 PC-pasienter som består av normal bukspyttkjertelen (7 flekker), primær PC (31 flekker) og metastaser til leveren (23 plasser), lungene (11 flekker), lymfeknute (17 plasser) og omentum /membran (11 plasser) hentet fra University of Nebraska Medical Center raske obduksjon program (IRB-091-01) ble også analysert for å undersøke endringen i MUC16 uttrykk under PC metastasering. Under den raske obduksjon programmet ved UNMC, er vev fra donor pasienter høstet i løpet av tre timer etter døden og at prøvestykkene flash frosset i flytende nitrogen og plassert i formalin for øyeblikkelig fiksering. Microarray (TMA) laget av parafin blokker av vev fra den raske obduksjonen programmet ble brukt for MUC16 farging. I tillegg til tumor kjerner, hver blokk inneholdt kontrollprøver fra de ikke-neoplastisk tykktarm, nyre og bukspyttkjertel tumor tilstøtende fra de samme donorer. De TMA blokker ble skåret i 4 um deler og montert på ladede lysbilder
Tjuefem PC vevsprøver som inneholder bukspyttkjertelen intraepitelial Svulster (Panin) lesjoner av varierende karakterer (Antall lesjoner identifiseres-Panin I- 163;. Panin II-197; Panin III-26 og normale kanaler-140) i tilknytning til de områdene av PC ble også oppnådd etter godkjenning av protokollen av Institutional Review Board (IRB-491-97) ved University of Nebraska Medical Center, Omaha, NE. Fire mikron tykke parafinsnitt ble kuttet og farget med hematoxylin og eosin for patologisk evaluering. Karakteren av PanINs og MUC16 uttrykk i hver type Panin lesjon ble vurdert ved kirurgisk patologen (SML).
uttrykk for MUC16 mRNA og protein ble også analysert i et panel av PC cellelinjer (MiaPaca, Panc89 Dang, VVS, SU86.86, Colo357, CD18 /HPAF, HUPT3, Capan1, suit2, CD11, T3M4, FG, Aspc1, Panc1, HG625, Capan2 og BxPC3) ved hjelp av primere tidligere nevnt. Cellelinjene ble dyrket ved 37 ° C i nærvær av 5% CO
2 i DMEM supplementert med 10% føtalt kalveserum og antibiotika (penicillin og streptomycin 100 ug /ml). Alle cellelinjer ble oppnådd fra ATCC.
Immunohistochemistry
Glassene ble behandlet for farging som beskrevet tidligere [15], [16]. Den anti MUC16 monoklonalt antistoff (M11-klone, produsert av Dako, Carpinteria, CA, USA) ble brukt som den primære antistoff. (Lager: 764 mikrogram /ml fortynningsfaktoren 1:500)
Alle fargede objektglass ble scoret av en patolog under et Nikon E400 lysmikroskop og representative fotografier tatt. Fargeintensitet for MUC16 (ca125) ble scoret på en skala fra 0-3 (0-negative, 1-svak, 2-moderat, 3-sterk immunoreaktivitets). Prosentandelen av celler positive for MUC16 innenfor et gitt lesjon ble scoret på en skala fra 1-4 på følgende måte: 1: 0-25% celler positiv; 2: 26-50% positive; 3: 51-75% positive; og 4: 76-100% positive. At resultatet av fargingsintensitet, og andelen av immunreaktive celler ble deretter multiplisert for å oppnå en sammensatt score i området fra 0 til 12. En seksjon ble betraktet som «positiv» for MUC16 hvis intensiteten av MUC16 var 1. Følgelig vev ble også klassifisert som «positive» eller «negative» for MUC16 uttrykk.
Confocal immunfluorescens mikros
PC celler ble behandlet for konfokalmikroskopi som beskrevet tidligere [17], [18] . I korthet ble cellene dyrket ved 37 ° C i 48 timer på sterile glass dekkglass, vasket med Hanks-buffer inneholdende 0,1 M HEPES og fiksert i iskald metanol ved 20 ° C i 2 min. -Celler ble blokkert med 10% geiteserum i fosfatbufret saltvann (PBS) i 30 min, etterfulgt av inkubasjon med anti-MUC16 monoklonalt antistoff (CA125) fortynnet i PBS (CA125 lager: 764 ug /ml; fortynningsfaktor 1:500) for 1 time ved romtemperatur. Cellene ble vasket i 10 min (x 4 ganger) med PBS og deretter inkubert med FITC-konjugert geite-anti-muse-sekundært antistoff i 30 min. Celler ble igjen vasket (10 min x 4) og montert på glassplater i anti-fade Vectashield montering medium (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA).
Western blot analyse
PC celle linjer ble bearbeidet for proteinekstraksjon og ble etterfulgt av western-blotting av SDS-agarose som beskrevet tidligere [17], [18]. Varme denaturert lysatene ble løst på en 2% SDS-agarosegel ved elektroforese og senere overført til PVDF membraner. Etter overføring av membranen ble blokkert med 5% fettfri tørrmelk i PBS i 2 timer, og inkubert med anti-MUC16 mAb (lager: 764 ug /ml fortynningsfaktor 1:1000) eller anti-β-actin monoklonalt antistoff over natten ved 4 ° C. Membranene ble vasket med PBS inneholdende 0,1% Tween-20 og deretter inkubert med pepperrot peroksidase-konjugert geit anti-mus antistoffer (sekundære fortynnet 1:2000 i 5% fettfri tørrmelk i PBS) (Amersham Biosciences Buckinghamshire, UK) i 1 time . Signalet ble påvist ved hjelp av forbedret chemiluminescence (ECL, Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK).
RNA Utvinning og RT-PCR
Total RNA ble isolert fra vev ved hjelp av
mir
Vana miRNA isolasjon kit (Ambion, Foster city, CA, USA) og fra cellelinjer ved hjelp av Qiagen RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) i henhold til produsentens protokoll. MRNA isoleres ble omdannet til cDNA ved anvendelse av oligo dT primere. CDNA fortynnet 1:05 ble benyttet for å bestemme ekspresjon av MUC16 mRNA ved bruk av PCR i henhold til tidligere beskrevne protokoll [19]. Produktene ble kjørt på en 1,5% agarosegel inneholdende etidiumbromid (10 ug /ml). Primere som brukes til å sjekke for MUC16 uttrykk er de som har blitt nevnt tidligere.
Statistisk analyse
Kontinuerlige variabler (egcomposite score) ble sammenliknet med en Student tosidige t-test forutsatt ulik varians. Kategoriske variabler (stadium, grad av svulst, orgel av fjernmetastaser) ble sammenliknet med Kruskal Wallis ANOVA test eller Fishers eksakte test. En p-verdi 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant. All statistisk analyse ble gjort ved hjelp MedCalc for Windows versjon 9.6.4.0 programvare (MedCalc programvare bvba, Mariakerke, Belgia).
Resultater
MUC16 er forskjellig uttrykt i bukspyttkjertelen adenokarsinom vev
for å identifisere den uttrykksmønster av MUC16 i PC-patogenesen, ble dets ekspresjon i forhold mellom ikke-neoplastiske kanalene og pankreatisk adenokarsinom ved hjelp av et vev microarray som omfatter ikke-neoplastisk bukspyttkjertel (n = 8) og vev fra primær PC av varierende karakterer (n = 58 ). En vevsprøve ble ansett å være positiv hvis minst 5% av cellene uttrykte MUC16. MUC16 uttrykk ble ikke observert i de ikke-neoplastiske kanaler (figur 1A). Men i 38/58 (65%) tilfeller av PC, ondartet kanaler var positive for MUC16. Ekspresjonen av MUC16 var signifikant høyere hos PC sammenlignet med de ikke-neoplastiske kanalene (p = 0.003 ved den tosidige Fishers eksakte test). Videre, for å avgjøre om det er en variasjon i MUC16 uttrykk med utviklingen av PC, sammenlignet vi uttrykket mellom PC vev klassifisert av tumorstadium og klasse. Det var en progressiv økning i ekspresjon av MUC16 med tap av tumor differensiering, med 50% av den godt differensiert (6/12) 59% av den moderat differensierte (13/22) og 66% av dårlig differensierte PC vev (16/24) er positiv (figur 1A). Mens uttrykk for MUC16 var ikke signifikant forskjellig mellom de tre gruppene, var gjennomsnittlig sammensatt score var betydelig høyere i moderat og dårlig differensiert PC sammenlignet med godt differensierte adenokarsinomer (p = 0,02 og 0,001 henholdsvis). Men det sammensatte stillingen var ikke signifikant forskjellig mellom moderate og dårlig differensierte PC tilfeller. Dette tyder på at MUC16 ekspresjonssystemer øker betydelig med tap av differensiering av PC-vev.
Snittene ble oppnådd fra ACCUMAX i form av en matrise, og ble farget med anti-MUC16 monoklonalt antistoff vev. De fargede seksjonene ble observert under mikroskopet og immunoreaktivitets ble dømt av intensiteten og spredning av den mørke flekken. Anti-MUC16 antistoff viste ingen farging i normal pankreas vev (begge kanaler og acini), mens en sterk farging ble observert i cancervev. (A) Box plot som representerer resultatet av MUC16 tvers av de ulike graderinger av PC. Fra boksen plottet vi observerte immunoreaktiviteten til å være høyere i dårlig (D) og moderat differensierte (C) vev i forhold til godt differensierte (B) vev. Den normale bukspyttkjertelen (A) vev er også negativ. Representative deler demonstrerer MUC16 uttrykk i normale bukspyttkjertelen kanaler og ulike grader av invasiv adenokarsinom vises. Legg merke til den dominerende membranfarging av MUC16 i PC. (B) Expression studier av MUC16 i normal, pankreatitt og kreft i bukspyttkjertelen vev ved RT-PCR. RT-PCR ble utført på mRNA isolert fra normalt humant pankreatisk vev (N1, N2), human pankreatitt vev (Pt1-pt6) og human kreft i bukspyttkjertelen vev (PC1-PC17). Ingen forsterkning ble observert i normalt vev, men forsterkning ble observert i kreft i bukspyttkjertelen og pankreatitt vev. Aktin ble anvendt som en intern kontroll.
Den differensielle ekspresjonen av MUC16 i PC ble også undersøkt ved å kontrollere ekspresjonen av MUC16 på transkripsjonsnivået ved isolering av mRNA fra normalt humant pankreatisk, pankreatitt og PC-vev. MUC16 mRNA-ekspresjon var fraværende i normale pankreatiske vev (0/2, 0%), men var til stede i 12/17 (71%) PC og 1/6 (16,7%) pankreatitt vev (figur 1B). De fleste av PC-vev ble klassifisert som moderat til dårlig differensiert PC (8/17). Det var en sak for godt differensiert PC, en av pseudopapillary svulst og en hver av en mucinous cystisk adenokarsinom og gigantiske celle tumor. 5/8 (62,5%) av moderat dårlig differensiert, 1/1 (100%) av godt differensiert, 1/1 gigantiske celle tumor og 1/1 av mucinous cystisk adenokarsinom uttrykt MUC16. Seks PC pasientene hadde også en historie med kronisk pankreatitt (CP). 5/6 (83%) av disse svulstene var også positivt for MUC16. Til sammenligning fikk 7 PC pasienter ikke har noen historie med CP. Av disse sakene, 5/7 (71,4%) var positive for MUC16. Uttrykket av MUC16 var ikke signifikant forskjellig mellom de med eller uten en historie med CP (tabell 1).
Differensial oppregulering av MUC16 i høy klasse bukspyttkjertelen dysplasi
Etter å ha observert at MUC16 er abnormt uttrykt i bukspyttkjertelen duktalt adenokarsinom vi neste søkt å studere uttrykket av MUC16 under utviklingen av PC-en. For dette, studerte vi uttrykk i pre-maligne lesjoner kjent for å gå foran invasiv adenokarsinom, betegnes som bukspyttkjertel intraepitelial neoplasi (PanINs). Panin lesjoner er klassifisert som Panin I, Panin II og Panin III som tilsvarer lav, middels og høy klasse dysplasi og er preget av veldefinerte histologiske endringer, inkludert atom atypia, kjerne trengsel, pseudostratification og i høy klasse PanINs, cribriforming [20] . Vi observerte at 20% av Panin-I (33/163), 28% av Panin-II (55/197) og 42% av Panin-III lesjoner (11/26) var positive for MUC16 uttrykk, men uttrykket ble ikke oppdaget i de tilstøtende normale kanalene (n = 140) som vist i figur 2A. MUC16 uttrykk var betydelig høyere i alle tre stadier av dysplasi (p 0,00001) sammenlignet med de vanlige kanalene. Men MUC16 uttrykk var betydelig høyere i høy klasse dysplasi (Panin-III) sammenlignet med lavgradig dysplasi (Panin-I, p = 0,02). Det var imidlertid ingen signifikant forskjell i MUC16 positivitet mellom Panins-I og Panins-II (figur 2B). Som i invasivt karsinom, MUC16 hovedsakelig lokalisert til cellemembranen av dysplastiske celler.
(A) MUC16 ekspresjon ble evaluert i vev som inneholder både de normale bukspyttkjertelen, og tilstøtende dysplastiske lesjoner. Mens MUC16 uttrykk var svak i lavgradig, tidlig stadium Panin lesjoner (Panin I), det øker gradvis med økende dysplasi med det høyeste uttrykk observert i høygradig dysplasi (Panin III) og PC. Legg merke til den dominerende membranfarging av MUC16 i alle graderinger av PanINs (Original forstørrelse × 200). (B) Box plot som representerer sammensatte score på MUC16 tvers av ulike grader av Panin lesjoner og vanlige kanaler. Fra boksplottet ser vi at MUC16 er sterkt uttrykt i Panin II og III i forhold til Panin I.
Sammenligning av MUC16 uttrykk mellom primære og metastatisk kreft i bukspyttkjertelen
Flere proteiner er kjent for å ha en differensiell ekspresjon i primære vs. metastatisk kreft [21], [22]. For å undersøke om uttrykk for MUC16 er endret i løpet av metastasering av PC til fjerne steder, undersøkte vi uttrykk i passet (hentet fra samme pasient) primære bukspyttkjertelen adenokarsinomer og metastaser til lymfeknuter, lunger, lever og omentum /membran (fås som en del av den raske obduksjon program). MUC16 ble ikke uttrykt i en hvilken som helst av de ikke-neoplastiske kanaler, mens de primære og metastatiske tumorer fra samme pasient uttrykt MUC16 med nesten den samme intensitet. Resultatene er oppsummert i figur 3A og 3B. Det var ingen signifikant forskjell i sammensatt score mellom primær- og metastaser (oppsummert i boksplottet). Men pasienter som uttrykte MUC16 i sitt primærtumor også uttrykt MUC16 på metastaser. Dette tyder på at pankreastumorer opprett MUC16 uttrykk under spredning, muligens peker til rollen MUC16 i PC celle spredning.
For å undersøke endring i MUC16 uttrykk med progresjon, vi undersøkt uttrykk for MUC16 i matchet primære bukspyttkjertelen kreft og metastasering til enten lunge, lymfeknute, lever eller omentum /pessar. I (A), mens ekspresjonen av MUC16 var høyere i metastatisk PC enn i den primære svulst, dette var ikke signifikant. A- Normal bukspyttkjertel; B- kreft i bukspyttkjertelen; C- levermetastaser; D- Lung metastaser; E- lymfeknutemetastase; F- Omentum /Membran metastasering. Videre, (B) viser at det i den samme pasient, ikke-neoplastiske kanaler var negativ, mens det var en sterk ekspresjon av MUC16 i den primære tumor i bukspyttkjertelen, og dette ble opprettholdt selv i den metastasering.
uttrykk for MUC16 i de ulike menneskelige bukspyttkjertelen kreftceller
Etter å ha demonstrert at MUC16 ble uttrykt forskjellig i PC vev, vi undersøkt videre til uttrykk i PC-cellelinjer. Uttrykk for MUC16 både på mRNA (PCR produkt størrelse er 341 bp) og protein nivå ble observert i Colo357, T3M4, HPAF /CD18, dang, VVS, SU86.86, FG og CAPAN-1 celler (figur 4A og 4B). Alle andre PC cellelinjene som ble testet var negative for MUC16 uttrykk. For å avgrense subcellulære lokalisering av MUC16, ble immunofluorescence studier utført i Capan1 og HPAF /CD18-celler (MUC16 uttrykker) og suit2 og CD11 (MUC16 ikke-uttrykk) celler. Farging ble bemerket i både de positive cellelinjene samstemmige med fordelingen av MUC16 i vev og ingen farging ble observert i de negative cellelinjer (figur 4C).
(A) Western blot-analyse av MUC16 ekspresjon i PC- cellelinjer. Protein lysater fra atten PC-cellelinjer ble løst i en 2% SDS-agarosegel. MUC16 uttrykk ble observert i Dang, VVS, SU86.86, Colo357, CD18 /HPAF, Capan1 og T3M4 cellelinjer. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll (B) RT-PCR-analyse av MUC16 ekspresjon i forskjellige cellelinjer PC. Aktin ble anvendt som en intern kontroll. (C) immunfluorescens studier av to cellelinjer (CD18 og Capan1) som uttrykker MUC16 og to cellelinjer (CD11 og suit2) som ikke uttrykker MUC16.
Diskusjoner
PC er den fjerde største årsaken til kreft dødsfall i USA med bare ca 20% av pasientene som overlever i 2 år og bare 6% i fem år. Dens forekomst til dødelighet forholdet har vært tilnærmet uendret de siste tiårene til tross for en betydelig forståelse av biologi [23], [24]. Dette høy dødelighet blant pasientene PC er på grunn av tendensen av kreftceller til å metastasere tidlig. Dette, sammen med dårlig respons på behandling og høy forekomst av tilbakefall gjør den til en av de mest dødelige kreftformer kjent mann [24]. PC-en er ofte diagnostisert på et avansert stadium, hovedsakelig på grunn av mangel på pålitelige tidlige diagnostiske markører [24]. Derfor er det et presserende behov for å identifisere spesifikke tidlig deteksjon markør (er) og egnede molekylære mål å bekjempe PC. Slimstoffer er en av de store biomarkører som har dukket opp de siste årene som svært spesifikke diagnostiske markører i flere maligniteter inkludert bukspyttkjertelen, gynekologisk og aerodigestive veis maligniteter [25]. Videre har deres avvikende uttrykk vist seg å modulere cellevekst, differensiering, transformasjon, vedheft, invasjon og immunovervåkning [7].
ca125 /MUC16 er en svulst biomarkør som i dag benyttes for oppfølging av pasienter med eggstokkreft [26]. Men dens rolle i PC patogenesen er fortsatt uutforsket. I denne studien undersøkte vi uttrykket mønster av MUC16 i PC vev og sammenlignet det med at i normal bukspyttkjertelen. Videre har vi også studert sin tilknytning til PC utvikling og med tumorstadium, klasse og metastasering. Interessant, våre resultater viste at den normale bukspyttkjertelen ikke uttrykker MUC16 men dens ekspresjon er signifikant oppregulert i 12/17 PC og 1/6 pankreatitt vev. Det har tidligere vært vist at det er en sammenheng mellom karsinom i bukspyttkjertelen og kronisk pankreatitt (sporadisk og familiær) og den standardiserte innfallende forholdet for utvikling av PC i Kronisk pankreatitt hos pasienter har 14-18 [27]. Denne observasjonen av MUC16 blir betydelig oppregulert i PC er koherent med ekspresjonen av andre membranbundne slimstoffer MUC4 og MUC1 som også avvikende uttrykt i PC og har blitt identifisert som potensielle diagnostiske markører for denne malignitet [24], [28] – [31 ] Vi observerte også at MUC16 uttrykk økt gradvis med tap av differensiering av PC svulst. Det har tidligere blitt observert at PC-pasienter som har blitt diagnostisert med fjernmetastaser hadde tendens til å ha dårlig differensiert bukspyttkjertelen adenokarsinom [32], [33]. Dermed våre funn tyder på at MUC16 kan ha en viktig rolle å spille i utviklingen og metastasering av PC.
Ifølge den kjente progresjon modell for PC, utvikler ductal carcinoma fra ikke-neoplastiske kanaler skjønt en serie av pre-maligne lesjoner betegnes som PanINs [33]. Vi observerte at MUC16 uttrykk øker gradvis fra Panin jeg til Panin III. Spesielt andelen MUC16 positivitet i høy grad Panin lesjoner var betydelig høyere enn for lav grad PanINs. Dette tyder på at MUC16 uttrykk endres på scenen i bukspyttkjertelen dysplasi og kan spille en avgjørende rolle i utviklingen av PC-en. MUC4, har en annen membranbundet mucin er tidligere blitt vist å være differensielt oppregulert med progressivt økende dysplasi, noe som tyder på muligheten for at det kan være visse felles regulatoriske reaksjonsveier som modulerer ekspresjonen av begge disse slimstoffer i løpet av PC utvikling [28], [34], [ ,,,0],35]
den høye dødeligheten i PC-pasienter skyldes den hyppige forekomsten av fjernmetastaser. I en analyse av 4.012 obduksjoner utført på PC-pasienter mellom 1914 og 1943 ble det rapportert at den vanligste området av fjernmetastaser var leveren, etterfulgt av bukhule, lunge og pleura, bein og binyrene [33], [36] . Men PC ikke er begrenset til disse organene. Selv små PCer (mindre enn 2 cm i diameter) utstillingsmetastaser, støtter premisset om at PC er en malignitet som metastasizes svært tidlig under sin progresjon [33], [37] Blant de flere molekyler observert til å spille en rolle i metastasering av PC celler, har slimstoffer dukket opp som en av de viktigste faktorene. Vi har tidligere vist at MUC4, en annen transmembrane mucin når den uttrykkes fremmer metastasering og invasivitet i PC-celler [18], [38], [39]. I denne studien, observerte vi at de primære PCer som uttrykker MUC16 også uttrykke MUC16 med nesten samme intensitet i metastaser. Dette tyder på at PC-celler kan opprettholde sin uttrykk for MUC16 under metastatisk prosess. MUC16 har tidligere blitt vist å være viktige i den metastase av faste tumorer i sentralnervesystemet gjennom dets interaksjon med mesothelin, et protein forskjellig uttrykt i normale celler, mesothelial mesotheliomas og noen andre mesenchymale ondartede sykdommer [40], [41]. Derfor er det mulig at MUC16 kan samhandle med mesothelin og forenkler metastase i PC.
De molekylære mekanismene som driver metastaser i PC krever en bedre forståelse av proteiner som modulerer epitelial-mesenchymale overgang (EMT) og den omvendte prosessen (MET ), som er nødvendig for løsgjøring og re-festing av tumorceller på stedet av metastasering respektivt. Resultatene fra vår studie tyder på at MUC16 kan ha en rolle for utvikling og progresjon av PC og studere sin spesielle rolle i utviklingen av PC-en vil være grunnlaget for vår neste studien. Dens oppregulering, som var spesielt sterk i de sene stadier av PC dysplasi, tyder på at mekanismene som slår seg på dens uttrykk er muligens skrudd på sent i løpet av PC utvikling. Studier på MUC4 mucin har avslørt at dets ekspresjon blir dempet i normale kanaler i kraft av hypermethylation av dens promoter [42], [43]. Enten lignende epigenetiske endringene også regulere MUC16 uttrykk gjenstår å bli undersøkt i fremtidige studier. Påvisning av MUC16 i høy grad PanINs (anses å være den sanne dysplastiske lesjoner med høy risiko for invasiv kreft) antyder dens potensielle bruk i tidlig deteksjon av potensielt maligne lesjoner i bukspyttkjertelen. MUC16 er også kaste i blodet (kjent som CA125), noe som gjør det til et attraktivt molekyl for etterforskning som en potensiell utskilt biomarkør for PC [44].
Videre å identifisere en egnet
in vitro
modell for å undersøke den funksjonelle rollen til MUC16, ble et panel av PC-cellelinjer screenet for ekspresjon MUC16 både på protein og mRNA-nivå. Ved gjennomføring western blot-analyse, ble det observert at MUC16 uttrykk enten fremsto som et enkelt bånd eller som en stripete bånd. Det er tidligere vist at når slimstoffer er behandlet med 2-merkaptoetanol og analysert på en SDS-PAGE-gel, er en stripete bånd erholdt som slimstoffer har blitt redusert fra dets oligomere struktur til sin monomere form. Dette monomere form gjør det mulig for slimstoffer til å migrere raskere på gelen og de intakte oligomerer forbli i brønnen [45]. Dette forklarer dermed differensial uttrykk mønster av MUC16 innhentet tvers av de ulike PC cellelinjer screenet. I tillegg har vi også observert at MUC16 uttrykker cellelinjer, slik som CAPAN 1 (lever møtt), Colo 357 (lymfeknute møtte) og T3M4 (lymfeknute oppfylt) ble hentet fra metastaser mens MUC16 ikke uttrykker cellelinjer som Panc1 , AsPC1 og BxPC3 ble isolert fra den primære svulsten nettstedet (pancreas). Videre, fra RT-PCR-studier ble det observert at mRNA-nivåene av enkelte PC cellelinjer som ikke har underbygge med de tilsvarende proteinnivåer. Vi spekulerer i at MUC16 mRNA gjennomgår poste transcriptional foredling i visse cellelinjer.
