Abstract
epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) overekspresjon og aktivisering resultat i øket proliferasjon og migrering av faste tumorer inkludert kreft i eggstokkene. I de senere årene, montering bevis indikerer at EGFR er en direkte og funksjonell målet på MIR-7. I denne studien fant vi at Mir-7 uttrykk var signifikant nedregulert i svært metastatisk ovarialcancer (EOC) cellelinjer og metastatisk vev, mens uttrykk for, EGFR positivt korrelert med spredning i både EOC pasienter og cellelinjer. Overekspresjon av MIR-7 markert undertrykte kapasiteten til celle invasjon og migrasjon og resulterte i morfologiske endringer fra en mesenchymale fenotype til en epitelial-lignende fenotype i EOC. I tillegg overekspresjon av MIR-7 oppregulert CK-18 og β-catenin uttrykk og downregulated vimentin uttrykk, akkompagnert med EGFR-hemming og AKT /ERK1 /2 inaktivering. I likhet med MIR-7 transfeksjon, stanse av EGFR med dette siRNA i EOC celler også oppregulert CK-18 og β-catenin uttrykk og downregulated vimentin uttrykk, og redusert fosforylering av både Akt og ERK1 /2, som bekrefter at EGFR er et mål på MIR -7 reversere EMT. Den farmakologiske hemming av PI3K-AKT og ERK1 /2 både betydelig forbedret CK-18 og β-catenin uttrykk og undertrykt vimentin uttrykk, noe som indikerer at AKT og ERK1 /2 veier er nødvendig for MIR-7 medier EMT. Til slutt, ble ekspresjonen av MIR-7 og EGFR i primær EOC med matchede metastase vev undersøkt. Det ble vist at MIR-7 er inverst korrelert med EGFR. Til sammen våre resultater antydet at Mir-7 hemmet tumormetastase og tilbake EMT gjennom AKT og ERK1 /2 pathway inaktivering ved å redusere EGFR uttrykk i EOC cellelinjer. Dermed kan MIR-7 være en potensiell prognostisk markør og terapeutisk mål for eggstokkreft metastaser intervensjon
Citation. Zhou X, Hu Y, Dai L, Wang Y, Zhou J, Wang W, et al. (2014) mikroRNA-7 hemmer tumormetastaser og reverserer Epitelial-Mesenchymale Transition gjennom AKT /ERK1 /2 Inaktive av målretting EGFR i ovarialcancer. PLoS ONE 9 (5): e96718. doi: 10,1371 /journal.pone.0096718
Redaktør: Jung Weon Lee, Seoul National University, Korea, Republic Of
mottatt: 8. desember 2013, Godkjent: 10 april 2014; Publisert: 09.05.2014
Copyright: © 2014 Zhou et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (Grant nr 81072138), Medisinsk-engineering kryss prosjekt av Shanghai Jiao Tong University (YG2010MS24). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er den viktigste årsaken til dødsfall fra gynekologiske kreftformer og den femte største årsaken til kreft dødsfall blant kvinner i verden [1]. Ifølge National Cancer Institute (NCI) rapport, vil om lag 22 280 nye tilfeller bli diagnostisert med eggstokkreft i Amerika i 2012, og 15500 pasienter vil dø av denne sykdommen, og 5-års overlevelse for dem er ca 30%. Det har vært spekulert i at metastaser er fortsatt den ledende årsak til tilbakefall og død av kreft i eggstokkene, og likevel de molekylære mekanismene forbundet med oppkjøpet av metastatisk evne i menneskelig eggstokkreft er dårlig forstått.
microRNAs (mirnas) er en klasse av små ikke-kodende RNA på omtrent 20-22 nukleotider langt som funksjon som post-transkripsjonelle regulatorer ved å målrette 3 «utranslaterte regioner (UTR) av mRNA og forårsaker enten hemming av translasjon eller degradering av mRNA [2]. Mirnas bidra til diverse cellulære prosesser som proliferasjon, apoptose, invasjon og morfogenese [3], [4], [5]. Videre er en rekke mirnas har blitt identifisert som fungerer som klassiske onkogener eller tumorsuppressorgener [6], [7], [8]. MiR-7 har blitt karakterisert som en tumor suppressor på flere humane kreftformer. Det retter seg mot en rekke av proto-onkogener, herunder insulinlignende vekstfaktor-1-reseptor (IGF1R) [9] epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) [10], p21-aktivert kinase 1 (Pak1) og assosiert cdc42 kinase 1 (Ack1 ) [11]. Det er vist at overekspresjon av MIR-7 inhiberte schwannom cellevekst både i kultur og i xenograft tumormodeller in vivo, noe som korrelerte med nedregulering av EGFR, Pak1 og Ack1 [11].
Ca 70% av epitelial eggstokkreft (EOC) uttrykker aktivert EGFR [12]. EGFR overekspresjon og aktivering resultat i økt spredning og migrasjon av solide tumorer inkludert eggstokkreft [13]. Aktivering av EGFR-tyrosinkinase-resulterer i aktivering av en rekke intracellulære signaler, som kulminerer i ikke bare celleproliferasjon, men også andre fremgangsmåter som er avgjørende for progresjon av kreft, inkludert cellemigrering, angiogenese, metastase, og epitelial-mesenchymale overgang (EMT). Disse hendelsene er formidlet gjennom ulike nedstrøms mål av EGFR (f.eks protein kinase (AKT) og ekstracellulære signalregulerte kinase 1/2 (ERK1 /2)) [14], [15], [16]. Interessant, er det vist at Mir-7 direkte rettet mot EGFR mRNA 3’UTR, og deretter hemmer uttrykk for sin mRNA og protein [17]. Selv EGFR signalering er viktig og godt studert med hensyn til EOC progresjon, er lite kjent om hvordan MIR-7 megle EGFR aliserte til modulere EOC celle metastasering.
I denne studien identifiserer vi for første gang at MIR -7 spiller en viktig rolle i EOC metastaser. Videre viser vi at Mir-7 reverserer EMT gjennom AKT /ERK1 /2 inaktivering ved å målrette EGFR i EOC, som gir en ny innsikt i mekanismene bak metastasering av eggstokkreft.
Materialer og Metoder
pasienter og etikk
Koblede prøver av primær ovarialcancer vev og metastatisk vev (omentum eller peritoneum) ble hentet fra pasienter med FIGO stadium III-IV avanserte EOC som hadde gjennomgått svulst debulking på Renji Hospital, School of medisin, Shanghai Jiao Tong University mellom 2010 og 2012. Blant dem 17 parvise prøver var snap-frosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C for senere RNA ekstraksjon, 25 parvise prøver ble formalinfiksert og parafininnebygd. Prøvene ble klinisk og patologisk vist seg å være korrekt merket. Studien ble godkjent av Institutional Review Board of Renji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter. All klinisk undersøkelse ble gjennomført i henhold til de prinsipper som er nedfelt i Helsinkideklarasjonen.
Material
MiR-7 plasmid og negativ kontroll (NC) ble syntetisert ved Shanghai IBS Company. Sekvensen av plasmidet og NC er som følger: 5′-UGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGU-3 «; Negativ kontroll: 5»-GAAATCTACTGCGCGTGGAGAC-3 «(IBS selskap). TaqMan kit (Applied Biosystems) som er angitt for kvantifisering av miRNA ble brukt for å vurdere ekspresjonen av MIR-7 og U6. EGF reseptoren Rabbit mAb (# 4267), Phospho-EGF reseptor (Tyr992) Rabbit mAb (# 2235), Phospho-P44 /42 MAPK (Thr202 /Tyr204) Rabbit mAb (# 4370), Phospho-Akt (Ser473 /Thr308), Rabbit mAb (# 4060 /# 2965), Akt (pan) Rabbit mAb (# 4691), LY294002 (PI3K Kinase Inhibitor) (# 9901), U0126 (MEK1 /2-hemmer) (# 9903), vimentin Rabbit mAb (# 5741 ), og β-catenin kanin mAb og E-cadherin Rabbit mAb (# 3195) ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (CST). cytokeratin-18 (CK-18) mAb (T410) Pab (BS1204) ble kjøpt fra BioWorld Technology. P44 /42 MAPK Kanin mAb ble oppnådd fra Santa Cruz ((SC-33746)). GAPDH mus mAb ble kjøpt fra ABmart (# M20006). 800CW konjugert geit anti-kanin IgG ((926-32210), høyt kors adsorbert og 800CW konjugert geit anti-mus IgG (926-32211), ble mange kryss adsorbert kjøpt fra Li-Kor biovitenskap. EGFR og kontroll short inter RNA (siRNA ) var fra Sanong Biotech.Has-MIR-7-LNA deteksjon sonde ble kjøpt fra Exiqon (38485-15).
Cell kultur
HO-8910pm, HO-8910 cellelinjer ble oppnådd fra Celle Bank of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina), CAOV-3, SKOV3, A2780, A2780 /DDP og ES-2-celler ble oppnådd fra ATCC (Manassas, Virginia). cellene ble dyrket i Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI-1640) medium (Hyclone) supplert med 10% føtalt bovint serum (Hyclone) og penicillin /streptomycin (1:100, Sigma) i en fuktig atmosfære inkubator med 5% CO2 ved 37 ° C. med mindre annet indikerte cellene ble dyrket til 70-80% samløpet, deretter serum-sultet over natten i serumfritt RPMI-1640 medium før behandling.
miRNA og siRNA Transfeksjon
80-90% konfluent -celler ble transfektert med human MIR-7 plasmid (MIR-7) eller negativ kontroll (NC) og 30-40% konfluente celler ble transfektert med EGFR siRNA eller siRNA-NC av Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i følge produsentens protokoll. Totalt RNA ble ekstrahert 24 timer etter transfeksjon, og total celleprotein ble ekstrahert 48 eller 72 timer etter transfeksjon.
Revers transkripsjon kvantitativ real-time PCR
Totalt RNA ble isolert ved hjelp av TRIzol Reagens (Invitrogen ). Moden MIR-7 ble revers-transkribert med spesifikke RT-primere, kvantifiseres med en TaqMan probe, og normalisert ved U6 liten kjernefysiske RNA bruker TaqMan miRNA analyser (Applied Biosystems). mRNA-ekspresjon analyse ble utført ved hjelp av kvantitativ PCR ved anvendelse av SYBR grønn farge, med relative endringer beregnet av ΔΔCt metode. Primere som ble anvendt var som følger: GAPDH-F, 5-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3; GAPDH-R, 5-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3; EGFR-F, 5-AGCCATGCCCGCATTAGCTC-3; EGFR-R, 5-AAAGGAATGCAACTTCCCAA-3.
Western blotting
Hele celleekstrakter ble fremstilt som tidligere beskrevet [18] og like mengder av protein ble separert ved et 8% eller 10% SDS siders og elctrotransferred til en PVDF membran (Millipore). Membranene ble deretter blokkert i 1 time ved romtemperatur med Li-Cor blokkerende middel (Li-Cor). Med konstant risting, ble membranene inkubert med primære antistoffer over natten ved 4 ° C, etterfulgt av inkubasjon i 1 time med de passende sekundære antistoffer merket med 800IRdye. Immunoreaktivitets ble påvist og kvantifisert med infrarød Odyssey Imaging System (Li-Cor).
Migrasjon analyser
Celler (8 × 10
4) ble høstet og re-suspendert i serum- RPMI-1640-medium og satt inn i de øvre brønnene i Boyden kammer (Corning). Mediet inneholdende 10% føtalt bovint serum ble tilsatt i det nedre kammeret. Etter 8 timer med inkubasjon ble cellene igjen på den øvre overflate av membranene fjernet, celler som hadde invadert gjennom 8 um porestørrelse membranen ble fiksert, farget og tellet under et mikroskop ved 200 x forstørrelse. Resultatene var i gjennomsnitt mellom tre uavhengige eksperimenter.
bølgen assays
Celler (3 x 10
4) ble plassert inn i de øvre kamrene belagt med 50 ul av Matrigel (1:05 fortynning i serumfritt medium). Medium supplert med 10% serum ble tilsatt til den ytre kopp. Etter 24 timer inkubering ble cellene igjen på den øvre overflate av membranene fjernet, celler som hadde invadert gjennom Matrigel og 8 um porestørrelse membranen ble fiksert, farget og tellet under et mikroskop ved 200 x forstørrelse. Resultatene ble i gjennomsnitt mellom tre uavhengige eksperimenter.
Immunohistochemistry (IHC) og kromogen in situ hybridisering (CISH)
Immunohistochemistry (IHC) ble utført ved hjelp av pepperrot (HRP) -polymer anti-mus IHC DAB (diami-nobenzidine) -basert kit (MaxVision, Fuzhou, Kina), i henhold til produsentens protokoll. Antigen gjenfinning ble utført ved anvendelse av boratbuffer (pH = 8), etterfulgt av inkubering i hydrogenperoksyd og ytterligere blokkerende trinn. Antistoffer ble brukt ved 1:50. IHC ble undersøkt og avbildes med en OLYMPUS BX51 mikroskop (Tokyo, Japan) ved 1:200. Positve signaler ble identifisert ved intens brun merking av sine cellemembraner.
kromogen in situ hybridisering (CISH)
ble utført ved hjelp av Has-MIR-7 sonden fra Exiqon (kvikksølv LNA deteksjon sonde 5 «og 3»-DIG (digoxigenin) -merket). Sonden ble oppdaget ved hjelp digoxigenin antistoff (Abcam), LSAB2 System-HRP (Dako Denmark A /S, Glostrup, Danmark) og flytende DAB + Substrat kromogen System (Dako) i henhold til produsentens instruksjoner. Den CISH ble undersøkt og avbildes med en OLYMPUS BX51 mikroskop (Tokyo, Japan) ved 1:200. Positive hybridiseringssignaler ble identifisert ved intens brun merking av sin celle cytoplasms.
Resultatene av IHC og CISH ble uavhengig mottok ved to patologer på en blind måte. Scoringen var basert på intensiteten og omfanget av farging og ble evaluert i henhold til følgende histologiske scoring metode. Fargeintensitet ble gradert som følger: 0, negativ farging; 1, svak flekker; 2, moderat farging; 3 sterk farging. Den midlere Andelen å merke celler per prøve ble bestemt semikvantitativt og gitt poeng som følger: 0 til farging mindre enn 1%, en for 1-25%, 2 til 26-50%, 3 til 51-75%, og for fire 75% av de undersøkte cellene. Den histologiske score (H-score) for hver prøve ble beregnet ved formelen: H-poengsum = andel poengsum × intensitet. En total poengsum på 0-12 ble beregnet og vurdert som negativ (-, score: 0), svak (+, score: 1-4), moderat (++, score: 5-8) eller sterk (+++, Resultat: 9-12)
statistisk analyse
statistisk analyse ble utført med SPSS 12.0 statistisk analyse programvarepakken.. I hver in-vitro-forsøk ble et minimum på tre brønner /tallerkner som brukes og lignende resultater ble oppnådd. Hvert eksperiment ble gjentatt minst tre ganger, ble middelverdien av repetisjonene beregnet, og denne verdi ble anvendt i den statistiske analysen. Forsøksdata er uttrykt som gjennomsnitt med standardavvik (SD). Forskjellene mellom grupper ble evaluert ved bruk av Students t test når man sammenligner kun to grupper eller analysert ved en-veis ANOVA med post hoc test når mer enn to grupper ble sammenlignet. Korrelasjonen mellom EGFR og MIR-7 ble analysert ved hjelp av Spearmans rank test. Resultatene av IHC og CISH ble analysert ved bruk av Wilcoxon test. Forskjeller ble vurdert som statistisk signifikant ved P 0,05, * P 0,05 og ** P. 0,01
Resultater
MIR-7 uttrykk er inverst korrelert med EOC metastaser
for å utforske uttrykk og betydningen av MIR-7 i EOC metastaser, vi har oppdaget MIR-7 uttrykk i 17-sammenkoblede metastatiske EOC vev og primær EOC vev. Kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) viste at vev fra omentum eller peritoneum metastaser uttrykt lavere nivåer av MIR-7 sammenlignet med primære EOC vev, noe som indikerer en invers sammenheng mellom uttrykket av MIR-7 og metastatisk status for EOC vev ( figur 1A). Videre valgte vi HO-8910 og den svært metastatisk klone HO-8910pm. HO-8910pm ble etablert og karakterisert i Cell Bank, Chinese Academy of Sciences [19], [20], [21]. Vi fant ut at Mir-7 uttrykk ble betydelig redusert i svært metastatisk klone HO-8910pm sammenlignet med HO-8910 (figur 1B). Til sammen tyder våre resultater at nedregulering av MIR-7 er korrelert med øket EOC metastase og som MIR-7 kan undertrykke EOC progresjon. For å bestemme de optimale cellelinjer for videre studier, målte vi uttrykk for MIR-7 i syv EOC cellelinjer (HO-8910pm, HO-8910, A2780, A2780 /DDP, Skov-3, CAOV-3 og ES-2) . Våre data viser at ekspresjonen av MIR-7 var lavest i ES-2 cellelinje (P 0,05) (figur 1C), som er en annen EOC celle med høyt metastatisk potensiale. Derfor velger vi HO-8910PM og ES-2 for å studere mekanismene for Mir-7 hemme metastase i EOC i følgende eksperimenter.
(A) Den relative uttrykk for MIR-7 i 17-sammenkoblede EOC vev fra omentum eller peritoneum metastaser og primær EOC vev ble oppdaget av QRT-PCR. U6 small nuclear RNA ble anvendt som en intern kontroll, og den ganger endring ble beregnet ved ΔΔCt fremgangsmåte (B) Ekspresjonsnivået av MIR-7 i ett par av lave og høye metastatiske EOC cellelinjer. (C) Ekspresjonsnivået av MIR-7 i syv EOC cellelinjer. (* P. 0,05 ** P 0,01).
MIR-7 nedregulerer EGFR i EOC celler
For å avdekke den underliggende mekanismen som MIR-7 sperre EOC invasjon og metastase, vi søkte på MIR-7 mål ved hjelp av for eksempel TargetScan og Pictar. Det er identifisert 181 kandidat målgener inkludert EGFR. Det er vist at Mir-7 nedregulerer EGFR uttrykk ved direkte rettet mot EGFR mRNA 3′-UTR [17]. Vi var spesielt interessert i EGFR grunn av sin positive roller i kreft celle migrasjon og invasjon og dens overekspresjon i EOC. Vi undersøkt videre uttrykk og betydningen av EGFR i EOC metastase ved å oppdage EGFR protein uttrykk i 17-sammenkoblede metastatiske EOC vev og primær EOC vev. Western blot-analyse viste at vev fra omentum eller peritoneum metastaser uttrykt høyere nivåer av EGFR, sammenlignet med primære EOC vev, noe som indikerer en positiv korrelasjon mellom ekspresjon av EGFR og den metastatiske status av EOC vev (figur 2A, Figur S1A). I mellomtiden, vi også oppdaget EGFR protein uttrykk ved Western blotting i både HO-8910 og HO-8910pm celler. Vi fant at EGFR uttrykk ble betydelig økt i svært metastatisk klone HO-8910pm sammenlignet med HO-8910 (figur 2B, Figur S1B). Til sammen tyder våre resultater at EGFR uttrykket er positivt korrelert med EOC metastase og som EGFR kan fremme EOC progresjon.
(A) Et protein ekspresjon av EGFR i 17-sammenkoblede EOC vev fra omentum eller peritoneum metastaser og primær EOC vev ble undersøkt av western blot. (B) Et protein ekspresjon av EGFR i HO-8910 og HO-8910pm cellelinjer ble undersøkt ved western blotting. (C) Ekspresjonsnivået av MIR-7 i HO-8910pm og ES-2-celler transfektert med MIR-7 eller NC ble analysert ved QRT-PCR. (D) Ekspresjonsnivået av EGFR-mRNA i HO-8910pm og ES-2-celler transfektert med MIR-7 eller NC ble analysert ved QRT-PCR. (E) Ekspresjon av EGFR-protein ble analysert ved western blotting i HO-8910pm og ES-2-celler transfektert med MIR-7 eller NC, glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) ble anvendt som en intern kontroll. (* P. 0,05 ** P 0,01).
For å sikre at rollene til Mir-7 i regulering av EGFR uttrykk i EOC celler, både HO-8910pm og ES-2 celler transfektert med MIR-7 plasmid eller MIR-NC. QRT-PCR viste at Mir-7 uttrykk betydelig høyere (figur 2C), mens EGFR mRNA uttrykk ble betydelig redusert (figur 2D) etter MIR-7 transfeksjon i begge cellelinjer. Videre indikerte Western blotting-analyse at EGFR-protein-ekspresjon ble signifikant redusert etter MIR-7 transfeksjon i begge HO-8910pm og ES-2-celler (figur 2E, fig S1C). Våre resultater tyder på at Mir-7 nedregulerer EGFR i EOC.
MIR-7 undertrykker EOC celle invasjon og migrasjon in vitro
For å undersøke om MIR-7 regulerer celle invasjon og migrasjon i EOC, både HO-8910pm og ES-2-celler ble transfektert med MIR-7 plasmid eller MIR-NC. Transwell migrasjon og invasjon analysene ble deretter utført. Vi fant ut at transfeksjon med MIR-7 undertrykte betydelig invasjonen av både HO-8910pm celler (figur 3A) og ES-2 celler (Figur 3B). Tilsvarende spredningsevne var også signifikant nedregulert i begge HO-8910pm-MIR-7-celler og ES-2-MIR-7 celler versus HO-8910pm-NC-celler og ES-2-NC-celler (figur 3A, figur 3B) . Disse resultatene indikerer at MIR-7 deltar i reguleringen av cellemigrering og invasjon i EOC.
(A) Transwell migrering og invasjon analyser ved anvendelse av HO-8910pm-celler transfektert med MIR-7 eller negativ kontroll (NC). Representative bilder vises til venstre, og kvantifisering av 6 tilfeldig valgte feltene er vist til høyre. (B) Transwell migrasjon og invasjon analyser ved hjelp av ES-2-celler transfektert med MIR-7 eller NC. Representative bilder vises til venstre, og kvantifisering av 6 tilfeldig valgte feltene er vist til høyre. De angitte verdiene er uttrykt som middel ± SD. (* P. 0,05 ** P 0,01).
Overuttrykte MIR-7 reverserer EMT i EOC celle
I EOC celler, vi observert at Mir-7 transfeksjon resulterte i morfologiske endringer fra en langstrakt spindel-formet, mesenchymale fenotype til en mer avrundet, epitel-lignende fenotype, med celler som samles i grupper (figur 4A). Disse endringene representerer reverse prosesser av EMT, som er en viktig årsak til epitelial kreft å få muligheten til invasjon og metastasering. Videre undersøkte vi protein ekspresjon av de epiteliale markører E-cadherin, CK-18 og β-catenin, samt mesenkymale markør vimentin ved Western blotting. Selv om det var ingen E-cadherin uttrykk i begge cellelinjene, selv etter MIR-7 transfeksjon, CK-18 og β-catenin uttrykk dramatisk økt, mens vimentin uttrykk redusert i både HO-8910pm og ES-2 celler etter MIR-7 transfeksjon ( Figur 4B Figur S2). Våre data tyder på at overekspresjon av MIR-7 reverserer EMT i EOC cellelinjer.
(A) Phase kontrast av ES-2 celler infisert med MIR-7 eller NC. (B) Et protein ekspresjon av E-cadherin, CK-18, β-catenin og vimentin i HO-8910pm og ES-2-celler transfektert med MIR-7 eller NC ble undersøkt ved western blotting, ble GAPDH anvendt som en intern kontroll. (* P. 0,05 ** P 0,01).
luciferaserapportørplasmid analyser
For å forstå den molekylære mekanismen som MIR-7 undertrykke EOC invasjon og metastasering, brukte vi forskjellige beregningsmetoder for å søke etter MIR-7 mål, for eksempel Targetsan og pictar. Disse metodene funnet 181 mulige kandidat gener. Vi var spesielt interessert i EGFR grunn av sin positive roller i kreftcelle invasjon. Analyse av det 3′-UTR-sekvens av EGFR identifisert tre mulige bindingsseter for MIR-7. For å bestemme hvorvidt EGFR er direkte mål for MIR-7, vi konstruert dets 3′-UTR-fragmenter, hvor villtype og mutante bindingsseter ble innsatt inn i området immediatedly nedstrøms av reportergenet (figur 5A), luciferase reporter-analyser viste at MIR-7 transfeksjon forårsaket en bemerkelsesverdig nedgang i luciferase aktivitet som inneholdt villtype 3′-UTR fragmenter bindingssteder (figur 5B).
(A) Diagram av EGFR 3’UTR reporter konstruere. (B) Den villtype eller mutant reporter plasmider ble transfektert med MIR-7 eller NC i ES-2. (* P. 0,05 ** P 0,01).
MIR-7 undertrykker AKT og ERK1 /2 pathway aktivering avhengig av sin EGFR hemming i EOC celler
Tidligere studier viste at EGFR regulerer AKT og ERK1 /2 aktiviteten i eggstokkreft [15], [22]. Fordi MIR-7 kan poste-transcriptionally hemme uttrykket av EGFR, hypotese vi at Mir-7 regulerer AKT og ERK1 /2 pathway aktivering. For å undersøke effekten av MIR-7 på AKT og ERK1 /2, transfektert vi HO-8910pm og ES-2 celler med MIR-7 plasmid eller MIR-NC, og deretter undersøkt fosforylering av AKT og ERK1 /2 av western blotting. Transfeksjon med MIR-7 trykt fosforylering av AKT på Ser473 og ERK1 /2 på Thr202 /Tyr204 imidlertid MIR-7 ikke vesentlig endre AKT fosforylering på Thr308 (Figur 6A). Siden aktivering av EGFR spiller stor rolle i metastasering av mange kreftformer, vi også oppdaget sin fosforylering status etter MIR-7 transfeksjon i HO-8910pm og ES-2 celler. Men i våre studier, var det ingen EGFR fosforylering pre og post MIR-7 transfeksjon, mens MIR-7 transfeksjon ville hemme total EGFR-proteinet uttrykket (figur 6A, fig S3 (A-C)). Som bevis på at Mir-7 har mange målgener, forsøkte vi å finne ut om MIR-7 mediert AKT og ERK1 /2 pathway aktivering er avhengig av sin EGFR hemming. HO-8910pm og ES-2-celler ble transfektert med EGFR siRNA eller den negative kontroll. Vi viste at lyddemping av EGFR med dette siRNA i eggstokkreft celler redusert fosforylering av AKT på Ser473 og ERK1 /2 på Thr202 /Tyr204 på Western Blotting, men det var ingen signifikant endring i fosforylering av AKT på Thr308 (figur 6B, Figur S3 ( DE)).
(A) HO-8910pm og ES-2-celler ble transfektert med MIR-7 eller NC, EGFR, AKT og ERK1 /2 fosforylering ble analysert ved western blotting. (B) HO-8910pm og ES-2-celler ble transfektert med EGFR siRNA eller NC, EGFR, AKT og ERK1 /2 fosforylering ble analysert ved western blotting. (* P. 0,05 ** P 0,01).
MIR-7 reverserer EMT gjennom EGFR /AKT og EGFR /ERK1 /2 pathway
For å avgjøre om EGFR /AKT og EGFR /ERK1 /2 signalveier var involvert i reversering av EMT av MIR-7, transfektert vi EGFR siRNA inn i HO-8910pm og ES-2 celler og deretter utforske protein uttrykk for E-cadherin, CK-18, β -catenin og vimentin av western blotting. Vi fant at det var ingen E-cadherin ekspresjon før og etter EGFR siRNA transfeksjon i begge cellelinjene er imidlertid CK-18 og β-catenin ekspresjon dramatisk øket, mens vimentin ekspresjon ble redusert i begge HO-8910pm og ES-2-celler etter EGFR siRNA transfeksjon (figur 7A, Figur S4 (AC)). Deretter brukte vi PI3K /AKT inhibitor LY294002 og ERK1 /2-hemmer U0126 spesifikt blokkere den Akt og ERK1 /2 veier, henholdsvis. Som forventet, PI3K /AKT-inhibitor LY294002 hemmet AKT-fosforylering, mens ERK1 /2 inhibitor U 0126 hemmet ERK1 /2 fosforylering i HO-8910pm og ES-2-celler (figur 7B, FigureS4 (D-G)). Videre, både AKT og ERK1 /2-hemmere forbedret CK-18 og β-catenin ekspresjon og undertrykket vimentin ekspresjon i HO-8910pm og ES-2-celler (figur 7C og fig S4 (H-M)). Våre data viser at involvering av EGFR /AKT og EGFR /ERK1 /2 baner i MIR-7 reverseres EMT i eggstokkreft celler.
(A) HO-8910pm og ES-2-celler ble transfektert med EGFR siRNA eller NC, protein uttrykk for E-cadherin, ble CK-18, β-catenin og vimentin utforsket av western blotting. (B) HO-8910pm og ES-2-celler ble behandlet med LY294002 (20 pmol /l) eller U0126 (10 pmol /l), AKT og ERK1 /2 fosforylering ble analysert ved western blotting. (C) HO-8910pm og ES-2-celler ble behandlet med LY294002 (20 pmol /l) eller U0126 (10 pmol /l), protein ekspresjon av CK-18, ble β-catenin og vimentin undersøkt ved Western blotting. GAPDH ble brukt som en intern kontroll (* P. 0,05 ** P 0,01).
MIR-7 og EGFR er omvendt uttrykt i EOC primære og metastase vev
brukt CISH og IHC for å påvise ekspresjon av MIR-7 og EGFR i den samme type vev. Vi avgjort om MIR-7 uttrykket var forbundet med EGFR uttrykk i EOC tissuses. Vevet inneholdt 25 par av primære EOC vev og deres matchet metastatisk vev. Den CISH Analysen viste en åpenbar reduksjon av MIR-7 i de metastatiske vev sammenlignet med deres tilsvarende primære EOC vev (figur 8A, tabell 1). I motsetning til IHC Resultatene viste at EGFR-ekspresjon var høyere hos pasienter med metastatisk vev enn i primær EOC vev (figur 8B, tabell 2). Videre statistisk analyse viste at EGFR-ekspresjon ble inverst korrelert med MIR-7 ekspresjonen (tabell 3).
(A) Ekspresjon av MIR-7 i primær EOC og dens avstemt metastatisk vev ved CISH. (B) Uttrykk av EGFR i primær EOC og dens matchet metastatisk vev ved IHC. (* P. 0,05 ** P 0,01).
Diskusjoner
mirnas har dukket opp som viktige regulatorer av kreftutvikling og ondartet progresjon av kreft ved målretting onkogener og tumorsuppressorgener [23], [24]. Det har vært implisert som MIR-7 inhiberer tumorinvasjon og metastase i glioblastom, schwannom, lungekreft, brystkreft og mange andre typer kreft [25], [26], [27]. I denne studien undersøkte vi den biologiske rollen MIR-7 i menneskelig EOC metastaser. Vi fant ut at Mir-7 ble nedregulert med metastatisk ovarialcancer (EOC) vev sammenlignet med primær EOC vev. MIR-7 uttrykket ble også betydelig redusert i svært metastatisk klone HO-8910pm sammenlignet med HO-8910. Videre viste vi at uttrykket av MIR-7 var lavest i ES-2 cellelinje, som er en annen EOC celle med svært metastatisk potensial blant syv EOC cellelinjer (HO-8910pm, HO-8910, A2780, A2780 /DDP, SKOV -3, CAOV-3 og ES-2). Derfor våre funn indikerte at MIR-7 uttrykk er inverst korrelert med EOC metastase.
Interessant, hver miRNA potensielt kan regulere hundrevis av gener på post-transkripsjonelle nivå ved å binde seg til de spesifikke sekvenser i mål-mRNA-molekyler basert på «ufullkommen komplementaritet». Det er blitt vist at overekspresjon av MIR-7 hemmet tumorinvasjon og metastase ved å målrette insulinlignende vekstfaktor-1-reseptor (IGF-1R) i magekreft [9]. MIR-7 har også blitt rapportert å målrette FAK i brystkreftceller [28]. I de senere år montering bevis indikerer at EGFR er et direkte og funksjonelt mål på MIR-7 [10], [17]. Reseptor-tyrosin-kinase av EGFR familien regulerer viktige cellulære funksjoner, inkludert spredning, overlevelse, migrering og differensiering. Publiserte data viser at EGFR spiller en viktig rolle i tumorprogresjon [12], [27]. I denne studien fant vi at vev fra omentum eller peritoneum metastaser uttrykt høyere nivåer av EGFR sammenlignet med primær EOC vev. I mellomtiden har vi funnet at EGFR ble oppregulert i svært metastatisk klone HO-8910pm sammenlignet med HO-8910. Disse resultatene tyder på at EGFR er nært knyttet til eggstokkreft metastasering. Våre tidligere studier viste også at EGFR overekspresjon og aktivering resultat i økt metastasering av menneskelig eggstokkreft celler [18], [29]. Det er imidlertid ingen studie utført for å finne ut om MIR-7 er rettet mot EGFR å modulere oppførselen til EOC metastaser. Her viste vi at både EGFR mRNA og EGFR protein uttrykk ble betydelig redusert etter at Mir-7 transfeksjon i EOC cellelinjer. Vi har senere funnet ut at både invasjonen og migrasjon kapasitet var betydelig nedregulert etter MIR-7 transfeksjon i EOC in vitro. Våre nåværende eksperimentelle resultatene bekreftet for første gang at Mir-7 trykt EOC celle invasjon og migrasjon. Tatt sammen, våre resultater indikerer at MIR-7 undertrykker celle invasjon og migrering i det minste delvis, ved direkte målretting av EGFR i EOC.
EMT refererer til en biologisk prosess som epitelcellene transformere til mesenchymale celler via
