Abstract
Bakgrunn
Fordi noen definitive markører er tilgjengelig for leverkreft stamceller (HCSCs), basert på fysisk snarere enn immunkjemiske egenskaper, søkte vi en ny metode for å berike HCSCs.
metodikk
Etter levertumorceller (HTCs) ble først isolert fra diethylinitrosamine indusert F344 rotte HCC modellen ved hjelp av Percoll diskontinuerlige gradient sentrifugering (PDGC) og renset via differensial trypsinering og differensial vedlegg (DTDA), ble de delt inn i fire fraksjoner ved hjelp av Percoll kontinuerlig gradient sentrifugering (PCGC) og sekvensielt utpekt som fraksjoner i-IV (FI -IV). Morfologiske egenskaper, mRNA og proteinnivåer av stamcellemarkører, proliferative evner, indusert differensiering,
in vitro
trekkende kapasiteter,
in vitro
chemo-motstandsdyktig kapasiteter, og
in vivo
maligne kapasiteter ble bestemt for cellene i hver fraksjon.
Funn
Som tettheten av celler økt, 22,18%, 11,62%, 4,73% og 61,47% av primære dyrkede HTCs ble segregert i FI-FIV, respektivt. Cellene fra FIII (densitet mellom 1,041 og 1,062 g /ml) viste en høyere nukleær-cytoplasma-forhold og færre organeller og uttrykte høye nivåer av stamcelle markører (AFP, EpCAM og CD133) enn celler fra andre fraksjoner (
P
0,01). I tillegg
in vitro
, cellene fra FIII viste en større evne til å fornye seg selv, differensieres til modne HTCs, transitt over membraner, nær riper, og bære motstand mot kjemoterapi enn gjorde celler fra en annen fraksjon;
in vivo
, injeksjon av kun 1 × 10
4 celler fra FIII kunne generere svulster ikke bare i subcutaneous vev, men også i leveren hos nakne mus.
Konklusjoner
Gjennom vår ny metode, ble HCSC-lignende celler klart å anrike i FIII. Denne studien vil i stor grad bidra til to viktige områder av biologisk interesse:. CSC isolasjon og HCC terapi
Citation: Liu W-h, Wang X, Du N, Tao K-s, Wang T, Tang L-j, et al. (2012) Effektiv Anriking av lever Cancer Stem-lignende celler fra en primær Rat HCC Modell via en Densitetsgradientsentrifugering-sentrert metode. PLoS ONE 7 (4): e35720. doi: 10,1371 /journal.pone.0035720
Redaktør: Kwan Man, The University of Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 03.02.2012; Godkjent: 20 mars 2012; Publisert: 25 april 2012
Copyright: © 2012 Liu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Natural Science Foundation National of China (No. 81170419, 81172061, 8100309). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i løpet av det siste tiåret, forestillingen om at svulster blir vedlikeholdt av sine egne stamceller, de såkalte kreftstamceller (cscs), har skapt stor spenning i forskningsmiljøet [1]. Cscs er generelt sovende eller sakte sykling kreftceller som har evnen til å rekonstituere svulster [1]. De antas å være involvert i tumor motstand mot kjemoterapi /strålebehandling og tumor tilbakefall og progresjon. Cscs er viktige fordi de er ansvarlige for resistens mot behandlingen. Innhenting ytterligere forståelse av CSC-spesifikke egenskaper vil gi innsikt om de tidlige stadier av tumordannelse for å hjelpe i å hindre dette fenomen og å forbedre selektiviteten for antitumorterapi. Eksistensen av cscs ble først foreslått over 40 år siden [2]; men de var bare nylig isolert fra faste tumorer, inkludert tumorer i bryst [3], prostata [4], hjerne [5] og tykktarm [6]. Selv cscs har blitt isolert fra noen typer svulster, det er mye debatt rundt dette temaet.
leverkreft (HCC) er en svært ondartet type solid tumor assosiert med hyppig metastaser og dårlig prognose [7]. Isolerte lever cscs (HCSCs) representerer et egnet
in vitro
modell for utvikling av terapeutiske strategier som tar sikte på å utrydde tumorigent undergruppe innen HCC. Det er av denne grunn at identifisering og forståelse av HCSCs er avgjørende. For å isolere HCSCs, en rekke separasjonsteknikker er tilgjengelige. En vanlig metode for å isolere cscs har vært å karakterisere sin celle-overflate fenotype og bruke markører for å negativt eller positivt velge for bestemte celler. Det er rapportert levertumorceller (HTCs) med CD133 + eller EpCAM + fenotype ha stilk-lignende egenskaper [8]; men de har vist seg å oppvise begrensede plastisitet. I dag er en spesifikk markør for isolering av HCSCs fremdeles kontroversiell. En alternativ metode for å isolere HCSCs er stort behov for. En annen fremgangsmåte for CSC separering er basert på differensial effluks av fluorescerende fargestoffer, slik som rhodamin 123 eller Hoechst 33342. I det siste har isolering av side populasjon (SP) celler ved anvendelse av Hoechst 33342 fargestoff blitt et nyttig fremgangsmåte for å oppnå cscs fra forskjellige tumorer. I en tidligere studie av vår gruppe, beriket vi HCSCs fra MHCC97 cellelinje basert på utstrømningen av rhodamine 123 eller Hoechst 33342 [9]. Det er imidlertid fremdeles noen begrensninger forbundet med denne metode, som for eksempel detektering av falske positive stamceller og behovet for spesielle instrumenter. Det siste alternativet for isolering av cscs er basert på fysiske separasjonsmetoder, som f.eks densitetsgradient separasjon. I en tidligere studie, vi får isolerte føtale lever stilk /stamceller (FLSPCs) fra primær dyrkede føtale leverceller via tetthet-gradientsentrifugering sentrert på en tre-trinns metode [10].
I denne studien, vi forsøkte å finne ut om HCSCs kan oppnås ved å utnytte sine fysiske egenskaper. For dette formålet, søkte vi vår etablerte tre-trinns metoden med en liten justering for å isolere HCSCs fra primær HTCs. De HTCs ble først isolert ved hjelp av Percoll diskontinuerlig gradient sentrifugering (PDGC), deretter renset på grunnlag av differensial trypsinering og differensial tilslutning (DTDA), og til slutt lagdelte av Percoll-kontinuerlig gradient sentrifugering (PCGC). HTCs ble dermed delt inn i fire delpopulasjoner. Den tredje undergruppe, som inneholdt færrest celler, med en tetthet varierer mellom 1,041 og 1,062 g /ml, viste det høyeste uttrykk for stamcellemarkører, størst evne til å spre seg og danne kolonier
in vitro
, størst kapasitet til å migrere
in vitro
, den sterkeste kapasiteten å være motstandsdyktig mot kjemoterapi, og det rikeste evne til å generere tumorer i NOD /SCID-mus. Alle disse resultatene indikerte at befolkningen fra det tredje laget av PCGC gradienter besatt CSC egenskaper. Denne nye strategien for å isolere HCSCs vil gjøre store bidrag i to hovedområder: det vil gi ny innsikt knyttet til isolering av andre typer cscs; og det vil gi oss mulighet til å undersøke bidraget fra HCSCs til HCC.
Materialer og metoder
1 Prosedyre for å skille HTCs
1.1 Bygging av HCC modell av diethylnitrosamine (DEN ) induksjon.
tolv mannlige Fisher 344 rotter (National gnager Laboratory Animal Resource, Shanghai, Kina) i rettssaken gruppen ble behandlet med 0,05% dEN (Sigma Co, NY, USA) i drikkevannet i 6 uker og ble deretter byttet til vanlig drikkevann [11]. En annen tolv hann Fisher 344 rotter i kontrollgruppen ble gitt en normal diett. Ved 10, 14 og 18 uker etter DEN induksjon, ble fire rotter fra hver gruppe avlivet. Prøver av levervev fra hver gruppe ble rutinemessig behandlet og farget med hematoxylin og eosin (H E) for histologisk undersøkelse. Alle dyreforsøk ble utført strengt i henhold til dyr studieprotokoller [12] og godkjent av Forsknings Animal Care og bruk komité på fjerde Military Medical University.
1.2 Identifikasjon av HCC ved immunhistokjemi.
for ytterligere å identifisere hvilken type leversvulster som skjedde i rottene, ble uttrykket nivåer av AFP og CK19 undersøkt immunohistochemically. Parafininnstøpte snitt ble avvokset ved hjelp av xylen og en etanolkonsentrasjon serie, blokkert med 20% geiteserum og farget med et primært kanin-anti-rotte-AFP eller CK-19-antistoff (fortynning 1:200, Santa Cruz, CA). Geite-anti-kanin-IgG sekundære antistoffer ble brukt til farging av AFP eller CK-19. Disse snitt ble også motfarget med 2- (4-diamidinophenyl) -6-indolecarbamidine dihydroklorid (DAPI) (fortynning 1:100; Sigma) for å detektere kjerner. Negative kontroller ble farget uten primære antistoffer. Fargete snitt ble undersøkt under et fluorescerende mikroskop (FV1000MPE, Olympus Corporation, Tokyo, Japan). De positive priser for AFP og CK-19 ble bestemt i alle seksjoner.
1.3 Isolering av HTCs av PDGC.
Individuelle HCC knuter ble fjernet fra hver rotte i rettssaken gruppen. Rå HTCs ble isolert i henhold til Hohne et al. [13] med mindre modifikasjoner. Kort sagt ble de HCC knuter kvernet i Williams E medium (Sigma Co., Louis, MO, USA) med 0,1% kollagenase type IV og 0,005% trypsin (Sigma Co., Louis, MO, USA) og deretter inkubert i 20 minutter ved 37 ° C i et ryste-vannbad. Etter inkubering ble de frigitte cellesupernatantene ført gjennom en 100 pm nylonnett og sentrifugert ved 1000 x g i 8 min. Pelletene ble vasket to ganger med fosfat-bufret saltvann (PBS) (Invitrogen Co., USA) for å oppnå rå HTCs. Disse rå HTCs ble fremstilt som enkeltcellesuspensjoner og separert i forskjellige fraksjoner ved hjelp av PDGC (30%, 50% og 70% Percoll). Cellene i grenseflaten på 30% og 50% Percoll ble oppsamlet og dyrket i 6-brønners plater inneholdende Williams E medium supplert med 10% volum /volum føtalt bovint serum (Invitrogen Co., USA), 5 ug /ml insulin (Sigma Co. , Louis, MO, USA), 5 uM hydrokortison, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2. Når heftende celler utvidet som et enkeltlag koloni 20 dager senere, samlet vi de monoklonale celler ved lokal oppslutning med kloning sylindere og overført dem til en ny kultur rett til å fortsette dyrking prosessen.
1.4 Rensing av HTCs av DTDA .
For å få rene HTCs ble cellene i kultur behandlet som følger. Basert på resultatene av en tidligere studie av vår gruppe [10], kan celler av forskjellige størrelser bli trypsinert innenfor forskjellige tidsperioder. Det har blitt funnet når cellene blir spaltet ved hjelp av 0,25% trypsin i 10 minutter, er meget store celler trypsinert og utelukket, mens andre celler gjenstår. Denne metode er referert til som «differensiell trypsinering». Interessant, når cellene ble fullstendig trypsinisert for subdyrking over en periode på 120 min, store celler ikke holder seg til platene og ble lett fjernes. Dette fenomenet er referert til som «differensiell tilslutning». HTCs ble renset via disse to stepsHTCs.
1,5 Separasjon av HTCs av PCGC.
Protokollen ble utført i henhold til metodene i vår tidligere studie [10]. I korthet, for å lage kontinuerlige gradienter, ble en 40% Percoll-løsning sentrifugert ved 20.000 x g i 90 minutter ved hjelp av en vinkelhodet rotor. Røret ble deretter tillatt å stå i 30 minutter, og cellesuspensjonen ble forsiktig lagt på toppen av de på forhånd dannede gradienter. Røret inneholdende cellene ble sentrifugert ved 500 x g i 15 min ved hjelp av en svingende spannrotor. Fra toppen til bunnen av røret, slik at celletettheter kontinuerlig økes, samlet vi fire cellefraksjoner og betegnet dem fraksjonene I-IV (FI-IV) (figur 1A).
(A) Små tumorer (svarte piler) ble forårsaket av 10 uker DEN induksjon. (B) Leveren var blitt nesten fullstendig erstattet av store tumorer 18 uker etter induksjon DEN. (C) Lav forstørrelse visning av en H E-fargede delen fra svulstvev. (D) Høy forstørrelse visning av en H E-fargede delen. (E) Lav forstørrelse visning av en AFP-farget delen. (F) Høy forstørrelse visning av en AFP-farget delen. (G) Lav forstørrelse visning av en CK-19-farget delen. (H) Høy forstørrelse visning av en CK-19-farget delen. (I, J) Bilder av primære dyrkede HTCs. (K, L) Bilder av HTCs renset ved DTDA. Originale forstørrelser: 100 × (C, I-L), 200 × (D, E, G), 400 × (F, H)
2 Morfologisk sammenlikning mellom de forskjellige fraksjonene
.
2,1 Transmisjonselektronmikroskopi elektron~~POS=TRUNC mikros~~POS=TRUNC (TEM).
nyisolerte celler fra hver fraksjon ble fiksert med 2,5% glutaraldehyd ved 4 ° C i 4 timer, deretter skylt med kald PBS og fiksert i ytterligere 1% osmium tetroksyd ved romtemperatur i 2 timer. Prøvene ble først dehydrert ved anvendelse av en gradient av etanol og aceton, deretter innleiret i Epon812 harpiks og aceton (v /v, 01:01) i 30 minutter, etterfulgt av 100% Epon812 harpiks i 1 time. Den Epon812 Harpiksen ble gjort fast ved 37 ° C i 24 timer og ved 60 ° C i 48 timer. Ultratynne seksjoner ble utarbeidet etter en LKB ultramicrotome (Ultrotome NOVA, LKB, Broma, Sverige) og farget med uranylacetat og føre citrate for undersøkelse av TEM (JEM-2000Ex, JEOL Ltd., Japan)
2,2 immunfluorescens. (IF) farging med phalloidin.
For ytterligere å analysere morfologiske forskjeller mellom ferskt isolerte celler fra hver fraksjon ble phalloidin farging brukt. Cellene ble først behandlet med et primært phalloidin antistoff (fortynning 1:100, Santa Cruz, CA), og deretter med et fluorescerende FITC-konjugert geite-anti-kanin-sekundært antistoff (fortynning 1:100, Santa Cruz, CA) i 2 timer. Brutto morfologi av cellene ble observert under et fluorescens mikroskop, og antall flimmerhårene og pseudopodia ble beregnet.
3 Sammenligning av markører mellom ulike fraksjoner
3,1 Flowcytometri (FCM).
nyisolerte celler fra hver fraksjon ble fremstilt ved en konsentrasjon på 10
6cells /ml ved hjelp av Williams E medium (inneholdende 20% FBS) og inkubert i 15-30 minutter ved romtemperatur for å blokkere ikke-spesifikk nettsteder. Disse cellene ble deretter vasket to ganger med PBS og resuspendert i 990 ul PBS. Deretter ble 10 ul av antistoffer, inkludert CD133 (PE-konjugert, Biolegend, USA) og EpCAM (FITC-konjugert, Biolegend, USA), ble tilsatt til hver cellesuspensjon. Etter 30 minutters inkubering ved 4 ° C i mørke, ble cellene vasket to ganger med PBS, fiksert i 0,1% formaldehyd og analysert ved anvendelse av FACSCaliburTM systemet (BD Immunocytometry Systems, San Jose, CA).
3.2 IF-analyse.
etter at de nylig isolerte celler fra hver fraksjon klebet til en kultur lysbilde, ble de vasket to ganger med PBS, fiksert med 4% paraformaldehyd i 20 minutter, og nedsenket i PBS i 10 minutter, etterfulgt av eksponering 0,01% Triton X-100 ved romtemperatur i 10 min. Cellene ble behandlet med 6% geiteserum (Santa Cruz, CA) ved romtemperatur i 30 minutter for å blokkere ikke-spesifikke immunreaksjoner og deretter med primær CD133 (fortynning 1:200, Santa Cruz, CA), AFP (fortynning 1: 200, Santa Cruz, California) og CK-19 (fortynning 1:200, Santa Cruz, California) antistoffer ved 4 ° C over natten. Etter at prøvene ble vasket to ganger med PBS, ble de inkubert med fluorescerende PE /FITC-konjugert geite-anti-kanin sekundære antistoffer (fortynning 1:100, Santa Cruz, CA) i 2 timer. Deretter ble prøvene behandlet med DAPI (fortynning 1:100; Sigma) i 15 min. Fluorescensen av prøvene ble observert ved bruk av et fluorescens mikroskop (FV1000MPE, Olympus Co., Tokyo, Japan).
3,3 Kvantitativ sanntids-polymerase kjedereaksjon (QRT-PCR).
Total RNA ble hentet fra de nylig isolerte celler av hver fraksjon som bruker TRIzol reagens (Molecular Research Center, Cincinnati, OH) og revers transkribert til cDNA med Superscript II revers transkriptase henhold til produsentens instruksjoner (Invitrogen, Carlsbad, California). En like stor mengde av cDNA fra hver prøve ble amplifisert med spesifikke primere (tabell 1). PCR ble utført ved hjelp av SYBR Grønn Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) over 40 sykluser. Syklusparametrene for PCR var 10 minutter ved 95 ° C, 15 sekunder ved 95 ° C, og 30 sekunder ved 60 ° C, med et avsluttende dissosiasjon trinn i 15 sekunder ved 95 ° C, 20 sekunder ved 60 ° C, og 15 sekunder ved 95 ° C ved hjelp av Bio-Rad MyIQ5 real-time PCR-system (Bio-Rad, California, USA). Hver prøve ble analysert i triplikat. mRNA-nivåer ble normalisert ved hjelp av GAPDH som en intern referanse.
4 Den induserte differensiering av hepatocytt-vekstfaktor (HGF)
Alle cellene fra hver fraksjon ble separat dyrket i kommersiell serum- fritt medium (Sigma Co., Louis, MO, USA) supplert med HGF i en konsentrasjon på 20 ng /ml. Etter at alle cellene i 96-brønners plater (1 x 10
3 celler /brønn) ble dyrket i 14 d, ble de samlet og nøyaktig identifikasjon ble utført som følger. Differensieringen ble evaluert ved å påvise uttrykk for cscs spesifikk markør CD133 til FCM og HCC markør AFP ved IF. De detaljerte protokoller var som beskrevet ovenfor.
5 Funksjonell sammenligning mellom forskjellige fraksjoner
5,1 3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl) -2, 5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) analysen.
de proliferative evner av ferskt isolerte celler fra hver fraksjon ble bestemt ved hjelp av MTT analysen. I korthet ble cellene dyrket i 96-brønners plater i en tetthet på 1 x 10
3 celler /brønn. På 2, 4, 6, 8, 10, 12 og 14 dagers dyrking, MTT (Sigma, St. Louis, MO, USA) oppløst i PBS ble tilsatt til hver brønn til en sluttkonsentrasjon på 5 mg /ml, og den prøvene ble inkubert ved 37 ° C i 4 timer. Vann-uløselig mørk blå formazankrystaller som dannes ved spalting i MTT aktivt metaboliserende celler ble deretter oppløst i dimetylsulfoksyd (DMSO) (Gibco /Invitrogen, NY, USA). Den optiske tetthet ble målt ved en bølgelengde på 490 nm med et Bio-Rad 680 mikroplateleser (Bio-Rad, California, USA).
5,2 Colony formasjonstest.
Den ferske isolerte celler fra hver fraksjon ble inokulert separat i hver brønn (10 celler per brønn) i 96-brønners plater (Corning Life Sciences, Acton, MA) supplert med 100-200 pl av Williams E medium pluss leukemi-inhiberende faktor (LIF) ved en konsentrasjon på 10 ug /ml. Cellelevedyktigheten ble vurdert gjennom farging med trypanblått (Sigma-Aldrich) ved flere tidspunkter. Etter 4 ukers dyrkning ble hver brønn undersøkt ved hjelp av lysmikroskopi, og det totale antall av cellekolonier ble tellet. Bilder av koloniene ble registrert ved hjelp av et mikroskop (Nikon Eclipse TS100, Nikon, Kingston-upon-Thames, UK) og et digitalt kamera (C4742-95, Hamamatsu Photonics, Welwyn Garden City, Hertfordshire, UK) under fase kontrastforhold.
5.3 Transwell migrasjon analysen.
Det er totalt 1 × 10
5 celler i 0,5 ml serum-free Williams «E medium fra hver fraksjon ble sådd på en 8-mikrometer pore- størrelse polykarbonatmembran Boyden kammer er satt inn i en transwell apparat (Costar, Cambridge, MA) belagt med Matrigel. Totalt 600 ul av Williams «E medium inneholdende 20% FBS ble tilsatt til det nedre kammer. Etter inkubering i 24 timer ved 37 ° C i en 5% CO
2 inkubator, ble cellene på den øvre overflate av innsatsen fjernes ved å gni med en bomullspinne. Cellene som hadde migrert til den nedre overflate av innsatsen ble fiksert i 100% metanol i 2 minutter, beiset i 0,5% krystallfiolett i 2 minutter, skylt i PBS og utsatt for inspeksjon via mikroskopi. Verdier for invasjon og migrasjon ble oppnådd ved å telle under en invertert lysmikroskop (Olympus Corporation, Tokyo, Japan) i 5 tilfeldig utvalgte felt.
5.4
In vitro
scratch analysen.
Hver brønn i 24-brønners vevskulturplater ble podet med cellene til en endelig tetthet på 100.000 celler per brønn, og disse cellene ble holdt ved 37 ° C under 5% CO
2 i 24 timer for å tillate dem å følge og for å danne konfluent monolag. Disse konfluente monolag ble deretter scoret med en steril pipette tips til å forlate en ripe på ca 0,4-0,5 mm i bredden. Dyrkningsmediet ble deretter umiddelbart fjernet (sammen med eventuelle løsrevne celler). Den fjernede medium ble erstattet med friskt Williams E medium. Alle skrape analyser ble utført i tre eksemplarer. Scratch lukke ble overvåket ved oppsamling av digitale bilder ved begynnelsen av forsøket og med jevne mellomrom under prosessen av cellemigrering for å lukke bunnen, og bildene ble sammenlignet for å kvantifisere migrasjonsrate av cellene. Digitale bilder ble tatt med en invertert mikroskop (Nikon Eclipse TS100, Nikon, Kingston-upon-Thames, UK) og et digitalt kamera (C4742-95, Hamamatsu Photonics, Welwyn Garden City, Hertfordshire, UK) under fase.
5,5 kjemoterapeutiske eksperiment.
For å bekrefte
in vitro
chemo-motstand, 1,5 × 10
5 celler fra hver fraksjon ble belagt i 24-brønners plater og behandlet med paclitaxel (10 ng /ml) i 24 timer. Den optimale dose av paclitaxel anvendt i denne studien ble tatt i bruk i henhold til våre foreløpige eksperimenter. En Annexin V-FITC /PI apoptose deteksjonssett (Annexin V-FITC /PI Farging Kit; Immunotech Co., Marseille, Frankrike) ble anvendt for påvisning av celle apoptose. I korthet ble cellene behandlet med paclitaxel oppsamlet, vasket i kald PBS, inkubert i 15 minutter med fluorescein-konjugert annexin V og PI i henhold til produsentens protokoller, og analysert ved hjelp av FCM.
5,6 Svulstdannelse i NOD /SCID-mus.
tretti~~POS=TRUNC seks~~POS=HEADCOMP mannlige NOD /SCID-mus (6-8 uker gamle) hentet fra forsøksdyr sentrum av Beijing Xiehe Medical University (Beijing, Kina) ble opprettholdt i patogen begrenset forholdene på dyret ressurser midten av fjerde Military Medical University (Xi’an, Kina). Disse mus ble tilfeldig delt inn i seks grupper: F0, FI, FII, FIII FIV, og styre HeG2 cellelinje. Således ble hver gruppe tilført med 6 mus. Cellene ble injisert i NOD /SCID-mus ved subkutan injeksjon i forskjellige mengder (1 x 10
5 og 1 x 10
4). Tumorvekst ble overvåket hver 2 dager etter den andre uken av vaksinasjon. Alle mus ble avlivet 60 dager etter injeksjon. Alle av de resulterende tumorvev ble oppsamlet, fiksert i 4% formaldehyd, og innstøpt i parafin for H E farging for å vurdere tumorhistologi. Tumorene ble klassifisert i henhold til deres størrelse. Eksistensen av ingen makroskopisk tumor ble definert som negativ (-); en svulst diameter på 0,2 cm som positive (+); en diameter på 0,2-0,5 cm som moderat positiv (++); og en diameter på 0,5 cm som sterkt positiv (+++)
6 Statistisk analyse
SPSS 14.0 programmet ble brukt for alle statistiske evalueringer.. Alle data er uttrykt som middel ± standard feil av separate forsøk (n≥3, hvor n representerer antallet uavhengige eksperimenter). Dataene ble analysert for statistisk signifikans ved hjelp av en enveis ANOVA.
P
. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
1 HCC dannelse og HTCs isolasjon
Når ble rottene avlivet 10 uker etter DEN induksjon , bare små tumorer ble funnet (figur 1A). Ved 18 uker etter induksjon DEN har de fleste av levervevet av rottene var blitt erstattet med tumorvev med ru overflater (figur 1B). Basert på vurderinger av tre uavhengige patologer, H E farging bekreftet at svulstene var alle leverkreft avledet (figur 1C, D). For ytterligere å identifisere hvilken type av svulstene, valgte vi en markør for HCC (AFP) og en annen markør for kolangiokarsinom (CK-19) å farge vevssnitt fra samme svulster. Mesteparten av tumorcellene innenfor tumorknuter farget positivt for AFP (68,7 ± 6,21%) (figur 1E, F). I motsetning til dette ble det nesten ingen celler som farget positivt for CK-19 funnet i et stort område (1,12 ± 0,13%) (figur 1 G, H). Oppsummert svulstene farget positivt for AFP og negativt for CK-19. Dette funn tyder på at disse tumorene var nesten hepatisk opprinnelse, som er i samsvar med resultatene fra H derfor i denne studien, søkte vi denne metoden for å fraksjonere HTCs. Under disse betingelser, i henhold til fordelingen av cellepellets, delt vi den HTCs populasjonen (F0) i fire fraksjoner (fraksjon I-IV, FI-IV). Basert på overvåking av Tetthet Marker perler, ble fire cellefraksjoner forsiktig fjernet enkeltvis fra røret, fra toppen til bunnen (figur 2A). Celletelling viste at 22,18 ± 2,13% 11,62 ± 1,06% 4,73 ± 0,38% og 61,47 ± 6,24% av cellene ble segregert i FI-FIV, henholdsvis, noe som betyr at FIV inneholdt de fleste celler, og færrest-celler (mindre enn 5% celler) ble funnet i FIII (figur 2A). Basert på dot-plot-histogrammer oppnådd fra FACS, før separering, ble cellene i F0 var heterogene i størrelse, mens etter separasjon, størrelsen av cellene i hver fraksjon ble noe mer homogen. Som forventet, FCM analyse av hver undergruppe viste en økning i celledetalj [FSC (forover scatter) /SSC (side scatter)] med økende Percoll tetthet (figur 2B). Således, fra FI til FIV, cellene stadig økt i størrelse.
(A) Skjematisk illustrasjon av den kontinuerlige Percoll-gradienten anvendt for fraksjonering og prosentandelene av cellene adskilt i hver fraksjon. (B) Dot-plottet histogrammer som følge av FACS-analyse som viser tettheten av cellene i hver fraksjon. (C) Lysmikroskopi av celler fra hver fraksjon under fase. (D) TEM-bilder og diametrene av celler fra hver fraksjon. (E) Bilder av cellen farget av phalloidin reflektere de ulike morfologi av celleoverflater. Originale forstørrelser: 100 × (C), 6000 × (D), 400 × (E)
3 Morfologisk sammenligning av celler fra FI-FIV
Cellene fra hver fraksjon. ble dyrket separat i Williams E-medium. Cellene fra FIII var de første til å følge plater, som fant sted i løpet av mindre enn to timer, etterfulgt av cellene fra FI og FII i 2,5 timer, og cellene fra FIV og F0, som krevde mer enn 3 timer. Under
in vitro
dyrkningsforhold, kan de heterogent store celler i F0 lett observeres. Etter separering, ble det funnet at cellene fra FI og FII var den minste, etterfulgt av FIII, og cellene fra FIV var de største (figur 2C).
TEM-bilder som vises tilsvarende fenomener som observeres i resultatene som ble oppnådd via lysmikroskopi. De F0 celler oppviste en stor variasjon av diametre, som strekker seg fra 6 um til 30 um (figur 2D). Diameterne på celler fra FI og FII var den minste, etterfulgt av FIII, og diametrene av celler fra FIV var de største (figur 2D). Samtidig cellene fra FIII presenteres den høyeste atom cytoplasma ratio og færrest organeller; i motsetning til dette celler fra FIV viste den laveste atom cytoplasma-forhold, og de fleste organeller (figur 2D). Dette indikerte at cellene fra FIII var den mest umodne.
I tillegg har vi farget celler fra hver fraksjon hjelp phalloidin. Under fluorescens mikroskopi, celler av FIII ble litt mer brightly farget av phalloidin og vises flere flimmerhårene eller pseudopodia på deres overflater enn gjorde cellene i noen annen fraksjon (figur 2E). Men den statistiske analysen indikerte forskjellen var ikke signifikant (
P
0,05).
4 Uttrykk for stamcellemarkører
For å bestemme stilk egenskapene til cellene i hver fraksjon, to relativt allment akseptert stamcellemarkører ble oppdaget av FCM umiddelbart etter separasjon. Både EpCAM og CD133 ble de sterkt uttrykt i de nylig isolerte celler fra FIII sammenlignet med de andre fraksjoner (
P
0,01) (figur 3A, C). Prosentandelen av EpCAM-positive celler i FIII var så høy som 81,5 ± 7,96%, og andelen av CD133-positive celler var enda høyere, ved 84,7 ± 8,53%. I motsetning til ekspresjonen av begge stilk cellemarkører i nyisolerte celler fra FIV var lavest.: 7,1% ± 0,64% for EpCAM og 5,7% ± 0,63% for CD133 (figur 3A, C)
(A) uttrykk for stamcellemarkører (EpCAM og CD133) i hver fraksjon bestemmes av FCM. (B) Basert på IF, CD133-positive celler (røde, kjerner i blått) og AFP og CK-19-positive celler (grønn, kjerner i blått) ble funnet å være med i forskjellige proporsjoner. (C) Kolonne diagrammet gjenspeiler data innhentet via FCM. (D) Kolonne diagrammet gjenspeiler data generert av IF. (E) QRT-PCR resultatene av spesifikke markører i nylig isolerte celler fra hver fraksjon. F0 representerer fraksjonerte HTCs; FI-IV indikerer fraksjoner I-IV etter separasjon. * Refererer til
P
0,01 sammenlignet med alle andre fraksjonen. Original forstørrelse. 100 × (B)
For ytterligere å identifisere stilk egenskapene til celler fra hver fraksjon, vi har oppdaget uttrykk for CD133 bruker IF. Prosentandelen av CD133-positive celler var høyest i FIII, på 83,2% ± 8,01%, og det laveste i FIV, ved 4,6% ± 0,42% (figur 3B, D). Vi har også valgt en levertumor markør (AFP) og en galle svulst markør (CK-19) for å identifisere celler fra hver fraksjon. Etter atskillelse, prosentandelen av AFP-positive celler i FIII var den høyeste (89,6% ± 8,27%), å være mye høyere i en hvilken som helst annen fraksjon (
P
0,01) (figur 3B, D). Imidlertid ble bare noen få celler i FI bestemt på å være CK-19 positive (6,1% ± 0,54%), og nesten ingen celler i F0, FII, FIII og FIV uttrykt CK-19 (figur 3B, D).
fenomenet er beskrevet ovenfor ble kvantitativt bekreftet ved hjelp QRT-PCR. De relative nivåer av EpCAM og AFP-mRNA var høyest i celler fra FIII (
P
0,01), som er nesten fire ganger så høy som observert i celler fra F0. I motsetning til dette EpCAM og AFP-mRNA-nivåer var lavest i celler fra FIV (
P
0,01), som er halvparten av nivåene i celler fra F0 (figur 3E). I samsvar med resultatet fra IF, CK-19-mRNA kunne bare bli svakt påvist i celler fra FI (relativ ganger var 0,103 ± 0,012); men CK-19 mRNA kunne knapt bli oppdaget celler av F0, FII, FIII og FIV (figur 3E). I tillegg er det modne hepatisk markør ALB var moderat uttrykt i celler fra FIV, meget svakt uttrykt i celler fra F0, FI og FII, og uttrykt nesten ikke i det hele tatt i celler fra FIII.
