Abstract
fase III-studier av anti-insulin-like growth factor-1 reseptoren (IGF1R) antistoff figitumumab i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) pasienter har blitt avviklet på grunn av manglende overlevelsesgevinst . Vi undersøkt hvorvidt inhibering av høyt homologe insulinreseptor (IR) i tillegg til den IGF1R vil være mer effektiv enn hemning av IGF1R alene på å hindre spredning av NSCLC-celler. Signalering gjennom IGF1R og IR i NSCLC cellelinjer A549 og Hcc193 ble stimulert med en kombinasjon av IGF1, IGF2 og insulin. Det ble inhibert av antistoffer som blokkerer ligandbinding, αIR3 (IGF1R) og IR47-9 (IR), og ved at ATP-konkurrerende små molekyl-tyrosin-kinase-inhibitorer AZ12253801 og NVPAWD742 som inhiberer både IGF1R og IR-tyrosin-kinaser. Effekten av inhibitorene ble bestemt ved hjelp av en forankrings-uavhengig proliferasjonsanalyse og ved analyse av Akt fosforylering. I Hcc193 celler reduksjon i celleformering og Akt fosforylering på grunn av anti-IGF1R antistoff ble forsterket av antistoff-mediert inhibering av IR mens i A549-celler, med en forholdsvis lav IR: IGF1R uttrykk forhold, var det ikke. I hver cellelinje spredning og Akt fosforylering ble mer effektivt hemmet av AZ12253801 og NVPAWD742 enn ved kombinert αIR3 og IR47-9. Når IGF1R alene hemmes, kan uhemmet signalering via IR bidra til fortsatt NSCLC celleproliferasjon. Vi konkluderer med at lavmolekylære inhibitorer som målretter både IR- og IGF1R mer effektivt redusere NSCLC celleformering på en måte som er uavhengig av IR:. IGF1R uttrykk forhold, noe som gir en terapeutisk begrunnelse for behandling av denne sykdommen
relasjon: Vincent EE eldste DJE, Curwen J, Kilgour E, Hers jeg, TAVARÉ JM (2013) Targeting ikke-småcellet lungekreft celler ved Dual Hemming av insulinreseptoren og insulin-like Growth Factor-1 reseptoren. PLoS ONE 8 (6): e66963. doi: 10,1371 /journal.pone.0066963
Redaktør: Irina U. Agoulnik, Florida International University, USA
mottatt: 25 februar 2013; Godkjent: 14 mai 2013; Publisert: 24 juni 2013
Copyright: © 2013 Vincent et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet beskrevet ble finansiert med tilskudd fra Medical Research Council og Astrazeneca til JMT. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Jon Curwen og Elaine Kilgour, er ansatte i Astrazeneca og egne aksjer i Astrazeneca. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis med ikke-småcellet lunge karsinom (NSCLC) utgjør ca 80% av alle tilfeller. Den samlede fem års overlevelse i Europa er 8% [1] og median overlevelse etter diagnose er 4-5 måneder hvis venstre ubehandlet [2]. Standard kjemoterapi i avansert stadium NSCLC gir bare marginal forbedring i total overlevelse, men EGFR-tyrosinkinase-inhibitorer forbedrer overlevelsen hos pasienter som bærer aktiverende mutasjoner i EGFR-genet [3]. Andre lovende terapeutiske mål i NSCLC inkluderer anaplastisk lymfom kinase (ALK), histon deacetylering (HDAC) og IGF (insulin-like growth factor) system [4].
IGF-systemet spiller en avgjørende rolle i reguleringen av energimetabolisme og vekst [5]. Det er to sperre reseptorer i IGF-systemet som er aktive i signalisering; den IGF1R og insulinreseptor (IR), som begge foreligger som homodimerer omfattende to «halve» reseptorer. På grunn av høy sekvenshomologi de er også til stede som hybrid-reseptorer dannet av en insulin halv-reseptor og en halv IGF1-reseptor i celler som uttrykker begge reseptorgener [6], [7]. IR og IGF1R aktiveres av insulin og IGF-1 henholdsvis, men en tredje ligand, IGF-2, binder både IGF1R og en spleisevariant av IR kalt IR-A [8]. En tredje reseptor, IGF2R, har ingen kjente signaloverføringsegenskaper, og tjener som en klarering reseptor for IGF-2 [9]. IGF-bindende proteiner (IGFBP 1-6) har også en viktig rolle å spille i å regulere konsentrasjonen av fri ligand og eksponering av en ligand til sin reseptor [10]. I serum, er de fleste av sirkulerende IGF-1/2 kompleksbundet med IGFBP3. Dette beskytter vekstfaktorene fra nedbrytning, men kan også hemme deres binding til reseptorer [11]. Når den aktiveres ved ligandbinding reseptorene initiere signaltransduksjon via deres tyrosinkinase-aktivitet til nedstrøms kaskader som RAS /RAF /MAPK-reaksjonsveien, og PI3K /Akt pathway. Disse banene er ansvarlig for regulering prosessorer som fosterutvikling, vekst vev og metabolisme [12].
Som en sentral regulator av vekst og overlevelse, dereguleringen av IGF-systemet er vanlig i human kreft (anmeldt i [13 ]. Overskytende autokrin /parakrin produksjon av IGF-1 og IGF-2 og /eller lave IGFBP3 nivåer er assosiert med en økt kreft risiko for flere kreftformer, inkludert bryst [14], endometriale [15] og blære [16]. studier i denne område har i første rekke undersøkt rollen til IGF1R. Inhibering av IGF1R ved hjelp av inhibitoriske antistoffer resulterer i en betydelig reduksjon i proliferasjon av tumorcellelinjer [17], og det har blitt funnet å være overaktiv i kreftformer, inkludert prostata [18], bryst [19 ..], tykktarm [20] og galleblæren kreft [21] Liket av bevis er slik at det har ført til etterforskningen av IGF1R hemmere i mer enn 70 onkologiske studier [22] Disse hemmere faller i to klasser; monoklonale antistoffer rettet mot det ekstracellulære domene og lavmolekylære ATP-konkurrerende tyrosinkinaseinhibitorer er utformet for selektivt å inhibere IGF1R over IR men som innehar aktivitet mot begge reseptorer.
Bekymringer at samtidig inhibering av IR ved lite molekyl IGF1R kinase inhibitorer ville ha uønskede metabolske konsekvenser har ført til IGF1R-selektive monoklonale antistoffer blir favorisert for utvikling og bruk i kliniske studier. Ikke desto mindre har det vært kjent i noen tid at insulin kan stimulere veksten av humane kreftcellelinjer [23] – [26], og at 80% av brystkreft overuttrykker IR sammenlignet med normalt brystvev [27]. I tillegg, ekspresjon av fosterets isoformen av IR, IR-A, er forhøyet i flere humane maligniteter og, i motsetning til signaler mediert av IR-B, som har en overveiende metabolsk effekt, IR-A har en overveiende proliferativ effekt [ ,,,0],28]. Zhang et al har vist at nedregulering av IR hemmet metastasering av brystkreftceller i en atymisk mus modell [29], og nyere undersøkelser har begynt å vurdere nytten av dual inhibering av IGF1R og IR i modeller av osteosarkom [30] og i bukspyttkjertelen nevroendokrine kreftutvikling [31]. I hvert tilfelle er IR bidratt til celleoverlevelse virkningen av IGF-systemet og forbedret flertrinns tumorprogresjon i bukspyttkjertelen nevroendokrine system. Disse studiene tyder på en rolle for IR i tumorigenesis.
I NSCLC involvering av IGF-systemet støttes av en rekke studier. Den IGF1R blir ofte uttrykt [32] – [34], og høy IGF-1 og lave IGFBP3 nivåer er assosiert med høyere risiko og øker alvorlighetsgraden av lungekreft [35], [36]. IGF1 har mitogen effekt på noen NSCLC-cellelinjer [37], [38], og fibroblast-avledede IGF2 fremmer veksten av NSCLC-celler in vivo [39]. Derav i NSCLC har det blitt begrunnet at IGF1R kan være en levedyktig terapeutisk mål. I en fase II-studie av avansert NSCLC, førstelinjebehandling med fullt humanisert monoklonalt IGF1R antistoff figitumumab (CP-751871) økte svarprosenten og progresjonsfri overlevelse nytte av paclitaxel og carboplatin [40]. Imidlertid ble nylig NSCLC fase III-studier testing figitumumab med enten kjemoterapi eller EGFR-hemmer erlotinib suspendert på grunn av manglende overlevelsesgevinst [41]. Gitt den voksende bevis for en rolle av IR i andre tumortyper, er det mulig at denne mangel på klinisk fordel av figitumumab i NSCLC skyldes, i det minste delvis, fra uhemmet signalering via IR.
I denne studien har vi fastslått hvorvidt signaliserer gjennom IR støtter NSCLC tumor celleproliferasjon når IGF1R hemmes. Vi benyttet nøytraliserende monoklonale antistoffer som selektivt binder IGF1R eller IR i tillegg til ATP-konkurrerende lavmolekylære inhibitorer som samtidig inhiberer begge reseptorer. Denne tilnærmingen også aktivere en sammenligning av efficacies av antistoffer og små molekyl hemmere rettet mot IGF-signale akse i hemme tumor celleproliferasjon.
Materialer og metoder
Material
AZ12253801 (Astra Zeneca, Macclesfield, Cheshire, UK), NVP-ADW742 (Selleck Chemicals, Houston, TX, USA) og Akti-1/2 (Merck, Darmstadt, Tyskland) ble gjort i DMSO (endelig konsentrasjon i forsøkene var 0,5% ( v /v)). αIR3 (Merck Chemicals Ltd., Nottingham) og IR47-9 (vennlig levert av Ken Siddle (University of Cambridge, UK)) ble utarbeidet i PBS. Insulin (Sigma, Poole, UK), IGF1 (Gro-Pep, Adelaide, Australia) og IGF2 (R 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
AZ12253801 Hemmer Nedstrøms Signale fra IGF1R og IR med Equal Potens mens hemmende monoklonale antistoffer (αIR3 og IR47-9) er spesifikke for deres Target Receptor.
i denne studien brukte vi hemmende monoklonale antistoffer αIR3 og IR47-9, rettet mot IGF1R [46] og IR henholdsvis [7], og ATP konkurranse lite molekyl kinase inhibitor AZ12253801 som har hemmende aktivitet mot både reseptorer . Innledende forsøk ble utført for å vurdere effekten og spesifisitet αIR3, IR47-9 og AZ12253801 i Hcc193 NSCLC cellelinje. 24 timer etter såing, ble cellene behandlet med αIR3, IR47-9 (0,5-10 ug /ml) eller AZ12253801 (2-100 nM) og deretter stimulert med vekstfaktor. En lav konsentrasjon (5 nM) til vekstfaktor ble anvendt slik de faktorer som aktiveres bare deres kognatreseptoren. Fosforyleringen av nedstrøms serin /treonin-kinase, Akt, på serin-473 (S473) ble anvendt som et mål på insulin- og IGF1-induserte signaleringsaktivitet.
Stimulering med enten insulin eller IGF-1 forårsaket øket fosforylering av Akt på S473 (figur 1A). Den IGF1R inhiberende monoklonalt antistoff, αIR3, hemmet IGF-1, men ikke insulin-mediert fosforylering Akt. Omvendt, IR-inhiberende monoklonalt antistoff, IR47-9, hemmet insulin, men ikke IGF-1 -mediert Akt fosforylering (figur 1B). Dette bekreftet at disse antistoffene inhiberer bare deres respektive reseptorer ved de antistoffkonsentrasjoner som anvendes i denne studien. Behandling med αIR3 redusert uttrykket nivået av IGF1R (figur 1A, hånd panel til høyre), som er i samsvar med tidligere observasjoner i MCF7- cellelinjen ([47]; DJEE, EK, JMT upubliserte observasjoner).
Hcc193 cellene ble behandlet enten αIR3 (A), IR47-9 (B) eller AZ12253801 (C) ved de angitte doser i 2 timer før 10 min inkubering med enten 5 nM insulin eller 5 nM IGF-1. Fosforylering av Akt på S473 og uttrykk for IGFRβ og IRβ ble bestemt ved western blotting ved hjelp av spesifikke antistoffer. Et anti-α-tubulin-antistoff ble anvendt som en kontroll for protein lasting. Alle primære antistoffer anvendt her detektere ett fremtredende bånd ved den forutsagte molekylvekt av proteinet antistoffet er dannet mot. Skannede bilder av immunoblotter blir beskåret til funksjonen dette fremtredende band.
Klargjøring av celler med AZ blokkert insulin og IGF1-indusert Akt fosforylering på en doseavhengig måte og med samme styrke (figur 1C ). I motsetning til forbehandling med hemmende monoklonale antistoffer, AZ12253801 (ved 25 nM og ovenfor) hemmet Akt fosforylering til nivåer under den i ubehandlede celler (figur 1C). Verken αIR3 eller IR47-9 oppnådd dette, selv ved den høyeste anvendte konsentrasjon (10 ug /ml) eller når den forhåndsbehandlingstiden (ved 2 ug /ml) ble utvidet til 24 timer (figur 1 A, B og data ikke vist). I motsetning til αIR3, gjorde AZ12253801 ikke reduseres uttrykket nivået av IGF1R.
Kombinert Hemming av IGF1R og IR Blocks cellevekst mer potent enn Hemming av IGF1R alene Hcc193 Cells
Å undersøke en mulig bidrag av IR i bære tumorcelleproliferasjon når IGF1R hemmes, Hcc193 NSCLC-celler ble dyrket under forankrings-uavhengig betingelser i nærvær av IGF1, IGF2 (ved konsentrasjoner som samtidig aktiverer begge reseptorer) og insulin (3GF, se Materialer og metoder). Virkningene på proliferasjon av inhibering av IGF1R og IR, alene og i kombinasjon, ble bestemt. Maksimalt effektive konsentrasjoner av inhibitor ble valgt på grunnlag av dataene i Figur 1.
Figur 2A illustrerer dataene sprednings for Hcc193 celler i forankrings-uavhengig kultur. 3GF forsterkes spredning av Hcc193 celler ved 1,6 ganger sammenlignet med det som ble observert med bilen alene. Inhibering av IGF1R ved αIR3 eller IR ved IR47-9 redusert proliferasjonen observert i nærvær av 3GF (3GF proliferasjon) med 22% (
p
0,0001) og 17% (
p
0,01) hhv. Blokkerer både IGF1R og IR med αIR3 og IR47-9 resulterte i en 48% reduksjon i 3GF spredning, en betydelig større effekt enn det som oppnås ved blokkering av reseptoren, enten alene (
p
mindre enn 1 x 10
-5 i hvert tilfelle). Oppdagelsen av at IR47-9 blokkert proliferasjon indusert av 3GF enten alene eller i kombinasjon med αIR3 antyder at insulinreseptoren er direkte i stand til å fremme proliferasjonen av Hcc193 celler.
(A) Hcc193 celler ble dyrket under anchorage- uavhengige forhold i 0,1% serum i nærvær av 3GF (1 nM insulin, 50 nM IGF-1, 50 nM IGF-2) alene og i kombinasjon med αIR3 (2 ug /ml), IR47-9 (2 ug /ml) , αIR3 (2 ug /ml) og IR47-9 (2 ug /ml), og AZ12253801 (50 nM), som angitt. Etter 5 dager levedyktige celler ble beregnet ved fluorescensen av metabolsk reduksjonsproduktet av Alamar blue. Hver søyle representerer den gjennomsnittlige fluorescens av fire gjentatte brønner ± standardavvik fra et enkelt eksperiment. Resultatene som er vist er representative for 3 uavhengige eksperimenter. ***,
p
1 x 10
-5; **,
p
0,0001; *,
p
0,01 (gyldig for alle repetisjoner); tosidige uparede
t
test. (B) Hcc193 celler ble behandlet med αIR3 (2 ug /ml), IR47-9 (2 ug /ml), αIR3 (2 ug /ml) og IR47-9 (2 ug /ml), og AZ12253801 (50 nM) som indikert i 2 timer før 10 min inkubering med bærer eller 3GF. Fosforylering av Akt på S473 og uttrykk for IGFRβ og IRβ ble bestemt ved western blotting. Et anti-α-tubulin-antistoff ble anvendt som en kontroll for protein lasting. Alle primære antistoffer anvendt her detektere ett fremtredende bånd ved den forutsagte molekylvekt av proteinet antistoffet er dannet mot. Skannede bilder av immunoblotter blir beskåret til funksjonen dette fremtredende band.
Samtidig blokade av IGF1R og IR hjelp AZ12253801 resulterte i en større hemming av spredning (75%) enn det som oppnås med αIR3 og IR47-9 i kombinasjon (
p
1 x 10
-5) (figur 2A). Dette kan forklares ved den økte effektiviteten av AZ12253801 til å inhibere 3GF-indusert fosforylering Akt (figur 2B). Videre, de kombinerte antistoffene var mer effektiv ved inhibering av Akt-fosforylering enn var hvert antistoff alene (figur 2B). Således er virkningen av inhibitorer på 3GF-indusert fosforylering Akt, når de tilsettes alene eller i kombinasjon, parallelt med deres virkning på 3GF-indusert proliferasjon.
Den IGFR til IR Expression forhold kan tippe avhengighet av celler på IR for Survival
Vi neste undersøkt om den relative uttrykk for IGF1R og IR reseptorer påvirket evnen til IR47-9 å hemme tumor celleproliferasjon eller sammenlignende effekt av AZ12253801 og de kombinerte nøytraliserende antistoffer. For dette formål en annen NSCLC linje, ble A549 benyttes som uttrykker omtrent like mange IR eksempel Hcc193 celler, men betydelig mer IGF1R, som bestemt ved Western blotting av lysat like mengder (figur 3A). Densitometrisk analyse indikerte at Hcc193 celler har en IR. IGF1R uttrykk forholdet ~15 ganger større enn A549 celler
(A) Sammenligning av uttrykk for IGF1Rβ og IRβ i Hcc193 og A549 cellelinjene ble bestemt ved western blotting hjelp 15 ug protein ekstrahert fra hver cellelinje. (B) A549-celler ble dyrket under forankrings-uavhengig betingelser i 0,1% serum i nærvær av 3GF alene og i kombinasjon med αIR3 (2 ug /ml), IR47-9 (2 ug /ml), αIR3 (2 ug /ml ) og IR47-9 (2 ug /ml), og AZ12253801 (50 nM), som angitt. Etter 5 dager levedyktige celler ble beregnet ved fluorescensen av metabolsk reduksjonsproduktet av Alamar blue. Hver søyle representerer den gjennomsnittlige fluorescens av fire gjentatte brønner ± standardavvik fra et enkelt eksperiment. Resultatene som er vist er representative for 3 uavhengige eksperimenter. ***,
p
1 x 10
-6; **,
p
0,0001; *,
p
0,05 (gyldig for alle repetisjoner); tosidige uparede
t
test. (C) A549-celler ble behandlet med αIR3 (2 ug /ml), IR47-9 (2 ug /ml), αIR3 (2 ug /ml) og IR47-9 (2 ug /ml), og AZ12253801 (50 nM) som indikert i 2 timer før 10 min inkubering med bærer eller 3GF. Fosforylering av Akt på S473 og uttrykk for IGFRβ og IRβ ble bestemt ved western blotting. Et anti-α-tubulin-antistoff ble anvendt som en kontroll for protein lasting. Skannede bilder av immunoblotter beskjæres til funksjonen fremtredende band.
A549 celler ble dyrket under de betingelser som er beskrevet for Hcc193 (figur 2). 3GF forsterkes proliferasjonen av A549 celler ved to-ganger over det som ble observert for kjøretøyet kontroll (figur 3B). Hemming av IGF1R ved αIR3 redusert 3GF-stimulert spredning med 40% (
p
1 x 10
-6) ca. 2 ganger reduksjon sett i Hcc193 celler. I motsetning til inhibering av IR ved IR47-9 hadde en beskjeden effekt reduserende 3GF proliferasjon med 10% (
p
0,05) og, i motsetning til med Hcc193 celler, nærværet av IR47-9 mislyktes i å forbedre effekten av αIR3 på 3GF proliferasjon (figur 3B). Således i A549-celler IR er mye mindre effektive i å støtte forankrings-uavhengig spredning enn det som sees med Hcc193 celler. Ikke desto mindre, som observert med Hcc193 celler, graden av inhibering av A549 cellevekst med AZ12253801 var signifikant større enn det som ble observert i nærvær av antistoffet kombinasjonen (p 0,0001, figur 3B).
Effekten av inhibitorene i A549 forankrings-uavhengig analysen var igjen i samsvar med deres effekt på Akt fosforylering (figur 3C); αIR3 hemmet 3GF-indusert Akt fosforylering, uten ekstra effekt ble observert når IR47-9 ble kombinert med αIR3, og AZ12253801 var mer effektiv enn αIR3 (eller kombinert αIR3 og IR47-9). αIR3 forårsaket en reduksjon i uttrykket av IGF1Rβ men ikke fra IRβ i A549 celler (figur 3C), som tidligere observert i Hcc193 celler (figur 1 og 2).
Effektiv hemming av celleproliferasjon ved et lite molekyl IR /IGF1R Inhibitor strukturelt forskjellige til AZ12253801
i både Hcc193 og A549 cellelinjer AZ12253801 har en større hemmende effekt på forankringsuavhengig spredning enn kombinert αIR3 og IR47-9. For å undersøke hvorvidt ATP-konkurrerende inhibitorer av IGF1R /IR tilveiebringe en mer effektiv måte til å inhibere vekstfaktor-indusert celleproliferering enn nøytraliserende antistoffer, er effekten av et strukturelt distinkt ATP-konkurrerende lite molekyl IGF1R /IR inhibitor NVP-ADW742 på vekst av Hcc193 og A549 ble også vurdert. NVP-ADW742 doseavhengig redusert 5 nM IGF-1 og 5 nM insulin-stimulert Akt fosforylering i Hcc193 og A549 celler med en maksimal effektiv konsentrasjon nås på 1 mikrometer (Figur 4A).
(A) Hcc193 og A549-celler ble behandlet med NVP-ADW742 (0,1 til 3 mm) i 2 timer før 10 min inkubering med 5 nM insulin eller 5 nM IGF-1. Fosforylering av Akt på S473 ble bestemt ved Western blotting. Et anti-α-tubulin-antistoff ble anvendt som en kontroll for protein lasting. (B) Hcc193 og A549-celler ble dyrket under forankrings-uavhengig betingelser i 0,1% serum i nærvær av 3GF alene og i kombinasjon med αIR3 (2 ug /ml) og IR47-9 (2 ug /ml), AZ12253801 (50 nM ), NVP-ADW742 (1 uM), eller Akti-1/2 (10 pM) som angitt. Etter 5 dager levedyktige celler ble beregnet ved fluorescensen av metabolsk reduksjonsproduktet av Alamar blue. Hver søyle representerer den gjennomsnittlige fluorescens av fire gjentatte brønner ± standardavvik fra et enkelt eksperiment. Resultatene som er vist er representative for 2 uavhengige eksperimenter. ***,
p
0,001; **, P 0,01 (gyldig for hvert forsøk); tosidige uparede
t
test. (C) Hcc193 og A549-celler ble behandlet med αIR3 (2 ug /ml) og IR47-9 (2 ug /ml) AZ12253801 (50 nM), NVP-ADW742 (1 uM) eller Akti (10 pM) som angitt for to h før 10 min inkubering med bærer eller 3GF. Fosforylering av Akt på S473 og uttrykk for IGFRβ og IRβ ble bestemt ved western blotting ved hjelp av spesifikke antistoffer. Et anti-α-tubulin-antistoff ble anvendt som en kontroll for protein lasting.
Figur 4B illustrerer den forankrings-uavhengig spredning av Hcc193 og A549-celler henholdsvis i nærvær av 3GF og effekten av αIR3 og IR47-9, AZ12253801 og NVP-ADW742 på dette. NVP-ADW742 hemmet 3GF-indusert Hcc193 og A549-celle proliferasjon til en tilsvarende grad for å AZ12253801 og i større grad enn det som observeres med en kombinasjon av αIR3 og IR47-9. Dette ble reflektert i større grad av hemming av Akt fosforylering av ATP-konkurrerende hemmere sammenlignet αIR3 /IR47-9 (Figur 4C).
Den nære sammenhengen mellom effekten av AZ12253801, NVP-ADW742, αIR3 og IR47-9 på celleproliferasjon og videre Akt fosforylering antydet at Akt kan bidra til 3GF-stimulert proliferasjon av cellene. For å utforske dette nærmere vi brukte en selektiv allosterisk hemmer av Akt, Akti-1/2 på Hcc193 og A549 celler. Akti-1/2 var like effektiv som AZ12253801 og NVP-ADW742 ved inhibering av forankrings-uavhengig celleproliferering (figur 4B) og lignende effektive ved inhibering av Akt-fosforylering (figur 4C). Dette resultatet er i tråd med Akt medierforankringsuavhengig spredning av disse cellelinjer nedstrøms IGF1R og IR.
Diskusjoner
IGF1-R har et godt etablert rolle i tumordannelse, men den siste svikt i IGF1-R monoklonalt antistoff figitumumab i NSCLC-studier har stilt spørsmål ved om rettet mot denne veien alene vil føre til en terapeutisk effekt. Emerging bevis tyder på at signalisering gjennom de relaterte IR tilveiebringer en mekanisme ved hvilken tumorceller motstå virkningene av IGF1-R-inhibering i humant osteosarkom og brystkreft. I samsvar med dette, våre data støtter en potensiell rolle for IR i proliferasjon av NSCLC-cellelinjer med en høy IR: IGF1R-forhold. I tillegg gir vi bevis for at dobbel blokkering av IR og IGF-1R ved hjelp av en ATP-konkurrerende lite molekyl IR /IGF-1R-inhibitor har forbedret effekt ved inhibering av NSCLC-celledeling enn det som oppnås ved samtidig hemming av IR og IGF1-R ved hjelp selektive monoklonale antistoffer.
i samsvar med den etablerte rolle IGF1 i bære tumorcelleproliferasjon [17], [30], [31], [38], [48], nøytraliserende antistoff-rettet blokade av IGF1 R i hver av NSCLC-cellelinjene som ble testet resulterte i en delvis inhibering av proliferasjon (figur 2-4). A549-celler ble mer sensitive enn Hcc193 i denne forbindelse muligens gjenspeiler den høyere ekspresjon av IGF1R i A549 og den resulterende lave IR: IGF1R uttrykk forhold. Selektiv blokade av IR ved hjelp av et spesifikt antistoff også redusert spredning i hver cellelinje. I Hcc193 celler, som har et relativt høyt IR: IGF1R uttrykk ratio, omfanget av denne reduksjonen var lik den som er forårsaket av IGF1R inhibering, men i A549-celler reduksjon i proliferasjon ved blokkering av IR var merkbart mindre enn det som ble sett ved IGF1R inhibering. Disse funn er i overensstemmelse med en tidligere rapport som viser at en brystkreftcellelinje med høy IR: IGF1R uttrykk ratio (MDAMB231) var mer følsom overfor IR-blokade enn en cellelinje med en lav IR: IGF1R uttrykk ratio (MCF7) [31]. Undertrykkelse av IR-ekspresjon av RNA-interferens er også blitt vist å hemme celleproliferasjon, i hvilken grad dette skjer, varierer med celletype og typen av analyse [29], [30]. IR støtter derfor svulst celle spredning av flere celletyper uavhengig av IGF1R, og vi har her utvidet disse observasjonene til NSCLC celler.
Kombinert hemming av IGF1R og IR med monoklonale antistoffer i Hcc193 cellelinjen redusert spredning i en større grad enn inhibering av enten reseptoren alene. Dette indikerer at i NSCLC IR har potensial til å bidra til resistens overfor inhibering IGF1R ved å støtte cellevekst. En slik rolle for IR i sammenheng med målrettede IGF1R har blitt vist i en transgen musemodell av pankreatisk neuroendocrine karsinogenese og humane brystcancerceller [31], og i osteosarcom-cellelinjer [30]. I begge disse studier IGF2, snarere enn IGF1, ble definert som den vekstfaktor signalisering gjennom IR å bevirke denne protumorigenic virkning. Dette kan også være tilfellet i NSCLC hvor IGF2 er kjent for å understøtte tumorvekst [39], [49]. I tillegg er det mulig at insulin i seg selv kan bidra i denne forbindelse som den har godt etablerte mitogene egenskaper [23] – [26] og er inkludert, med IGF1 og IGF2, i vekstmediet i denne studien. Blokade av IR mislyktes i å forsterke effekten av IGF1R inhibering i A549-celler tyder på at i NSCLC-tilfeller hvor lave forhold mellom IR: IGF1R uttrykk finnes, og når disse cellene blir utsatt for IGF1 i tillegg til IGF2 og insulin, co-målrettet mot IR- ikke kan være fordelaktig.
Små molekyl tyrosinkinase-inhibitorer så som AZ12253801, NVP-ADW742 og BMS754807 [50], [51] inhibere både IGF1R og IR og, som sådan, har potensial til å være mer effektive anti-neoplastiske midler enn antistoffer mot IGF1R. Faktisk, i denne studien virkningen av AZ12253801 på Hcc193 celler var i overensstemmelse med den av dual IGF1R og IR blokade av antistoffer som graden av hemming av proliferasjon var større enn sett på blokade av IGF1R alene.
