Abstract
transformerende vekstfaktor-β (TGF-β) signalveien er involvert i et variert utvalg av cellulære prosesser som er ansvarlige for tumorigenesis. I dette case-control studie, søkte vi en vei basert tilnærming for å evaluere enkelt nukleotid polymorfismer (SNPs) i TGF-β signalveien som predikator for kreftrisiko eggstokkreft. Vi genotypede systematisk 218 SNPs fra 21 gener i TGF-β signalveien i 417 eggstokkreft tilfeller og 417 matchede kontrollpersoner. Vi analyserte sammenslutninger av disse SNPs med eggstokkreft risiko, utført haplotype analyse og identifiserte potensielle kumulative effekten av genetiske varianter. Vi utførte også analyse for å identifisere høyere orden gen-gen-interaksjoner som påvirker eggstokkreft risiko. Individuell SNP analyser viste at den viktigste SNP var
SMAD6
: rs4147407, med en justert odds ratio (OR) på 1,60 (95% konfidensintervall [CI], 01.14 til 02.24,
P
= 0,0066). Akkumulert genotype analyse av 13 SNPs med betydelige viktigste effektene viste en klar dose-respons trend med økende risiko med økende antall ugunstige genotyper. I genet basert analyse,
SMAD6
ble identifisert som den mest betydningsfulle genet assosiert med kreftrisiko eggstokkreft. Haplotype-analyse viste videre at to haplotype blokker i
SMAD6
var signifikant assosiert med redusert risiko ovariekreft, sammenlignet med den mest vanlige haplotype. Gene-genet interaksjonsanalyse videre kategorisert studiepopulasjonen i undergrupper med forskjellig eggstokkreft risiko. Våre funn tyder på at genetiske varianter i TGF-β signalveien er forbundet med risiko for kreft i eggstokkene, og kan lette identifiseringen av høyrisiko undergrupper i befolkningen
Citation. Yin J, Lu K, Lin J Wu L, Hildebrandt MAT, Chang DW, et al. (2011) genetiske varianter i TGF-β Pathway er forbundet med eggstokkreft Risk. PLoS ONE 6 (9): e25559. doi: 10,1371 /journal.pone.0025559
Redaktør: Reiner Albert Veitia, Institut Jacques Monod, Frankrike
mottatt: 18 juni 2011; Godkjent: 05.09.2011; Publisert: 30.09.2011
Copyright: © 2011 Yin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet delvis av det amerikanske forsvarsdepartementet Ovarian Cancer Research Program under pris antall W81XWH-07-0449, og National Institutes of Health /Nasjonalt Senter for forskningsressurser /forskningssentre i Minority institusjoner innvilger 5G12RR003045-21. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er den ledende dødsårsaken fra gynekologisk kreft blant kvinner i USA, med anslagsvis 21,880 nye tilfeller og 13,850 dødsfall i 2010 [1]. Fordi sykdommen er mest symptomfri i tidlige stadier, og det er ikke effektive screening metoder, 75% av kvinner tilstede med avansert stadium sykdommen (stadium III eller IV). Den 5-års overlevelse av avansert stadium sykdommen er bare rundt 30% [2]. Årsakene til eggstokkreft er fortsatt i stor grad ukjent, men hormonelle faktorer, betennelser, og sårheling er tenkt å spille viktige roller [3].
Eggstokkreft er en multifaktoriell sykdom og genetisk disposisjon har blitt foreslått i tidligere studier. For eksempel mutasjoner i
BRCA1
,
BRCA2
,
MLH1
, og
MSH2
ble funnet å utgjøre ca 50% av familiære eggstokkreft [ ,,,0],4], [5]. Men det er overbevisende bevis som tyder på at vanlige genetiske varianter bidra til eggstokkreft mottakelighet [6], [7]. Nylig har genome-wide assosiasjonsstudier (GWAS) identifisert flere felles resistens alleler i fire loci som viser sterke assosiasjoner, men som de fleste SNPs identifisert i GWAS, foreninger er vanligvis lav i størrelse med de fleste av ORS mindre enn 1,3 [8], [9], [10]. På grunn av den heterogene og multigenic natur eggstokkreft, er det usannsynlig at noen enkelt SNP vil være tilstrekkelig til å gi sykdomsrisiko. En omfattende sti basert analyse som fokuserer på å vurdere den kumulative effekten av et panel av SNPs ville være kraftigere å pres mottakelighet gener og polymorfisme.
transformerende vekstfaktor-β (TGF-β) vei, herunder TGF-B, benmorfogene proteiner (BMPs), aktiviner og relaterte proteiner, er involvert i et variert utvalg av cellulære prosesser, herunder celleproliferasjon, morphogenesis, migrasjon, ekstracellulære matrise produksjon, og apoptose. Endring av TGF-β superfamilien signalering har vært implisert i en rekke humane sykdommer, inkludert kreft, utviklingsforstyrrelser, kardiovaskulære og autoimmune sykdommer [11], [12], [13]. Eksperimentelle data har vist at mer enn 75% av human ovariekreft utviser resistens mot TGF-β signalering [14], [15], som tyder på at TGF-redusert β respons er en viktig hendelse i denne sykdommen. I normale eggstokk-overflate epitelceller, er autokrin veksthemming opprettholdes av TGF-β [16], men tumorceller å unnslippe de antiproliferative virkningene til TGF-β ved å anskaffe mutasjoner i komponentene i signalveier, eller ved selektivt å forstyrre TGF-β. Mutasjoner og delesjoner av Smad gener i TGF-β signalveien ofte føre til ustabile proteinprodukter som raskt nedbrytes etter ubiquitinering og forskyve likevekten av signaleringskaskade som fører til tumorgenese [11]. Studier har rapportert tilstedeværelse av noen vanlige genetiske variasjoner i TGF-β signalveien å være relatert til ovarian kreftutvikling, slik som
TGFB1
: rs56361919 i 23% av eggstokkreft tilfeller [17]. I tillegg er mutasjoner og /eller endringer i ekspresjonen av TGF-β reseptorer og tap av SMAD4 ofte detektert i humane ovarietumorer [18].
Gitt den kritiske rolle av TGF-β banen i å opprettholde riktig cellulær funksjon og brudd i denne veien i eggstokk-kreft, er det mulig at vanlige genetiske variasjoner i denne reaksjonsveien kan påvirke risikoen for ovarial cancer. Så vidt vi vet, har ingen molekylære epidemiologiske studier er utført omfattende evaluere genetiske varianter i denne veien med kreftrisiko eggstokkreft. I denne studien ønsket vi å teste hypotesen om at vanlige germline genetiske varianter i TGF-β veien er forbundet med kreftrisiko eggstokkreft.
Metoder
Studier befolkning og datainnsamling
pasientpopulasjonen er blitt tidligere beskrevet [19]. Kort, 417 nydiagnostiserte og histologisk bekreftet ovarialcancer hos pasienter med primær malignitet ble rekruttert ved The University of Texas MD Anderson Cancer Center. Tilfeller hadde ikke mottatt kjemoterapi eller strålebehandling før rekruttering. Det var ingen restriksjoner på rekruttering i forhold til alder, etnisitet, eller klinisk stadium av sykdommen. De 417 kontrollene var friske kvinner uten tidligere historie med kreft (unntatt nonmelanoma hudkreft) og identifisert fra en stor pool av kontrollpersoner registrert i pågående case-control studier av kreft. Styrer fag var individer ser en lege for rutinemessige helsekontroller eller adressering helsemessige bekymringer på Kelsey-Seybold Clinic. Saker og kontroller ble matchet av alder (± 5 år) og etnisitet.
demografiske kjennetegn (alder og etnisitet), yrkes historie, bruk av tobakk historie, medisinsk historie, familiehistorie med kreft, og andre epidemiologiske data ble samlet for alle pasienter og kontroller. For hver deltaker ble en blodprøve samlet i hepariniserte rør for lymfocytt isolasjon og DNA-ekstraksjon. For alle tilfeller og kontroller, ble skriftlig informert samtykke innhentes før deltakelse og donasjon av blodprøver. Studien ble godkjent av Institutional Review Boards of MD Anderson og Kelsey Seybold Clinic.
SNP Utvalg og Genotyping
De prosedyrer som brukes for å velge SNPs av TGF-β veien har blitt beskrevet tidligere [20 ]. Kort fortalt, vi samlet data fra Gene ontologi (https://www.geneontology.org) og en systematisk litteraturgjennomgang for å avgrense listen genet i TGF-β signalveien. Tagging SNP’er ble identifisert fra den HapMap database (https://www.hapmap.org) og valgt ved hjelp av LDSelect program (https://droog.gs.washington.edu/ldSelect.html) for å separere SNP’er inn i binger på grunnlag av koblingsulikevekt. Valgte tagging SNPs har en r
2 terskel på 0,8, mindre allel frekvens (MAF) større enn 0,01 i kaukasiske befolkningen og befinner seg innen 10 kb oppstrøms av transkripsjonen startwebstedet og 10 kb nedstrøms transcriptional slutten nettstedet. Potensielt funksjonelle SNPs (f.eks koding SNPs og SNPs i uoversatt regioner, arrangører, og skjøte nettsteder) ble også inkludert. Samlet, 218 SNPs i 21 gener fra TGF β veien ble valgt sammen med SNPs fra andre kreftrelaterte veier. Komplett sett av SNPs ble sendt til Illumina teknisk støtte for egendefinerte IVelg, infinium II BeadChip design ved hjelp av proprietære program utviklet av Illumina. Genomisk DNA ble isolert fra perifere blod-lymfocytter ved å bruke QIAamp DNA Blood Maxi kit (Qiagen, Valencia, CA). Genotyping fulgte standard protokoll fra Illumina er infinium IVelg HD Custom genotyping Beadchip levert av Illumina (San Diego, California). BeadStudio programmet ble brukt til å ringe genotyper. Alle laboratoriepersonell ble blindet av case-control status av forsøkspersonene.
Statistiske analyser
Fordelingen av kategoriske variabler og kontinuerlige variabler mellom saker og kontrollpersoner ble sammenlignet med Pearsons χ
2 test og Student
t
test, henholdsvis. For hver SNP i denne studien, testet vi Hardy-Weinberg likevekt med godhet-of-fit χ
2 test for å sammenligne observert med en forventet frekvens av genotyper i kontrollpersoner. For SNP analyser, vi testet tre forskjellige genetiske modeller, dominerende modell, recessive modell og additiv modell for å identifisere de beste sittende modell med den minste
P
verdi. Dersom prosentandelen av de homozygote variant genotyper var mindre enn fem i tilfeller eller kontroller, vi bare betraktes som den dominerende modellen som har den høyeste statistisk styrke. Multippel logistisk regresjonsanalyse ble brukt til å beregne odds ratio (ORS) og 95% konfidensintervall (KI) mens du justerer for alder og etnisitet der det passer. For intern validering, ble en bootstrap resampling metoden utføres 100 ganger på prøver tilfeldig trukket fra det opprinnelige datasettet og en
P
verdier ble oppnådd for den beste sittende modell i hvert bootstrapped prøve. Kumulative effekten av SNPs ble vurdert ved å summere opp de antatte ugunstige genotypene som viser signifikant sammenheng med risiko (P 0,05) i enkelt SNP analyser og deretter gruppert i fire kategorier basert på fordelingen av ORS. Et gen-basert analyse ble brukt til å utforske sammenhenger mellom gener og kreftrisiko eggstokkreft ved hjelp av sannsynlighet-ratio test (LRT) som beskrevet tidligere [21]. Klassifisering og regresjon treet (CART) analyse ble brukt til å utforske høyere orden gen-gen-interaksjoner ved bruk av forventning-haplotype analyse ble utført ved hjelp av maksimering algoritmen implementert i HelixTree programvare (gylne Helix, Bozeman, MT). Vi utførte også 10.000 bootstrap går for å konstruere 95% CI’er for ORS i kumulativ genotype analyse og CART analyse. Alle statistiske analyser ble justert for alder, etnisitet. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av Stata 10,0 (College Station, TX).
Resultater
emne egenskaper
I denne studien var det 417 tilfeller og 417 alders- og ethnicity- matchet kontrollpersoner. Gjennomsnittsalderen var 60,73 (SD: 10.36) i saker og 60.30 (SD: 10.71) hos kontrollpersonene (
P
= 0,554). Flertallet av tilfellene (n = 339, 81,29%) og kontroller (n = 349, 83,69%) var kaukasiere. Av tilfellene, er de fleste diagnostisert på stadium III (66,5%), der tumor er av serøs subtype (61,3%) (tabell S1).
Sammenhengen mellom individ SNP og risiko
totalt 218 SNP fra 21 gener i TGF-β veien ble analysert (tabell S2). Tjuetre SNPs fra ti gener viste signifikant sammenheng med kreftrisiko eggstokkene på
P
0,05 (tabell 1). Intern validering av bootstrapping metoden identifisert 13 SNPs fra åtte gener som viser konsistente foreninger (dvs.
P
0,05 i 80 eller mer blant 100 bootstrapped prøver). Den mest betydningsfulle SNP var
SMAD6
: rs4147407 med fagene med minst én variant allel utviser en 1,60 ganger økt risiko (95% CI, 1.14 til 2.24). For en annen SNP i
SMAD6
, den varianten allel av rs4075546 ble assosiert med redusert risiko (OR 0,77; 95% CI, 0,63 til 0,94,
P
= 0,0099)
Vi har utforsket videre den kumulative effekten av disse 13 viktige genetiske varianter i TGF-β sti på kreftrisiko eggstokkene. Sammenlignet med de som utføres færre enn 4 ugunstige genotyper, fag bærer 5-7, 8-10 og 11-13 ugunstige genotyper viste en signifikant økt risiko med ORS av 2,45 (95% KI, 1,12 til 5,33;
P
= 0,024), 4,42 (95% KI, 2,04 til 9,57;
P
= 0,00017) og 6,75 (95% KI, 2,83 til 16,12;
P
= 0,68 × 10
-5), henholdsvis (
P
for trend = 1.67 × 10
-8;. Tabell 2)
Gene basert analyse for eggstokkreft risiko
Gene basert analyse identifisert
SMAD6 Hotell og
TGFB1 product: (
P
0,05 for alle SNPs undersøkt i hvert gen med dominant eller additiv modell; Tabell 3 ) som gener assosiert med kreftrisiko eggstokkreft.
SMAD6
viste mest signifikant sammenheng (
P
= 0,034), noe som tyder på at de genene undersøkte genetiske variasjoner i dette genet som hadde størst innvirkning på kreftrisikoen eggstokkene ..
haplotype analyse av SMAD6 SNPs
Som flere SNPs i
SMAD6
genet viste signifikante sammenhenger, vi utførte haplotype analyse for de 29 SNPs genotypet i
SMAD6
. Fem blokker ble haplotype definert ved lokal koblingsulikevekt (LD) i henhold til HaploView [22] (figur 1, tabell 4). Definisjonen av «blokker» ble beskrevet tidligere av Gabriel et al. [23] Vi observerte signifikante assosiasjoner mellom
SMAD6
haplotyper og risiko for eggstokkreft i to LD blokker, blokk 1 i 5 «flankerende område og blokkerer to i intron fem regionen (figur 1 og tabell 4). Haplotype H2 av blokken 1 er sammensatt av SNP rs11857194-rs1470123-rs2053424, og fag som bærer bare en variant allel av rs1470123 viste en signifikant reduksjon i forbindelse med kreft i eggstokkene risiko (OR, 0,72; 95% CI, 0,55 til 0,95;
P
= 0,018) sammenlignet med de som bærer den vanligste haplotype av bare en variant allel av rs205342. Haplotype H1 av blokk 2 består av SNPs rs16953584-rs7182227, og fagene bærer bare en variant allel av rs16953584 viste en signifikant 36% reduksjon i risiko (OR 0,64; 95% KI, 0,44 til 0,92;
P
= 0,016) sammenlignet med den vanligste haplotype av to villtype alleler (tabell 4)
høyere ordens gen-gen-interaksjoner
KJØP analyse ble brukt til å utforske høyere -Bestill interaksjoner mellom de 13 betydelige SNPs. Som vist i figur 2, treet modell resulterte i fire terminale noder med forskjellige risiko for kreft i eggstokkene. Den første split ble definert av
INHBC
: rs2228225, noe som indikerer at dette SNP er den primære faktor som bidrar til variasjoner i eggstokkreft risiko i studiepopulasjonen. Referanse node i trestrukturen var sammensatt av
INHBC
: rs2228225 AA,
SMAD6
: rs4147407 CC, og
BNIP2
: rs235757 AA + AG genotyper. Fagene i denne noden viste lavest risiko for eggstokkreft. Den høye node var sammensatt av
INHBC
: rs2228225 AA og
SMAD6
: rs4147407 CT + TT og indikerte den høyeste risikoen for eggstokkreft, med en OR på 6,33 (95% CI, 2.32- 17.28;
P
= 0,0003), noe som tyder på at den genetiske varianten av
SMAD6
: rs4147407 var en viktig faktor for å bytte trenden med lavest risiko til høyest risiko for eggstokkreft (figur 2 og Tabell 5).
ORS og 95% CI’er (i parentes) er presentert under hver terminal node.
Diskusjoner
i denne studien har vi systematisk undersøkt sammenhengene mellom et omfattende panel av genetiske varianter i TGF-β pathway gener og kreftrisiko eggstokkreft. Våre resultater antydet at flere SNPs i veien var forbundet med kreftrisiko eggstokkreft. Spesielt SNPs i
SMAD6
viste de mest signifikante sammenhenger i enkelt SNP og haplotype analyser. Videre var det en kumulativ effekt av SNPs i veien som tildeles en betydelig dose-respons trend med fag som frakter flest ugunstige genotyper som stiller størst risiko. Resultater fra CART analyse foreslått høyere orden gen-gen-interaksjoner som ytterligere definert høy vs lav risiko undergrupper i studiepopulasjonen.
En av de store funnene var signifikant sammenheng av
SMAD6
polymorfismer med kreftrisiko eggstokkreft.
SMAD6
koder for et protein som er lokalisert i både kjernen og cytoplasmaet [24] og virker som en hemmende Smad indusert av BMP og TGF-p-signaler for en auto-hemmende feedback mekanisme i TGF-β pathway [25 ], [26].
SMAD6
genet er uttrykt i de fleste menneskelige vev, inkludert eggstokken (figur S1). Dessuten
SMAD6
ble rapportert å være overuttrykt i eggstokk-adenokarsinom i forhold til normalen ovarievev [27], og ekspresjon av BMP-2 protein har blitt vist å indusere
SMAD6
ekspresjon i eggstokkreft celler og er assosiert med dårlig prognose [28]. Funksjonen til
SMAD6
i tumorigenesis har ikke blitt godt etablert. Men mutasjoner i
SMAD6
har blitt rapportert i menneskelig eggstokkreft [29]. Siden TGF-beta-signaler kan fungere i potent svulst undertrykkelse i normale epitelceller og i tidlig stadium svulster [11], vi spekulert i at genetiske variasjoner i
SMAD6
kan resultere i endret genuttrykk eller regulering av signale funksjon. I denne studien, fire polymorfismer (rs4147407, rs4075546, rs16953584, og rs4776318) i
SMAD6
ble funnet å være signifikant assosiert med kreftrisiko eggstokkreft. Blant disse polymorfismer, ble rs4147407 assosiert med økt risiko, mens rs4075546, rs16953584, og rs4776318 var assosiert med redusert risiko. Haplotype analyse videre identifisert to kandidat loci av
SMAD6
. Haplotype blokker som ligger i 5 «flankerende område og intron 5 av
SMAD6
genet henholdsvis ble begge assosiert med redusert risiko i denne studien. Men ingen av disse SNPs ligger i kodingen regionen i
SMAD6
, noe som tyder på at disse betydelige SNPs eller de identifiserte loci kanskje ikke direkte endre
SMAD6
funksjon, men kan endre nivået av gen uttrykk gjennom å være lokalisert i regulatoriske regioner eller være knyttet til andre årsaks SNPs å påvirke genaktivitet. Videre
in vitro Hotell og
in vivo
funksjonelle studier er nødvendig for å karakterisere den funksjonelle betydningen av
SMAD6
SNPs identifisert.
KJØP analyse viste gen- gene samspill mellom
INHBC
,
SMAD6
, og
BNIP2
. I treet modell,
INHBC
: rs2228225 var på første split, noe som tyder på at denne varianten fungerer som den primære risikofaktor for kreft i eggstokkene.
SMAD6
: rs4147407 lå i det andre nivået av trestrukturen og ble vist til å samhandle med
INHBC
: rs2228225 å påvirke kreftrisiko. Spesielt ble variant lene av rs4147407 forbundet med en 6-dobling i risiko sammen med felles allel av
INHBC
: rs2228225. Faktisk
INHBC
er blitt identifisert som beta C-kjeden av inhibin, et hormon som kan regulere cellevekst og differensiering [30]. Resultatet av CART analyse styrket den avgjørende rollen videre
SMAD6
i å påvirke risikoen for eggstokkreft i studiepopulasjonen.
Vår studie har noen begrensninger. Chance funnene er mulig på grunn av lite utvalg størrelse på undergrupper. Men vi brukt ulike statistiske metoder for å kontrollere for falske positiver. For eksempel utførte vi bootstrapping analyse for intern validering av de betydelige SNPs. Andre potensielle begrensninger inkluderer det faktum at umålte eggstokkreft risikofaktorer i denne studien (f.eks hormonerstatningsregler) kan forvirre den generelle fotballkrets. Gitt at vi testet en genetisk-drevet hypotese i stedet for en miljø-drevet hypotese, kan denne begrensning være mindre av et problem. Som med alle kasus-kontrollstudier, kan utvalgsskjevhet også forvirre de identifiserte foreninger. Likevel, MD Anderson fungerer som en henvisning senter for mange kreftpasienter fra Kelsey Seybold klinikker i Houston hovedstadsområdet; derfor våre kontroller er sannsynlig å representere bunnen befolkningen som gir opphav til krefttilfellene.
I konklusjonen, er vår studie den første studien som gjelder en vei basert tilnærming for å evaluere germline genetiske variasjoner i TGF-β veien og deres assosiasjoner med kreftrisiko eggstokkreft. Vi har identifisert 13 polymorfismer i TGF-β pathway signifikant assosiert med kreftrisiko i eggstokkene. Spesielt SNPs i
SMAD6
viste de mest signifikante sammenhenger. Våre data også foreslått en kumulativ effekt av SNPs i veien som i fellesskap påvirket eggstokkreft risiko, og identifisert høyere orden interaksjoner som videre definerer høy vs lav risiko undergrupper i studiepopulasjonen. Fremtidige studier er nødvendig for å karakterisere funksjonelle betydningen av genetiske varianter vi har identifisert, samt å bekrefte eller eksternt validere foreninger i uavhengige populasjoner.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Uttrykk for
SMAD6
avskrift i humane celler og vev.
SMAD6
vev uttrykk ble referert i T1Dbase database, en web-basert kilde for genetisk og genomisk informasjon om type I diabetes (www.t1dbase.org). I denne ressursen, ble menneskelig vev og celle-type spesifikke genuttrykk data innhentet fra Novartis GNF SymAtlas database. Uttrykket data ble generert på Affymetrix HGU133A chip og en tilpasset microarray
doi:. 10,1371 /journal.pone.0025559.s001 plakater (DOC)
Tabell S1.
Host Kjennetegn
Doi. 10,1371 /journal.pone.0025559.s002 plakater (DOC)
Tabell S2.
Association mellom merkede SNPs i TGF-β veien og kreftrisiko eggstokkreft
doi:. 10,1371 /journal.pone.0025559.s003 plakater (DOC)
