Abstract
Uttrykk for matriksmetalloproteinase 9 (MMP9) er forhøyet i en rekke inflammatoriske og onkologi indikasjoner, inkludert ulcerøs kolitt og kolorektal kreft. MMP9 er en nedstrøms effektor og en oppstrøms formidler av veier som er involvert i vekst og betennelser, og har lenge vært sett på som en lovende terapeutisk mål. Imidlertid har tidligere arbeidet med å målrette matriksmetalloproteinaser (MMP), inkludert MMP9, brukt bredspektret eller semi-hemmere. Mens noen av disse stoffene viste tegn til effekt hos pasienter, har alle MMP-målrettede hemmere blitt hemmet av dosebegrensende toksisitet eller utilstrekkelig klinisk nytte, trolig på grunn av deres manglende spesifisitet. Her viser vi at selektiv inhibering av MMP9 induserte ikke muskel-skjelett-syndrom (en karakteristisk toksisitet av pan-MMP-inhibitorer) i en rottemodell, men kunne redusere sykdommens alvorlighetsgrad i en dekstran-natriumsulfat-induserte musemodell av ulcerøs kolitt. Vi fant også at MMP9 hemning redusert tumorvekst og metastaser forekomst i et kirurgisk ortotopisk xenograft modell av kolorektal karsinom, og at inhibering av enten tumor- eller stroma-avledede MMP9 var tilstrekkelig til å redusere primær tumorvekst. Til sammen tyder disse data på at selektiv inhibering MMP9 er en lovende terapeutisk strategi for behandling av inflammatoriske og onkologiske indikasjoner hvori MMP9 er oppregulert og er assosiert med sykdom patologi, slik som ulcerøs kolitt og tykktarmskreft. I tillegg rapporterer vi utvikling av en potent og meget selektiv allosterisk MMP9 inhibitor, det humaniserte monoklonale antistoff GS-5745, som kan brukes til å vurdere det terapeutiske potensialet av MMP9 hemming hos pasienter
relasjon:. Marshall DC , Lyman SK, McCauley S, Kovalenko M, Spangler R, Liu C, et al. (2015) Selektiv allosterisk Hemming av MMP9 er effektiv i prekliniske modeller av ulcerøs kolitt og tykktarmskreft. PLoS ONE 10 (5): e0127063. doi: 10,1371 /journal.pone.0127063
Academic Redaktør: Fabio Cominelli, CWRU /UH Digestive Health Institute, UNITED STATES
mottatt: 23 desember 2014; Godkjent: 11 april 2015; Publisert: 11. mai 2015
Copyright: © 2015 Marshall et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
finansiering:. Alle forfattere og anerkjente personer er nåværende eller tidligere ansatte i Gilead Sciences. Gilead Sciences finansiert all forskning rapportert i denne studien, og ble kun involvert i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, og utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesser: Alle forfattere er nåværende eller tidligere ansatte i Gilead Sciences. Denne studien ble finansiert av Gilead Sciences. Gilead Sciences har patent «Antistoffer mot matriksmetalloproteinase 9» (US8501916 B2) og patentsøknaden «Antistoffer mot matriksmetalloproteinase 9» (US20130281676 A1), og vurderer for tiden humanisert monoklonalt antistoff GS-5745 i fase 1 kliniske studier (ClinicalTrials .gov identifikator NCT01831427, NCT02077465, og NCT01803282). Ingen av disse konkurrerende interesser påvirke forfatternes tilslutning til PLoS ONE retningslinjer for deling av data og materialer i forbindelse med den innsendte manuskriptet.
Innledning
Matrix metalloproteinase (MMP) -mediert proteolyse spiller en nøkkelrolle i modulering av cellulær homeostase: MMP’er kan initiere, forsterke eller nedregulere signaleringskaskader som er involvert i vekst og betennelse ved å aktivere cytokiner og frigjør sequestered vekstfaktorer, og kan modifisere vevsarkitektur ved nedbrytning av strukturelle komponenter i den ekstracellulære matriks (ECM) [1 -6]. Av de 23 familiemedlemmer MMP, MMP9 (også kjent som gelatinase B) viser særlig lovende som et terapeutisk mål, gitt kroppen av bevis som viser sin deltakelse i patologiske prosesser som bidrar til kronisk betennelse, tumorigenesis, og metastase [5-7].
feilregulert MMP9 ekspresjon og aktivitet er forbundet med en rekke inflammatoriske sykdommer, innbefattende ulcerøs kolitt (UC) [1, 7-12]. UC er et relapsing /remitterende autoimmun betennelse i tykktarmen [13-16] som inneholder induksjon av MMP9 proteinnivåer og proteolytisk aktivitet i områder med aktiv sykdom [10, 11, 17]. MMP9 aktivitet i UC er innblandet i både produksjon og opprettholdelse av en inflammatorisk tilstand-det er indusert av proinflammatoriske cytokiner som TNF-α og IL1- α [18-20] og det kan bidra til å opprettholde pro-inflammatoriske prosesser ved å slippe TNF -α og TGF-β, ved potensiering IL-8, og ved å aktivere IL1-β [4, 21-26]. MMP9 kan også bidra til inflammatoriske miljø gjennom proteolyse av basalmembran (BM) bestanddeler collagen IV og laminin [7]. Ødeleggelse av epitelial BM, et definerende trekk ved UC [13, 14, 16, 18], kan resultere i epitelial celle apoptose [27], noe som bidrar til tap av integriteten av tarmslimhinne epiteliale barrieren, noe som ytterligere forverrer betennelse. På samme måte kan forstyrrelse av endothelial BM lette lymfocytter og nøytrofile sjelevandring til stedet av betennelse [28-30].
Kronisk UC andMMP9 uttrykk i UC er risikofaktorer for utvikling av tykktarmskreft (CRC) [15 , 31-33], og selv om den nøyaktige banen fra kronisk inflammasjon til dysplasi til neoplasma er ikke klar, involvering av MMP9 i prosesser som muliggjør etablering og spredning av begge disse sykdommer [1, 6, 7, 34, 35] antyder at det kan spille en rolle i utviklingen av UC til kreft. MMP9 uttrykk er forhøyet og er korrelert med dårlig prognose i et bredt spekter av tumorer, inkludert CRC [5, 6, 35-47], og den spiller flere roller i ferd med tumorgenese: MMP9 er produsert av tumorceller så vel som av stromale inflammatoriske celler så som tumorassosierte makrofager (TAM) og neutrofiler, og er en viktig mediator av tumor-stroma krysstale som resulterer i gjensidig aktivering av pro-onkogene signalisering i disse to kammere [48-52]. MMP9 fremmer metastase ved å tilrettelegge for tumorcelle-migrering og invasjon via spalting av BM og andre komponenter ECM [53], og det har også vært implisert i primær tumorvekst på grunn av sin posisjon som både en nedstrøms mål [54-63] og en oppstrøms regulator av nøkkel onkogene signalveier. I det sistnevnte kapasitet, kan MMP9 aktiverer pro-onkogene signalisering via sin evne til å frigjøre vekstfaktorer så som EGF, FGF-2, og VEGF [64-67], og for å modulere integrin og reseptor-tyrosinkinase funksjon [54, 68, 69 ]. Til syvende og sist til disse forskjellige aspektene av MMP9 funksjon fungerer sammen påvirke signalfeilregulering og matrise proteolyse som bidrar til vekst og spredning av svulster [53, 64, 70-73].
Relevansen av MMP9 i patologi visse betennelses og onkologi indikasjoner har blitt demonstrert av rapporter som viser at
mmp9 – /-
mus utviste redusert sykdommens alvorlighetsgrad i prekliniske modeller for kolitt og leddgikt, og også vist redusert tumorvekst og /eller redusert metastaser i flere cancermodeller [1, 66, 74-81]. Selv om disse og andre publiserte observasjoner tyder på at MMP9 er en overbevisende terapeutisk mål, tidligere innsats for å målrette MMP (inkludert MMP9) benyttet pan-spesifikke eller semi-hemmere, og var mislykket på grunn av dosebegrensende bivirkninger som muskel-skjelettsyndrom (MSS ) og /eller til en generell mangel på klinisk nytte [1, 17, 39, 82-84]. I ettertid er forståelig mangelen på en terapeutisk vindu med disse bredere spekter MMP-hemmere, gitt roller som MMP kan spille i kritiske homeostatiske prosesser [22, 85].
Her rapporterer vi utviklingen av en svært selektiv og potent allosterisk antistoff hemmer av MMP9: vi viser at inhibering av MMP9 er effektiv i musemodeller for UC og tykktarmskreft, og at denne behandlingen ikke induserer MSS i en rottemodell. Vi foreslår at selektiv inhibering av MMP9-mediert signalisering og patologisk matriks proteolyse er et nytt terapeutisk mulighet i inflammatoriske tilstander som UC, og i kreftformer som CRC.
Materialer og metoder
Vevene
Fersk frosset (FF) og formalinfiksert og parafininnebygd (FFPE) menneskelig vev ble oppnådd fra Cureline, Inc. (Burlingame, CA), Asterand (Detroit, Michigan), eller Folio biovitenskap (Powell, OH) .
Rekombinante MMP9 proteiner og immunisering
Menneske MMP9 protein ble generert ved kloning av full lengde cDNA inn i pSecTag2hygro (B) vektor (Life Technologies, Carlsbad, CA) og forbigående trans det inn HEK293 -celler (ATCC, Manassas, VA). Den kondisjonerte mediet ble renset med en Ni-Sepharose Fast Flow 16/20 XK kolonne (GE biovitenskap, Pittsburgh, Pennsylvania). Dette proteinet og Ribi adjuvans ble anvendt for å immunisere BALB /c-mus (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) via fotputen. Mus med serum antistofftitere mot MMP9 ble brukt til å lage hybridom-bibliotekene med en sammensmelting av B-celler isolert fra lymfeknuter. Disse bibliotekene ble subklonet ved enkelt celle sortering å generere klonale populasjoner som anti-human MMP9 antistoff AB0041 ble identifisert. Immuniseringene, hybridom bibliotek opprettelse og antistoff kloning ble gjennomført ved Antistoffløsninger (Sunnyvale, CA). Den anti-mus MMP9 monoklonalt antistoff AB0046 ble likeledes generert, med de unntak som MMP9 knockout-mus (Jackson Laboratories) ble anvendt, og at en mus MMP9 protein sammensatt av bare pro og katalytiske domener (aa 1-445) ble anvendt for immunisering. For spesifisitet analysen ble full lengde MMP familie proteiner kjøpt fra R 10 mM natriumfosfat, 140 mM natriumklorid). Antistoff renhet ble vurdert ved å løse reduserte og ikke-reduserte prøver med SDS-PAGE 4-12% Bis-Tris geler og farging med Simple Blå Sikker flekk (Invitrogen). De rensede antistoffer ble vist å inneholde mindre enn 5% aggregater av SEC-HPLC ved hjelp TSKgel G3000SWxl kolonne fra Tosoh (King of Prussia, PA). LAL-testing (Endosafe, Charles River Laboratories, Charleston, SC) ble anvendt for å bekrefte antistoffpreparater inneholdt mindre enn 5 EU /mg endotoksiner.
MMP9 direkte binding enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
den direkte binding antigen-ned-ELISA-analyser med rensede rekombinante MMP9 proteiner ble utviklet for å måle den tilsynelatende bindingsaffinitet til AB0046, AB0041, og GS-5745. Alle vaskinger ble med PBS + 0,05% Tween-20 (PBST). Full-lengde MMP9 proteiner ble belagt på Maxisorp-plater (NUNC, Rochester, NY), fulgt av blokkering med PBS + 5% (w /v) bovint serumalbumin (BSA; EMD Millipore). Platene ble deretter vasket, og serielle fortynninger av anti-MMP9 antistoffer i PBS ble tilsatt. Etter vasking ble platene inkubert med pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert sekundært antistoff (Thermo Scientific, Fair Lawn, NJ) fortynnet 1: 10.000 i PBS + 0,5% (w /v) BSA ble deretter vasket og utviklet ved bruk av 3,3 «, 5,5»- tetrametylbenzidin (TMB; Sigma, St.Louis, MO) i 1 minutt. Reaksjonen ble stanset ved tilsetning av 1 M saltsyre. Kvantifisering ble utført på en SpectraMax M5 plateleser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) i absorpsjon modus ved en bølgelengde på 450 nm. Tilsynelatende dissosiasjonskonstanter (K
D (ELISA)) ble bestemt ved anvendelse av Softmax Pro (Molecular Devices) ved å plotte absorbansverdiene for vs konsentrasjonen av antistoff og å tilpasse dataene til en 4-parameters logistisk ligning, med «C «parameter ligning definert som den tilsynelatende K
D.
Epitopkartlegging av AB0041 og AB0046
Alle mutante MMP9 konstruksjoner som brukes i epitop kartlegging ble generert av mutere mus og menneske MMP9 ekspresjonsvektorer hjelp en QuikChange II Side mutagenese Kit (Stratagene, La Jolla, CA). Individuelle kloner ble verifisert ved DNA-sekvensanalyse, og mutante MMP9 proteiner ble samlet ved transient transfeksjon i HEK293-celler. Kondisjonert medium ble høstet etter 24 til 48 timer og anvendt til å belegge en His-Select Hi-Capacity Ni2
+ belagte plate (Sigma) over natten ved 4 ° C. Den følgende dag ble platene vasket i PBST og blokkert med 5% BSA i PBS i én til to timer ved omgivelsestemperatur, etterfulgt av inkubasjon med enten 10 nM eller 1 nM antistoff fortynnet i PBST. Platene ble vasket og inkubert med et geit-anti-mus-IgG- HRP-konjugert sekundært antistoff (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA,) fortynnet 1: 10000 i 0,5% BSA i PBS. Platene ble vasket, utviklet og leses som beskrevet ovenfor
MMP9 aktivitetsanalyser
MMP9 aktivitet ble vurdert ved hjelp slukket fluorogene substrater.; spalting genererer fluorescens som er proporsjonal med mengden av enzymaktivitet [86]. Menneskelige og mus-analyser brukes QXL 520-γ-Abu-P-Cha-Abu-Smc-HA-Dab (5-FAM) -AL-NH2, hvor Smc = S-metyl-L-cystein, Abu = 2-aminosmørsyre og Cha = β-cykloheksylalanin (AnaSpec Inc., Fremont, CA), og rotte-test som benyttes Mca-PLGL-Dpa AR-NH2; (R en fire-parameters kurvetilpasning ble brukt for å bestemme en IC
50.
TNF-α fusjonsprotein spaltning assay
Det rekombinante humane pro-TNF-α fusjonsprotein spaltning analyse (R D Systems, 1012-PS-010) ble utført etter produsentens protokoll. Aktive humant rekombinant MMP9 (Millipore, PF024) eller ADAM17 (R E) og undersøkt mikroskopisk. MSS Studien ble utført ved Aragen Biosciences Inc. (Morgan Hill, California).
DSS-indusert kolitt modell
syttifem Mann C57BL /6 mus ble oppnådd fra Charles River Laboratories (Wilmington , MA) og ble akklimatisert i 5 dager før studie oppstart og overvåkes for å bekrefte helse. Studien ble utført i dyrerom utstyrt med HEPA-filtrert luft ved en temperatur på 70 ° C +/- 5 ° C og 50% +/- 20% relativ fuktighet. Rommet var på en automatisk tidtaker for en lys /mørk syklus på 12 timer på og 12 timer av uten skumring. Steril Bed-O-Cobs sengetøy ble endret minst en gang per uke. Dyrene ble foret med Purina sterilt Labdiet 5053 gnagerdiett, og sterilt vann ble gitt ad libitum.
Mus ble randomisert på grunnlag av kroppsvekt i 5 grupper på 14 dyr og en gruppe på 5 dyr før starten av studere. Kolitt ble indusert ved administrering av 3% vekt /volum dekstran-natriumsulfat (DSS) (MP Biomedicals, MW 36,000-50,000;. Produkt nr 160110;. Lot nr 5237K) i drikkevannet på studiedager 0 til 5. DSS løsning var erstattes med en nylaget løsning på dag 3. en gruppe mus (n = 5) mottok ikke DSS og tjente som ingen sykdom kontrollgruppen. På studie dag 6 ble 14 dyr per gruppe intraperitonealt administrert enten PBST kjøretøy, isotypekontrollantistoff (30 mg /kg), AB0046 (30 mg /kg), eller etanercept (10 mg /kg, Clayworth Healthcare, Castro Valley, CA) . Kjøretøy og antistoffer ble dosert på dagene 6, 9 og 12, og etanercept ble dosert på dagene 6, 8, 10, og 12. Alle dyrene ble veid og visuelt bedømt for tilstedeværelse av diaré og blodig avføring daglig. Ved studium terminering (dag 14), alle dyr gjennomgikk video endoskopi av den nedre tykktarm med et lite dyr endoskop (Karl Storz Endoskope, Tyskland). Dyrene ble bedøvet med isofluran og kolitt ble scoret visuelt med følgende skala [89]: 0 (for normal), en (for tap av vascularity), 2 (for tap av vaskularitet og bevis for sprøhet), 3 (for sprøhet og erosjoner ), og 4 (for alvorlig sårdannelse). Hver mus ble gitt en enkelt score (betegnet endoskopi score) som samsvarer med mest alvorlige skader observert over hele lengden av tykktarmen. Ved studiestart avslutning ble dyrene avlivet ved eksponering for C0
2. For å evaluere kolitt alvorlighetsgrad histologisk, en bord-sertifisert veterinær GI patolog, blindet med hensyn til å studere grupper, vurdert H E-farget FFPE- vise deler av tykktarmen vev. Fem til åtte separate 5 um tykke seksjoner tatt fra forskjellige regioner av de nedre 5 cm av hver kolon ble bedømt for morfologiske endringer og /eller skade på epitelet, bindevev, og submucosa ved hjelp av en 4-punkts skala [89]. Scoring av inflammasjon og ødem var som følger: 0 (ingen til stede), en (sjelden foci /minimal), 2 (spredte områder eller mild /diffus), 3 (tallrike områder eller moderat diffus), 4 (merket). Scoring av slimhinnene nekrose var som følger: 0 (ingen), 1 ( 25% affisert), 2 (26-50% affisert), 3 (51-75% affisert), og 4 ( 76% affisert). Disse scorene var i gjennomsnitt for å få et enkelt gjennomsnittsskår per mus per parameter. Denne studien og den tilhørende histopatologiske analyse (inkludert valg av representative bilder) ble utført av Biomodels, LLC.
HCT116 kirurgisk orthotopic xenograft modell
Alle tre HCT116 prekliniske studier ble utført av Anticancer Inc. (San Diego, California). Kvinnelig NCR nu /nu-mus ble oppnådd fra Charles River (Wilmington, MA) og ble oppdrettet av anticancer Inc. for å produsere studere dyr. Testdyrene ble holdt ved i et HEPA-filtrert miljø med en 14 timers lys /10 timers mørk syklus for forsøket. Bur, mat og sengetøy ble autoklavert; LabDiet mus chow ble hentet fra PMI Nutrition International Inc. (Brentwood, MO) og ble gitt ad libitum, som drakk vann. Mus ble randomisert basert på kroppsvekt i 4 grupper (en kontrollgruppe, 3 eksperimentelle grupper) av 15 dyr. Pre-implantation tumor bestander av human kolorektal kreft cellelinje HCT116 uttrykker GFP (anticancer Inc.) ble fremstilt ved subkutant injeksjon av HCT116-GFP-celler ved en konsentrasjon på 5 x 10
6 celler /100 ul i flanken av naken mus. Etter utvidelsen, ble tumorvev høstet fra mus og kuttet i fragmenter av omtrent 1 mm
3. To slike tumorfragmenter ble deretter kirurgisk implantert orthotopically (SOI) tilstøtende til kolon av hver studie dyr under Ketamin /Acepromazin /xylazin anestesi.
Når kirurgisk implanterte tumorer nådde et gjennomsnittlig volum på omtrent 70-100 mm
3, ble musene delt i behandlingsgrupper. Behandlingen ble startet 16 dager etter tumor implantasjon for Studie 1 og Studie 3, og 17 dager etter implantasjon for Study 2. Alle mus behandlet med AB0041 /AB0046 cocktail fikk en startdose på AB0046 på 50 mg /kg på den første dagen av behandling. AB0041 og AB0046 ble deretter dosert ved intraperitoneal injeksjon to ganger per uke ved 15 mg /kg, enten enkeltvis eller i kombinasjon (i kombinasjonsgruppen, hvert antistoff var til stede ved 15 mg /kg). Kontrollmus ble dosert med bærer (PBS, 0,01% Tween-20). Primær tumor størrelse og kroppsvekt ble målt (ved caliper eller via elektronisk skala, henholdsvis) to ganger i uken i studie 2 og studere tre, og en gang i uken for Study 1. Sylinder-baserte størrelsesestimater ble oppnådd ved å måle vinkel minste dimensjon ( W) og største dimensjon (L) av den palperes tumoren. Tilnærmet tumorvolum (mm
3) ble beregnet ved formelen (W
2x L) /2.
Mus ble avsluttet ved 20 dager etter behandlingsstart (undersøkelse 3), 18 dager etter behandlingen initiering (studie 2), eller 28 dager etter behandlingsstart (studie 1). Triggere for eutanasi ble: tumorvolum 2000 mm
3, 20% vekttap, observert interferens med en viktig fysiologisk funksjon, eller sårdannelse eller nekrose av tumoren. Den primære tykktarm tumor og eventuelle organer med metastaser ble høstet ved studium ende, og den primære svulsten ble veiet etter utskjæring. Svulster ble delt i to, og en halvdel ble fiksert i 10% nøytral bufret formalin løsning for histologisk analyse. Den andre halvparten og alle GFP-positiv metastatiske tumorer fra andre organer ble plassert i vev kassetter og ble hurtigfrosset i flytende nitrogen. Den FluorVivo bildesystem (INDEC Biosystems, Santa Clara, CA) ble anvendt for hele kroppen avbildning. Ved obduksjon ble åpen avbildning utført i brysthulen og mageområdet for inspeksjon av metastaser til lymfeknuter, lunger og andre områder. Tilstedeværelsen av nekrotisk vev i H E-farget tumorsnitt ble vurdert av en bord-sertifisert patolog
Immunohistochemistry
Fryst vev ble forankret i Optimal Cutting Temperatur (OCT-Tissue Tek, VWR. , Brisbane, CA) forbindelse ved behandling med et isopentan tørrisbad (-70 ° C). Vev ble hentet og lagret ved -80 ° C. Vev som inneholder OCT blokker ble seksjonert i en cryostat (Leica CM1850), og kutt i 5 mikrometer tykke frysesnitt, som ble plassert på Superfrost positivt ladede lysbilder (VWR). For formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) vevsblokker, ble 5 mikrometer tykke seksjoner kuttet, montert på Superfrost lysbilder, og bakt ved 60 ° C i ca 20 minutter.
Med mindre annet er angitt, alle IHC reagenser og utstyr var fra Biocare Medical (Concord, CA), IHC prosedyrer ble utført ved romtemperatur, og alle lysbilder ble farget med Nemesis 3600 fra Biocare Medical. Pre-fiksering (frosne vevssnitt): objektglass ble fiksert med 4% paraformaldehyd (VWR) og deretter skylt i PBS inneholdende 0,02% Tween-20 (PBST) i forberedelse for IHC. Deparaffinization /Antigen Retrieval (FFPE vev): objektglass ble neddykket i 1x Universal Decloaker løsning og oppvarmet til 90 ° C i 45 minutter i decloaking kammeret, deretter nedsenket i varmt Skylling 20 ganger, og bragt i likevekt med destillert vann. Autostainer: glass ble behandlet med Peroxidazed og blokkert med Bakgrunn Sniper før inkubering med det primære antistoff i Da Vinci Grønn fortynningsmiddel i 30 minutter. Den anti-MMP9 (ab76003), anti-kollagen IV (ab6586), og anti-PM2K (ab58822) antistoffer ble oppnådd fra Abcam (Cambridge, MA). Den anti-myeloperoksidase (MPO, A0398) ble oppnådd fra Dako (Carpinteria, CA). Platene ble deretter skyllet i TBS-Autowash. Mach 2 Polymeren kit ble anvendt for antigen påvisning ved tilsetning av anti-kanin-sekundært antistoff (konjugert til pepperrot-peroksidase) i 30 minutter. DAB (3, 3 «diaminobenzidin) chromagen ble tilsatt til lysbildene i 1 minutt, etterfulgt av en enkelt skylling i TBS-Autowash og en enkel skylling i destillert vann. Slides ble deretter kontra med CAT hematoksylin, etterfulgt av manuell dehydrering med gradert alkohol, deretter montert med entellan montering media. Alle lysbildene ble visualisert ved hjelp av et Leica DFC500 lysmikroskop.
Dyrevelferd
Alle studier med mus eller rotter ble utført i henhold til anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health og ble godkjent av den lokale IACUC tilsyn hvert anlegg hvor studiene ble gjennomført: Biomodels Instituional Animal Care og bruk Committee (IACUC godkjenningsnummer 09-1215-03); Aragen Committee for Animal Care og bruk (IACUC godkjenningsnummer SA-003-A); Animal Care og bruk komité ved Anticancer (IACUC godkjenningsnummer 14-090).
Grafisk og statistisk analyse
Data ble analysert og visualisert ved hjelp av Prism programvare (GraphPad, v5.01). For kliniske, histopatologiske, og immunhistokjemi bedømmingen ble betydningen av regulering av behandlingsgruppene vs. kjøretøygruppe vurderes som følger: D’Agostino Pearson omnibus normalitet test ble benyttet for å bestemme hvorvidt data som normalt ble fordelt. Data som normalt ble distribuert ble evaluert av en enveis ANOVA med Dunnetfs multiple sammenlignings post-test. Ikke-normalfordelte data ble evaluert ved enten en Mann Whitney-test (for parvis analyse) eller ved en Kruskal-Wallis test med Dunn multiple sammenlignings post-test. Fishers eksakte test ble benyttet for analyse av metastaser data. P verdi betegnelser er som følger: * 0,05, ** 0.01, *** 0,001, **** 0,0001.
Resultater
generasjon og karakterisering av anti-MMP9 antistoffer
MMP9 målrettede monoklonale antistoffer ble generert ved immunisering av mus med rekombinante humane eller mus MMP9 proteiner, og søker antistoffer ble identifisert ved
in vitro
screening for målet binding, hemming av underlaget proteolyse, og selektivitet vs andre familiemedlemmer MMP. Utvelgelsesprosessen ga AB0041, som hemmer både menneskelig MMP9 (hMMP9) og rotte MMP9 (rMMP9), men binder seg ikke til mus MMP9 (mMMP9); og AB0046, som omvendt inhiberer mMMP9, mens ikke binding til rMMP9 eller hMMP9 (tabell 1). Begge antistoffer hadde høy affinitet og god potens: for AB0041 målretting hMMP9, K
D (app) = 0,133 ± 0,030 nM og IC
50 = 0,172 ± 0,007 nM, og for AB0046 målretting mMMP9, K
D (app) = 0,218 ± 0,097 nM og IC
50 = 0,029 ± 0,005 nM (tabell 1). AB0041 og AB0046 var svært selektiv, med mer enn 500 ganger høyere selektivitet for MMP9 vs. andre familiemedlemmer MMP (inkludert svært homolog MMP2) (tabell 1 og tabell 2). Begge antistoffer oppførte seg som ikke-konkurrerende inhibitorer, for eksempel IC
50-verdier ble generert mot enzymaktiviteten på et peptidsubstrat ble ikke vesentlig påvirket av substrat-konsentrasjoner i området 1-20 pM (figur 1A). I tillegg er begge antistoffene hemmet MMP9-formidlet kløyving av det fysiologisk relevante substrater gelatin og grunnmembranen collagen IV, med potenser som ligner de som ble generert på peptidsubstratet analysen. IC
50 av AB0041 var 0,34 ± 0,061 nM for gelatin spaltning (figur 1B) og 0,30 ± 0,025 nM for kollagen IV spaltning (figur 1C), og IC
50 av AB0046 for gelatin spaltning var 0,26 ± 0,018 nM (figur 1B). Mus MMP9 ikke fordøye menneskelig kollagen IV, så AB0046 ikke ble vurdert i denne analysen.
