Abstract
Vi har tidligere rapportert at retigeric syre B (RB), en naturlig penta triterpenic syre isolert fra lav, hemmet cellevekst og induserte apoptose i androgen-uavhengig prostatacancer (PCA) celler. Imidlertid er virkningsmekanismen til RB er fortsatt uklar. I denne studien fant vi at bruk PC3 og DU145 cellene som modeller, RB hemmet fosforylering nivåer av IκBα og p65 underenhet av NF-kB i et tids- og doseavhengig måte. Detaljert studie viste at RB blokkert den kjernefysiske translokasjon av p65 og dens DNA-bindende aktivitet, som korrelert med undertrykkelse av NF-kB-regulerte proteiner inkludert BCL-2, Bcl-x
L, cyclin D1 og Survivin. NF-kB reporter-analyse antydet at RB var i stand til å hemme både konstitutivt aktivert-NF-kB og LPS (lipopolysakkarid) -indusert aktivering av NF-kB. Overekspresjon av Rela /p65 reddet RB-indusert celledød, mens knockdown av forhold /p65 i betydelig grad fremmet RB-mediert inhibitorisk virkning på celleformering, noe som tyder på avgjørende involvering av NF-kB banen i dette arrangementet. Vi analyserte videre antitumor aktivitet av RB i
in vivo
studien. I C57BL /6-mus som bærer RM-1 homografts, RB inhiberte tumorvekst og utløst apoptose hovedsakelig gjennom undertrykke NF-kB aktivitet i tumorvev. I tillegg er DNA mikroarray data indikerer globale endringer i genekspresjon assosiert med celleproliferasjon, apoptose, invasjon og metastase i respons til RB behandling. Derfor våre funn antydet at RB utøvet sin anti-tumor effekt ved å målrette den NF-kB banen i PCA-celler, og dette kan være en generell mekanisme for den anti-tumor effekt av RB i andre typer kreft i tillegg.
Citation: Liu YQ, Hu XY, Lu T, Cheng YN, Young CYF, Yuan HQ, et al. (2012) Retigeric Acid B utstillinger Antitumor aktivitet gjennom Suppression of Nuclear Factor-kB signale i prostata kreft celler
In Vitro Hotell og
i Vivo
. PLoS ONE 7 (5): e38000. doi: 10,1371 /journal.pone.0038000
Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 26 desember 2011; Godkjent: 28 april 2012; Publisert: May 29, 2012 |
Copyright: © 2012 Liu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (30973551, 30925038), og Shandong Scientific Technology Program (2008GG10002042). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) er en av de vanligste ondartede svulster hos menn [1]. Den fortsetter fra et lokalisert, androgen-avhengige sykdommer for å invasive og metastatisk hormon ildfaste prostatakreft (hrpc), uten noen vesentlig prognostisk fordel med konvensjonelle antitumormidler [2]. Derfor er nye strategier rettet mot det molekylære grunnlaget for PCa progresjon presserende behov.
Den avgjørende nukleær faktor kB (NF-kB), et veldokumentert Transkripsjonsfaktor, er kritisk viktig for kontroll av celleproliferasjon hos pattedyr. I klassiske veien, er de typiske NF-kB-dimerer (p50 /p65) som normalt sekvestrert ved binding til IκBα i cytoplasma. Den IκBα subenheten fosforyleres ved serinresidua 32 og 36 ved IKK, og deretter nedbrytning gjennom proteosomal vei, P50-P65-IκBα heterotrimer snu i p50-p65 heterodimer. De nukleære lokaliseringssignaler av NF-kB-proteinet er eksponert og dens p65 subenhet er fosforylert, som fører til kjernetranslokasjon og transkripsjonen aktivering potensial, og til slutt å indusere ekspresjon av et stort antall av målgener. [3], [4] bevisende bevis har blitt demonstrert at avvikende NF-kB regulering er assosiert med initiering og progresjon av ulike typer av kreft hos mennesker, inkludert PCa, ved å regulere ekspresjon av gener som er viktige for mange trinn av tumorigenese og progresjon [2]. For eksempel, de typiske NF-kB-gener Bcl-2 og Survivin, korrelert med celleoverlevelse; cyclin D1, korrelert med spredning; cyklooksygenase-2 (COX-2), korrelert med inflammasjon; matrise-metalloproteinase-9 (MMP-9) og intercellular adhesjonsmolekyl (ICAM), korrelert med invasjon; vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) og plasminogenaktivator urokinase (plau), korrelerer med angiogenese [3], [4], [5]. Det er observert at nukleær lokalisering av NF-kB p65 i primærsvulster prøvene [6], [7], som tyder på at konstitutive NF-kB-aktivering kanskje en tidlig begivenhet i PCa utvikling og ha prognostisk betydning for primære svulster. Derfor, avskjærende NF-kB signalering kan være en attraktiv antitumor tilnærming [4], [5], [8], [9]. Undertrykkelse av NF-kB aktivitet har blitt vist å undertrykke veksten av en rekke kreftceller både
in vitro
og
in vivo
. Videre spiller den anti-apoptotiske aktivitet av NF-kB en rolle i motstanden av tumorceller overfor kjemoterapeutiske reagenser og strålebehandling [8]. I kjemoresistent androgen-uavhengig PCA celler er NF-kB konstitutivt aktivert på grunn av det konstituerende IKB kinase (IKK) aktivitet [4], [5].
Vår tidligere studie har vist at retigeric syre B (RB) , en naturlig penta triterpenic syre, besitter evnen til å hemme cellevekst og induserer apoptose i flere cellelinjer, blant annet av PCA-celler [10]. Nedregulering av ekspresjonen av Bcl-2, som er en av de NF-kB-avhengige gener, og aktiveringen av caspase signalering blir observert i RB-behandlede PC3-celler [10], [11]. I tillegg, lik strukturen av RB, andre plante-avledet triterpenoids herunder av acetyl-11-keto-β-boswellic syre (AKBA), ursolic syre og betulinsyre, har blitt rapportert å interferere med NF-kB veien [12] , [13], [14]. Disse funnene bedt oss å teste hypotesen om at RB kan utøve sin kreft effekter ved PCA gjennom modulering av NF-kB signalering. I denne studien, viste vi at RB nedregulert p65 fosforylering og kjernefysisk translokasjon, og blokkerte konstitutiv aktivering av NF-kB signalisering i androgen-uavhengig PC3 og DU145 celler og i C56BL /6 homografts mus.
resultater
RB utstillinger hemmende effekt på p65 fosforylering i carcinoma celler
Vi innledet studien for å teste om RB utløst apoptose gjennom å hemme uttrykk og aktivering av NF-kB i PC3 og DU145 cellene der NF-kB-signalering er konstitutivt aktivert og har bidratt til deres resistens mot apoptose på grunn av ekspresjon av NF-kB-modulerte antiapoptotic proteiner. Som vist i figur 1A og 1B, viste RB svakt hemmende virkning på ekspresjon av p65 samlede subenhet av NF-kB i PC3 og DU145-celler (1.1~1.3 gangers nedgang for den høyeste dose), mens signifikant nedregulert fosforylering av p65 -Ser536 var både dose- og tidsavhengig (4~6 gangers nedgang for den høyeste dose, eller 48 h). Lignende observasjoner av protein nivåene av total p65, kvantitative PCR-data viste at mRNA-nivået av p65 ble inhibert med RB behandling i en moderat måte (figur 1C, 1D). Behandling av PC3 og DU145-celler med 10 pM av RB i 24 timer resulterte i en reduksjon av mRNA nivået av p65 i forhold til bilen kontroll (figur 1C, 1D) ~35%.
(A) og (B ) RB svakt hemmet ekspresjon av p65 i PC3 og DU145-celler, mens signifikant for Ser-536-fosforylering av p65 (
p-p65
), i begge doseavhengig og tidsavhengig måte. Lysater fra hele celler behandlet med forskjellige konsentrasjoner av RB til 24 timer (A) eller med 10 mM RB for angitte tider ble anvendt for western blot (B). GAPDH tjente som lasting kontroll. Proteinmengden ble normalisert til mengden GAPDH, og ble kvantifisert ved densitometri av røntgenfilmer. Resultater av en av minst tre uavhengige eksperimenter er vist. (C) og (D) RB moderat nedregulert p65 mRNA-nivå i PC3 og DU145 celler som detektert ved QRT-PCR-analyse. Prosedyren ble utført som beskrevet i
Materialer og metoder
. Resultatene som vises er representanter for tre uavhengige eksperimenter, p 0,05 (*), versus RB-ubehandlet kontrollgruppe henholdsvis
For å utvide vår observasjon av redusert fosfor p65 i PCA celler, vi oppdaget nivåene. av total p65 og fosfor-p65 i andre kreftcellelinjer. Resultatene viste at RB var i stand til å redusere p65 fosforylering i et panel av carcinoma cellelinjer inkludert menneskelever hepatocellulært celler HepG2 celler, human myeloid leukemi cellelinje K562 celler og adriamycin-resistente K562 /ao2 celler i angitte dose, mens svak effekt på human eggstokkreft SKOV3 og menneskelige lunge adenokarsinom A549 celler (Figur S1). Sammen viser resultatene at det RB spilte en dyp effekt på undertrykkelse av p65 fosforylering, spesielt i PCA celler.
RB undertrykker den kjernefysiske trans og aktivering av NF-kB i PCA celler
Vi testet om RB-mediert undertrykkelse av fosfor-p65 førte til en nedgang i nukleær lokalisering av p65 i PC3-celler, noe som er nødvendig for NF-kB å aktivere målgenet transkripsjon. Som vist i figur 2A, RB dramatisk redusert overflod av fosfor-p65 i kjernen på en doseavhengig måte, og de reduserte nivåer av fosfor-p65, til en viss grad ble observert i cytoplasma i tillegg. De immunfluorescens Resultatene i figur 2B bekreftet videre at, i likhet med den western blot-analyse ble betydelig redusert atom opphopning av p65 ble klart observert, mens p65 ble diffust presentert gjennom cytosol og kjernen i ubehandlede celler.
( A) RB dosering avhengig hemmet kjernefysiske lokalisering av p65 Lysates fra cytoplasma og cellekjernen henholdsvis etter behandling av PC3 celler med RB i 24 timer ble brukt til western blot. GAPDH og H1 tjente henholdsvis som lasting kontroll. (B) Immunofluorescensanalyse av inhiberende nukleær lokalisering av p65 ved RB-behandling i 12 timer i PC3-celler. For konfokal mikroskopi, ble α-tubulin og p-p65 immunfarget, med kjerner farget med DAPI. (Scale bar, 10 mikrometer). (C) Forbehandling av PC3 celler med RB hemmet binding av atom ekstrakter til NF-kB bindingssetet, som oppdaget av elektromobilitet skift analysen. Lysater fra kjerner etter behandling av PC3-celler med RB i 24 timer ble brukt for EMSA. (D), (E) og (F) RB redusert NF-kB-aktivering i PC3 og DU145-celler og inhiberte LPS-indusert NF-kB-aktivering i LNCaP-celler. Inhiberingen var mer signifikant når PNF-kB-luciferase og RELA ekspresjonsvektor ko-transfektert. Forbigående transfekterte celler ble preinkubert med RB i 24 timer. Den luciferase analysen ble gjort som beskrevet i
Materialer og metoder
. I (D) – (F), resultatene er gjennomsnittet ± S.E. av tre uavhengige eksperimenter som hver ble utført i tre eksemplarer. p 0,05 (*), p 0,01 (**), p. 0,001 (***) versus RB-ubehandlet kontrollgruppe henholdsvis
Elektro mobilitet shift analyse (EMSA) var neste ferdig for å teste om RB påvirket NF-kB DNA bindingsevnen i PC3 celler. Et sterkt bånd skift ble påvist når kjerneekstrakt fra ubehandlede kontrollceller (kolonne 4 i Figur 2C), mens bindingskompleksene ble merkbart redusert i RB-behandlede celler i doseavhengig måte (figur 2C, kolonnene 5 og 6). Spesifisiteten til NF-kB-binding ble bekreftet i konkurranseeksperimenter med et 100-gangers molart overskudd av umerket NF-kB (figur 2C, kolonne 2). AKBA, tjente som en positiv kontroll, redusert bindingsaktiviteten av NF-kB i tillegg (figur 2C, felt 3).
I et forsøk på å bestemme om RB tilsvarende hemmet NF-kB transkripsjonen aktivitet, utførte vi forbigående transfeksjon analyser ved anvendelse av et reporter plasmid inneholdende 4 tandem-kB-bindingsseter oppstrøms av luciferasegenet. Som vist i figur 2D, RB forårsaket en signifikant reduksjon (p 0,05) i NF-kB aktivitet reporter i PC3-celler sammenlignet med ubehandlede celler. Ektopisk ekspresjon av p65 (RELA) resulterte i en betydelig oppregulering av NF-kB luciferase-aktivitet, som også kan være sterkt redusert (p 0,001) etter behandling med RB (figur 2D). Lignende resultater ble oppnådd i DU145 cellene under samme forsøksbetingelser (figur 2E).
For å undersøke at RB var i stand til å undertrykke induserbar NF-kB aktivitet, utførte vi NF-kB reporter analysen i LNCaP celler. I motsetning til PC3 eller DU145 celler, LNCaP-celler er kjent for å ha lav NF-kB aktivitet. Som vist i figur 2F, ble NF-kB-avhengig reporter aktivitet økte etter behandling med NF-kB-induserende faktor LPS alene. Men luciferase produksjonen ble dypt utvidet i celler ved overekspresjon av p65 (RELA). Aktiviteten av NF-kB ble ytterligere dramatisk redusert i celler eksponert for RB. Disse data viste at RB trykkes både den induserbare (ved LPS) og konstitutiv NF-kB aktivitet ved PCA-celler, eventuelt gjennom RB-mediert nedregulering av fosforylering, nukleær translokasjon og DNA-bindingsevnen av NF-kB.
RB hemmer IκBα fosforylering og dens degradering
for å undersøke om RB-mediert inaktivering av NF-kB ble tilskrevet hemming av IκBα degradering, vi undersøkte endring av IκBα i respons til RB av western blot analyse. Som vist i Figur 3A, har behandling med økt konsentrasjon av RB ga overekspresjon av total IκBα i begge PC3 og DU145-celler. Tilsvarende ble redusert IκBα fosforylering observert etter behandling med 10-20 uM av RB i disse to cellelinjene. Tidskinetiske studier viste at RB opp-regulert ekspresjon av total IκBα, og forårsaket en reduksjon i fosforyleringen av IκBα fra ~12 h i PC3-celler (Figur 3B). Lignende effekt ble observert i DU145-celler etter lengre tid (24 timer) behandling med RB enn i PC3-celler (Figur 3B). Proteasomet aktivitetsanalyse viste at RB ikke utøve inhiberende effekt på rekombinante 20S-proteosomet enzym (figur 3C), som er nødvendig for phosphorylatoin avhengige IκBα nedbrytning. Derved viser resultatene at det nedregulert av IκBα nedbrytning og p65 fosforylering kan skyldes den effektive undertrykkelse av ikk aktivering av RB, som til slutt fører til inhibisjon av NF-kB aktivitet.
(A) Western blot analyse av uttrykk for total IκBα og fosfor-IκBα (
p-IκBα, etter Ser32 /36) p-IκBα. PC3 og DU145-celler ble behandlet med RB av forskjellige doser som angitt. (B) Western blot-analyse av ekspresjon av total IκBα og p-IκBα. PC3 og DU145-celler ble behandlet med RB forskjellige tider som angitt. I (A) og (B), ble det tilsvarende protein lasting evaluert av GAPDH. Proteinmengden ble normalisert til mengden GAPDH, og ble kvantifisert ved densitometri av røntgenfilmer. Resultater av en av minst tre uavhengige eksperimenter er vist. (C) Effekten av RB på den rensede 20S proteasome
in vitro
. MG132 tjente som positiv kontroll. Resultatene er gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter, p 0,05 (*), p. 0,01 (**), henholdsvis versus ubehandlet kontrollgruppe
RB undertrykker uttrykk for NF-κB- regulerte gener, induserer apoptose, og reduserer cellevandring gjennom inhibisjon av NF-kB veien
Ettersom NF-kB regulerer en rekke gener som er involvert i cellevekst, apoptose, angiogenese og metastase av tumorceller, vi undersøkt hvorvidt inhibering av NF-kB aktivitet av RB kan transkripsjonelt føre til modulering av slike genprodukter. Behandling av RB betydelig redusert ekspresjon av Bcl-x
L, Bcl-2, Survivin, og cyklin D1 både mRNA (figur 4A) og proteinnivåer (figur 4B) i enten PC3 eller DU145-celler i en dose-avhengig måte. Survivin, en kjent antiapoptotic protein, ble også betydelig redusert i RB-behandlede celler som vist i Figur 4B.
(A) RB doseavhengig inhibert av mRNA-ekspresjon av Bcl-x
L, Bcl- 2, survivin, og cyklin D1 som analysert ved QRT-PCR. GAPDH ble anvendt for normalisering. Resultatene er gjennomsnittet ± SD fra tre uavhengige forsøk, hvert utført in triplo. p 0,05 (*), p 0,01 (**), p 0,001 (***) henholdsvis mot RB-ubehandlet kontrollgruppe. (B) RB doseavhengig måte inhiberte ekspresjon av Bcl-x
L, Bcl-2, Survivin, og cyklin D. Resultatene av Western blot-analyse av hele cellelysater fra PC3-celler behandlet med forskjellige doser av RB ble vist; GAPDH ble inkludert som en lasting kontroll. (C) RB hemmet invasjon av PCA-celler på en konsentrasjonsavhengig måte som påvist ved transwell assay (skala bar, 100 pm). Prosedyren ble beskrevet i
Materialer og metoder
. (D) Antall celler som invadere gjennom matrigel.
Hemming av NF-kB av RB førte oss til ytterligere å analysere virkningen av RB på celle invasjon. Som vist på figur 4C, invasivitet gjennom matrigel var konsentrasjonsavhengig redusert i RB-behandlede PC3 og DU145-celler når sammenlignet med bærerbehandlede celler. Som oppsummert i figur 4D, RB behandlingen resulterte i signifikant blokk av cellemigrering i en dose-avhengig måte. Disse resultatene indikerte at redusert aktivering av NF-kB av RB deretter undertrykt NF-kB-avhengige antiapoptotic og invasive proteiner, noe som fører til reduksjon av tumorcelle-invasjon.
For å evaluere endringer av global genekspresjon i PC3-celler etter behandling med RB, ble Affymetrix Genechip human Genome U133 Plus 2,0 matrise, som inneholdt ca. 39 000, karakterisert humane gener, som brukes til å utføre forsøket. Totalt 855 gener ble oppregulert større enn to ganger endring, og 763 gener nedregulert i RB-behandlede PC3 celler sammenlignet med kontrollceller. Resultatene i supplerende data (tabell S1) viste at mRNA-nivåene av NF-kB familie og NF-kB-assosierte gener, i tillegg til andre celle proliferation- og overlevelses-assosierte gener, og apoptotiske regulatoriske genene presentert åpenbart endring ( = 1,5 ganger). Disse resultatene er stort sett i tråd med våre data beskrevet. Mange typiske gener som Bcl-x
L, cyclin D1, p27, p21, etc. ble nedregulert i RB behandlet prøven (figur S2), derfor hemmer ytterligere bekreftet RB NF-kB signalering og dens nedstrøms mål genuttrykk.
for å avgjøre om p65 (RELA) spiller en viktig rolle i RB-innlemmet apoptose i PCA celler, testet vi effekten av RB på celle levedyktighet i celler som enten er over-uttrykt med eller ablated for p65 av siRNA. Det ble observert at p65 ekspresjonsplasmid faktisk forbedret ekspresjon og fosforylering nivåer av p65 over basalnivåer (figur 5A), og resulterte i en delvis redning av konsekvensene for RB-indusert celledød i begge PC3 og DU145-celler (Figur 5B) Dette indikerer at p65 dratt cellen resistens mot apoptose indusert av RB.
(A) og (B) RELA overekspresjon ved transfeksjon av en RELA ekspresjonsvektor delvis avskaffet cytotoksisitet i PC3 og DU145-celler. -Celler ble transfektert med siRNA av RELA (Relai) eller med en negativ kontroll siRNA (NCI), ved anvendelse av en 50 nmol /liter sluttkonsentrasjon siRNA. Etter 48 timers transfeksjon for RELA overekspresjon, effekten av RB på p65, p-p65, og PARP ekspresjon i forhold transfekterte celler, ble bestemt ved western blot; cellelevedyktighet ble også bestemt etter ytterligere eksponering i 24 timer til RB. (C) og (D) stanse av RELA uttrykk av siRNA økte cytotoksisitet indusert av RB. Lignende prosedyre ble utført for studier på RELA. Detaljene er beskrevet i
Materiale og metode
. I (A) og (C), ble protein nivåene av p65 og p-p65 normalisert til GAPDH. Resultatene som vises er representanter for tre uavhengige eksperimenter. I (B) og (D), p 0,05 (*), p 0,01 (**), p. 0,001 (***) versus RB-ubehandlet kontrollgruppe, henholdsvis
i siRNA forsøket, valgte vi en av p65-målretting siRNA som utøves en sterk aktivitet til å utarme p65 ekspresjon for evaluering av celleoverlevelse (data ikke vist). Som vist i figur 5C, ble ekspresjon og fosforylering av p65 merkbart nedlagt i celler transfektert med p65-målretting siRNA, sammenlignet med krafse siRNA. Knockdown av p65 undertrykte betydelig cellevekst (figur 5D), og RB behandlingen resulterte i mye lavere nivå av fosfor-p65 og PARP (116 kDa) i p65-utarmet celler og (figur 5C), som fører til mer uttalt inhibering av celle levedyktighet. Derfor er disse resultatene indikerte at NF-kB p65 var avgjørende for RB-indusert celledød.
RB utøver sin antitumoraktivitet gjennom undertrykkelse av p65 fosforylering i tumorvevet hos mus
Å demonstrerte effekt av RB for blokkering av NF-kB signalisering i PCA-celler i kultur, har vi undersøkt ved sin potensielle antitumoreffekt på mus. I særdeleshet har vi utført studier for å undersøke ekspresjon og aktivering av p65 i tumorvev hos mus. Først undersøkte vi cytotoksiske aktiviteten til RB og AKBA. RB og AKBA bemerkelsesverdig redusert RM-1-cellevekst (data ikke vist). Enda viktigere, RB og AKBA undertrykte betydelig fosforylering av p65 i RM-1 celler ved ønskede konsentrasjoner (Figur 6A). Dermed er denne cellelinje som tilsvarer dets menneskelige motstykker, og ble anvendt for etablering av PCA homografts i hann C57BL /6 mus. Etter planting RM-1-celler subkutant inn i C57BL /6-mus, behandlet vi mus ved daglige intraperitoneale injeksjoner med 25 mg /kg av RB opprettet 7 dager etter celle inokulering og fortsatt i ytterligere 18 dager. Gruppe av behandling med 25 mg /kg av AKBA tjente som positiv kontroll. Sammenlignet til å motta bærerkontrollgruppen, eller RB- AKBA-behandling reduserte betydelig gjennomsnittlig tumorvolum etter 6., 12. og 18
th dagers behandling viste RB gruppe en kraftigere potensial (figur 6B og 6C). Resultatene i tabell 1 viser at, tumorvekt ble også redusert betydelig i RB og Akba grupper sammenlignet med bærerkontrollgruppen (p 0,001). Inhiberingsgraden av tumorvekt av RB og Akba gruppene var 49,60% og 30,01%, henholdsvis. TUNEL-farging viste at, i motsetning til tumorvev mottok bæremiddel, et økende antall TUNEL-fargede positive apoptotiske celler ble sett i tumorvev fra RB eller Akba-behandlede mus (figur 6D, høyre panel). Disse apoptotiske celler ble anerkjent i hele delen av tumor saker behandlet med kjemikalier. Histologisk H gjennomsnitt ± SD; p 0,05 (*), p 0,01 (**), p 0,001 (***) versus medium kontrollgruppen, henholdsvis. (C) Representative svulster fra de tre grupper er vist. (D) H E og TUNEL-avhengig farging av RM-1 tumor vevssnitt. (Scale bar, 100 mikrometer). (E) Western blot-analyse av p-p65, PARP, Bax, Bcl-2 og Bcl-x
L-ekspresjon i tumor 2 vevsprøver ble behandlet med medium, 4 prøver med RB og 2 prøver med AKBA. (F) Immunofluorescens for p-p65-analyse av tumorvev. (Scale bar, 100 mikrometer).
For å få innsikt i mekanistiske grunnlaget for RB sin antitumor aktivitet, undersøkte vi uttrykket status av ulike proteiner assosiert med apoptose og spesielt aktivering av NF-kB i målet vev. Som vist i figur 6E, RB produsert en dyp inhibering av PARP, Bcl-2 og Bcl-xL uttrykk i tumorvev fra behandlede mus grupper, mens forårsaket en slående økning i ekspresjonen av Bax, i overensstemmelse med resultatene i kulturceller. Spesielt, levert RB i mus trykkes aktivering av NF-kB, som vist ved reduksjon av fosfor-p65-ekspresjon i tumorvev sammenlignet med bærerkontrollgruppene. Immunofluorescens-analyse av tumor seksjoner for fosfo-p65 viste at, i likhet med virkningen av AKBA, RB særlig hemmet fosforylering og lokalisering av p65
in situ
(figur 6F). Sammen dataene viste at RB som utøves antitumoraktivitet mot PCA homografts i C57BL /6 mus, ved inaktivering av NF-kB signalering og induksjon av apoptose.
diskusjon
RB, et medlem av naturlig pentacyclic trieroenic syrer, har nylig blitt vunnet vår oppmerksomhet for sitt potensial antitumor aktivitet ved PCA [10].
i denne studien fant vi at RB var en potent hemmer av NF-kB i PCA celler. For det første, RB hemmet fosforylering av p65 på Ser-536
in vitro Hotell og
in vivo
. For det andre, RB hemmet IκBα fosforylering og degradering, til slutt fører til inhibering av nukleær translokasjon og DNA-bindende aktivitet av p65. Den hemmende effekt på NF-kB aktivitet ved RB ble også reflektert av den reduserte uttrykk for NF-kB-avhengige gener som
BCL-2, BCL-x
L, cyclin D1, etter og
survivin
, og den endelige konsekvens av hemmingen av NF-kB i PCA-celler. Overekspresjon og knockdown eksperimenter understøttet observasjonene at reduksjonen av p65 ved RB var avgjørende i sin apoptotisk modulasjon. I tillegg til PCA-celler, ble undertrykkelse av NF-kB-aktivering av RB observert i andre forskjellige kreftcellelinjer, inkludert myeloid leukemi celler (K562, AO2), og lever hepatocellulære celler (HepG2), noe som indikerer at inaktivering av NF-kB av RB er en generell mekanisme for sin antitumoraktivitet.
Som kjent mekanismen for NF-kB-aktivering i celler for stimulering er primært avhengig fosforylering og ubiquitinering av de inhiberende proteiner IκBs og påfølgende underkastet for nedbrytning av 26S proteasomer. Vi fant at RB hadde ingen effekt på aktiviteten av 20S proteasomet, noe som tyder på at inhibering av IkB nedbrytning og inaktivering av NF-kB p65 av RB var hovedsakelig på grunn av et trinn på oppstrømsiden av IκBα fosforylering. Den klassiske regulering mønster er inhibisjon av IKK-aktivitet, noe som i sin tur fører til reduksjon av fosfor-IκBα. Enten IKK er direkte mål for RB og inaktivering av IKK av RB er avgjørende for dens hemmende effekt på IKB /NF-kB er ikke avklart i det videre arbeidet. I tillegg til klassiske NF-kB, ble RB ikke forandre ekspresjonen av p50 og P52 i PCA-celler (data ikke vist), noe som tyder på at den nonclassical NF-kB reaksjonsvei er ikke avgjørende i RB-mediert celledød.
som forventet, i denne studie har vi funnet var aktivitetsmønster modulering av RB-lik den til andre naturlige pentacyclic triterpenic syrer. AKBA, ursolic syre og betulinsyre direkte eller indirekte kontakt med IKK og inhiberer NF-kB-signalering [12], [13], [14]. Denne biologiske egenskap er observert i en rekke forskjellige cellelinjer, inkludert human PCa (PC3 og DU145), human leukemi (Jurkat-celler), human embryonisk nyre (293 celler), human myelogen leukemi (KBM-5), human ikke-liten celle lunge karsinom (H1299), og human histiocytisk lymfom (U937), tarmkreft (HCT116 og Caco2) og kreft i bukspyttkjertelen (PANC-28) [12], [13], [14], [15], [16], [17]; Disse funnene tyder på at naturlige pentacyclic triterpenic syrer kan være brede inhibitorer av NF-kB-aktivering.
ser imidlertid ut til undertrykkelse av enkelte genprodukter av pentacyclic triterpenic syrer for å være selektiv Våre data viser at VEGF og COX-2-uttrykk forble uforandret i PC3-celler eksponert for RB (data ikke vist). Andre gruppers studier har rapportert at AKBA undertrykker VEGF-ekspresjon i plasmacytom U266-celler [18], og inhiberer COX-2-mRNA-ekspresjon indusert av TNF i KBM-5-celler [19]. I samsvar med AKBA, ursolic syre og betulinsyre utløser også reduksjon av VEGF og COX-2 nivå i andre cellelinjer, inkludert human leukemi-cellelinje Jurkat, human epitelcellelinje HCT116, lungecancer cellelinjer A549, H3255 og Calu-6, menneskelig PCa cellelinje PC3, menneskelige tykktarmskreftcellelinjer RKO og SW480. [13], [14], [20], [21]. Virkningene av plantebaserte pentacyclic triterpenic syrer på NF-kB signalveien kan varieres på grunn av de forskjellige substituerte gruppene i pentacyclic triterpenes, og /eller celletype avhengig.
Til sammen våre funn tyder på at RB fremmer apoptose gjennom undertrykkelse av NF-kB aktivering og NF-kB-avhengige antiapoptotic genuttrykk i PCA celler og dyremodeller, og NF-kB signalveien er et viktig molekylære mål for anticancer aktivitet av RB.
Materialer og Metoder
Kjemi
Retigeric syre B (RB) ble isolert fra lav
L. kurokawae
, og dets renhet og strukturbestemmelse ble tidligere beskrevet [22]. Acetyl-11-keto-β-boswellic syre (AKBA) ble isolert og renset ved reversfase-væskekromatografi med høy ytelse som tidligere beskrevet [22]. Forbindelsene ble løst i dimetylsulfoksid (DMSO) ved 10 mM stamløsninger som er lagret ved -20 ° C og fortynnet i henhold til forsøks krav når det brukes. For anvendelse av RB i homoimplantat modellene vi utviklet et oppløsningsmiddelsystem som består av fysiologisk saltvann /DMSO /etanol /tween 80 (75:10:10:5, v /v).
Cellekultur og Homografts
Menneske PCa LNCaP (The American Type Culture Collection, Rockville, MD), PC3, DU145 cellene, og muse-PCA RM-1 celler (The Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai) ble dyrket i RPMI 1640 medium (HyClone) supplert med 10% FBS (HyClone). Humane lunge adenokarsinom A549-celler ble dyrket i Hams /F-12 (HyClone) supplert med 10% FBS (HyClone). Humane leverceller hepatocellulære HepG2, humane ovarie kreftceller SKOV3, human myeloid leukemicellelinje K562 og adriamycin-resistent K562 /AO2, ble dyrket i RPMI 1640 medium (HyClone) supplert med 10% FBS (HyClone).
RM-1-celler fra C57BL mus prostatatumorer er androgen-uavhengige og kan transplanteres inn i syngeniske mus for å rekonstituere homotransplantation, som er egnet modell for å simulere humane PCa.
