Abstract
desmoglein 3 (DSG3) er en del av desmosom, som gir sterk celle-celle adhesjon. Tidligere har en onkogen funksjon av DSG3 blitt funnet i hode-hals-kreft (HNC). Her undersøkte vi hvordan dette molekylet bidrar til ondartet fenotype. Fordi DSG3 er assosiert med plakoglobin, undersøkte vi om disse fenotypiske endringer ble formidlet gjennom plakoglobin molekylet. Immunpresipitasjon og immunfluorescens farging avslørte at DSG3 lyddemping avbrutt sin interaksjon med plakoglobin og indusert plakoglobin trans fra cytoplasma til kjernen. Knockdown av DSG3 økt betydelig samspillet av plakoglobin med transkripsjonsfaktoren TCF og undertrykte TCF /LSF transkripsjonen aktivitet. Disse effektene ytterligere dratt til redusert uttrykk av TCF /LEF nedstrøms målgener, inkludert c-myc, cyclin D1, og MMP-7. Funksjonelle analyser viste at DSG3 lyddemping redusert cellevekst og arresterte cellene ved G0 /G1 fase. Dessuten celle migrasjon og invasjon evner ble også redusert. Disse cellulære resultatene ble bekreftet ved hjelp tumorxenotransplantater i mus, som DSG3 stanse førte til undertrykte tumorvekst, plakoglobin trans og redusert uttrykk for TCF /LEF målgener i svulster. Derfor viser vår studie at desmosomal protein DSG3 funksjoner i tillegg til å regulere ondartede fenotyper via kjernesignalering. I konklusjonen, fant vi at DSG3 fungerer som et onkogen og letter kreft vekst og invasjonen i HNC celler gjennom DSG3-plakoglobin-TCF /LSF veien
Citation. Chen YJ, Lee LY, Chao YK, Chang JT Lu YC, Li HF, et al. (2013) DSG3 Forenkler kreft celle vekst og invasjon gjennom DSG3-Plakoglobin-TCF /LSF-Myc /Cyclin D1 /MMP signalveien. PLoS ONE 8 (5): e64088. doi: 10,1371 /journal.pone.0064088
Redaktør: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Children Hospital Medical Center, USA
mottatt: 07.12.2012; Godkjent: 10 april 2013; Publisert: May 30, 2013
Copyright: © 2013 Chen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Chang Gung Memorial Hospital (tilskuddsordninger tall CMRPD1A0641 og CMRPD190391-2) og fra Department of Health i Taiwan (tilskudd nummer DOH99-TD-C-111-006). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
desmoglein 3 (DSG3) er en av komponentene i desmosom. Desmosomes er knapp-like interessante inter kontakt som tillater å feste cytoskeletal elementer til plasmamembranen på områder av celle-celle. Ved forankring til belastningsbærende mellomliggende filamenter, desmosomer gi sterk intercellulær adhesjon for å opprettholde vev integritet og homeostase [1] – [3]. Desmosomer er sammensatt av proteiner fra minst tre forskjellige genfamilier: cadherins (f.eks DSG1-4 og DSC1-3), armadillo proteiner (f.eks plakoglobin og forskjellige plakophilins), og plakins (f.eks desmoplakins, envoplakin, og periplakin). Disse desmosomale proteinene er koordinert og forbundet med hverandre for å danne desmosom. Den resulterende supracellular stillas spiller en nøkkelrolle i å gi mekanisk integritet til vev [1] – [3]. I tillegg til sin rolle i celle-celle-adhesjon, kan cadherin og armadillo proteinene fungerer som molekyl transdusere for å konvertere en ekstracellulær hendelse inn i intracellulære signaler [4]. For eksempel har halen av DSG3 er vist bundet plakoglobin [1] – [3]. Plakoglobin er nært knyttet til p-catenin, noe som er et velkjent nedstrøms effektor-molekyl i kanonisk Wnt signalveien [5]. Derfor er det mulig at DSG3 kan transdusere molekyl meldinger gjennom plakoglobin signalveien.
Flere rapporter har funnet at desmosomale proteiner blir unormalt uttrykt i ulike kreftformer. Mens noen etterforskere har rapportert at uttrykket av desmosomale proteiner er redusert hos kreftformer, andre har funnet at uttrykket er økt. For eksempel har det blitt rapportert nedregulert av dsc2 i kolorektal cancer [6], DSC3 i bryst og munnhule kreft [7], [8], og DSG2 i magekreft [9], [10]. Imidlertid, over-ekspresjon av DSG2 eller DSG3 er også blitt vist i en rekke kreftformer, inkludert hud, prostata, lunger og hode-hals-kreft [11] – [14]. Alle disse studiene tyder på at feilregulering av desmosomale proteiner spiller en rolle under kreftutvikling. I samsvar med andre rapporter har vi tidligere funnet at DSG3 fungerer som et onkogen i hode og nakke kreft og er assosiert med avansert klinisk stadium [15]. I denne studien har vi undersøkt videre hvordan dette molekylet bidrar til kreft formasjon. Våre resultater viste at DSG3 fremmer kreftcellevekst og invasjon gjennom en plakoglobin-mediert signalveien. Disse effektene førte til endring av TCF /LEF transkripsjonen aktivitet og således endret uttrykk for nedstrøms-molekyler, inkludert c-myc, cyclin D1, og MMP-7, som kan føre til maligne fenotyper.
Materialer og Metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP, shRNA konstruksjon, og mobilnettet transfeksjon
To hode og nakke kreft cellelinjer, OECM1 og SAS [16], ble brukt. De OECM1 Cellene ble holdt i RPMI 1640 medium, og SAS cellene ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle Media. Alle media ble supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og antibiotika (100 U /ml penicillin, 100 U /ml streptomycin, og 0,25 g /ml amfotericin B), og cellelinjer ble dyrket i en fuktig atmosfære ved 37 ° C med 5% CO
2.
shRNA sekvens målrettet mot DSG3 (shDSG3), som har blitt tidligere beskrevet [15], ble subklonet inn i en pCI-neo-plasmid og brukt til å etablere shDSG3 stabilt transfekterte cellene . Plakoglobin målrettet shRNA var utformet som en 22-nt sense- og antisense hårnål som var komplementære til den plakoglobin mRNA sekvensen 5′-GGA TGC CCA GCG CCA CGT AGC T-3 «, og ble klonet inn i pTOPO-U6 plasmid vektor, som beskrevet tidligere [15].
for plasmidet transfeksjon ble cellene sådd ut ved en tetthet på 5 x 10
5 i en 100 mm skål og dyrket i 16 timer. Når cellene nådde 60% konfluens, ble de transfisert med 6 ug plasmid eller shRNA den tomme vektoren plasmidet ved hjelp av Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) i Opti-MEM redusert serum media (Invitrogen, Carlsbad, CA). Etter 16 timer ble Opti-MEM media erstattet med friskt komplett medium. De stabile transfekterte celle kloner ble valgt ved hjelp av en neomycin reagens, G418 antibiotisk løsning (Sigma, St. Louis, MO, USA).
Pasienter og bestemmelse av proteinuttrykk i kliniske vev
Undersøkelsen var godkjent av Institutional Review Board of Chang Gung Memorial Hospital, og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle deltakerne. Ni biopsi vev fra hode-hals kreftpasienter besøkte på hode-nakke kirurgi klinikker i Chang Gung Memorial Hospital (Taoyuan, Taiwan) ble oppnådd, inkludert fire grovt normal slimhinne og fem kreftprøver. Vevsproteiner ble ekstrahert og underkastet immunoblotanalyse for bestemmelse av DSG3, plakoglobin, c-myc, cyclin D1, og MMP-7, som beskrevet nedenfor.
Cellular proteinekstraksjon, immunoutfelling og immunoblotanalyse
metodene for proteinekstraksjon, immunoutfelling og immunoblot ble utført på samme måte som tidligere beskrevet [17], [18]. I korthet ble cellene homogenisert i CHAPS lyseringsbuffer, inkubert på is i 30 minutter, og sentrifugert for å oppnå de cellulære proteiner. For fraksjonering av kjerneproteiner ble commencial NE-PER kjernefysiske og cytoplasma utvinnings reagenser (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) som brukes i henhold til produsentens foreslåtte protokoll. For å fremstille immunoutfellingsstudier kulene, ble 30 ul protein A /protein-G Sepharose-kuler konjugert med 4 ug av spesifikke antistoffer (klon 5H10 for DSG3, klon H80 for plakoglobin, klon H125 for TCF4, Santa Cruz Biotech, CA). For immunoutfelling, ble 1 mg av den cellulære proteinekstrakt inkubert med 30 pl av den spesifikke protein A /G-protein-kuler til 4 timer ved 4 ° C. Perlene ble oppsamlet ved sentrifugering, resuspendert i en prøvebuffer og underkastet immunoblotanalyse. Ikke-immuniserte mus eller kanin serum-IgG ble anvendt som en negativ kontroll for å bestemme den spesifikke effekten av immunopresipitering.
For immunoblotanalyse, 30 ug av cellulært protein ble separert ved anvendelse av 8% SDS-polyakrylamid-gel-elektroforese og overført til en nitrocellulosemembran. Membranen ble hybridisert med en av de følgende primære antistoffer: klon 5H10 for DSG3, klon H1 for plakoglobin, klon M-20 for Cyclin D1, klone 9E10 for c-myc (Santa Cruz Biotech, CA), eller klon MAB3315 for MMP- 7 (Millipore, MA). Membranen ble deretter inkubert med et sekundært antistoff konjugert med pepperrot peroksidase (Santa Cruz Biotech, CA). Proteinet bildet ble utviklet ved hjelp av en renessanse Western Blot Chemiluminescence Reagent Kit (NEN Life Science Produkter, MA) og autoradiografi. Tettheten av hvert protein bandet ble bestemt etter normalisering til en Actin kontrollbåndet ved hjelp av Gel Bilde System og Image J programvare (Scion Corporation, MD).
Cell vekst, kolonidannelse, og flowcytometri analyse
vekst og kolonidannelse analyser ble utført som tidligere beskrevet [19], [20] Celler ble sådd ut ved en tetthet på 5 x 10
5 i 100 mm skåler, og omfanget av celleveksten ble bestemt daglig ved hjelp en hemocytometer. For kolonidannelse analyse, ble totalt 1000 celler utsådd i 6-brønners plater og tillatt å vokse uten å bli beveget i 7 dager i fullstendig kulturmedium inneholdende 20% FBS. Antallet cellekolonier ble tellet etter farging med 5% krystallfiolett i 15 min.
Strømningscytometri-analyse ble utført som tidligere beskrevet [21]. I korthet, etter synkronisering av celler ved G0 /G1 fase av serum sult, cellene ble deretter høstet ved forskjellige tidspunkter (en 6-timers intervall for OECM1 celler og en 3-timers intervall for SAS-celler). Cellepelletene ble fiksert med etanol, permeabilisert med Triton X-100 og RNase, og deretter inkubert med propidiumjodid (PI) for nukleær farging. Prøvene ble umiddelbart analysert ved hjelp av en FACScan strømningscytometer (Becton Dickinson, San Jose, California). Fordelingen av cellesyklus faser ble bestemt ved bruk av Cell quest Pro og ModiFit programvare. To uavhengige eksperimenter ble utført for hver datapost.
Cellemigrering og invasjons assays
cellemigrering og invasjons analyser ble utført som tidligere beskrevet [19]. Kort sagt ble cellemigrasjon analyser utført ved anvendelse av Transwell polykarbonat kamre (Becton Dickinson Biosciences). Celler ble sådd ut i en 6-brønns plate med Transwell innsatser som hadde en porøs polykarbonatmembran (8 mikrometer størrelse) og inkubert i vanlige medier. Etter 24 timer ble celler som hadde migrert til undersiden av Transwell innsatser fiksert med glutaraldehyd, farget med krystallfiolett, og fotografert.
celle invasjon Analysen ble utført ved hjelp av de BD BioCoat Matrigel invasjons kammere (Becton Dickinson biovitenskap, Bedford, MA) og Millicell invasjon kammeret (Millipore Corporation, Bedford, MA). Membranen av den Millicell øvre kammer innsatsen, som har en porestørrelse på 8 um, ble anbrakt i en 24-brønns plate og belagt med Matrigel. Celler ble sådd ut i de øvre kamrene med media inneholdende 1% FBS. De nedre kammer inneholdt komplett kultur media (10% FBS) for å felle de invaderende cellene. Invasjonen evnen til cellene ble bestemt hver 24. time ved å telle celler i hjertekamrene som hadde bestått gjennom Matrigel-belagte membran.
immunfluorescens og konfokalmikroskopi
immunfluorescens og konfokalmikroskopi analyse ble utført som tidligere beskrevet [22]. I korthet, at dekkglass ble først belagt med poly-L-lysin og formaldehyd. De fikserte celler ble deretter permeabilisert med Triton-X-100 og blokkert med bovint fosterserum. Objektglassene ble inkubert med et anti-DSG3 (klon 5H10), et anti-plakoglobin (klon H-80, Santa Cruz Biotech), et anti-β-catenin (klon E5), eller et anti-TCF4 (cloneD4) antistoff, og farget med fluorescein-isotiocyanat (FITC) – eller et rhodamin-konjugert sekundært antistoff. Objektglassene ble montert sammen med monterings media inneholdende DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Fluorescens ble visualisert ved hjelp av en confocal laser mikroskop (Leica TCS Sp2 MP).
Luciferase reporter analysen for TCF promoter aktivitet
For å bestemme TCF promoter aktivitet, TOPflash (TOP) og den negative kontroll motpart FOPflash (FOP) reporter plasmider (Millipore, Corporation, Bedford, MA) ble brukt. TOP plasmid inneholdt TCF bindingsseter, mens FOP inneholdt mutant, inaktive TCF bindingssteder. De shDSG3 stabile celler eller plakoglobin knockdown-celler ble transfektert med opp eller FOP rapportør plasmider, sammen med thymidin-kinase-promoter-Renilla luciferase reporter plasmid (Promega, Madison, WI) som en intern kontroll. Etter 48 timer ble cellene høstet, og TOP /FOP aktiviteter ble målt ved hjelp av Dual-luciferaserapportørplasmid analysesystem i kombinasjon med GloMax 20/20 Luminometer i henhold til produsentens instruksjoner (Promega). Den TOPflash eller FOPflash aktivitet ble normalisert mot Renilla luciferase aktivitet, og dobling i TOP forhold til FOP reporter plasmid (TOP /FOP) ble rapportert.
Mus xenograft modeller og immunhistokjemisk analyse av xenopodet svulster
Alle dyr prosedyrer ble godkjent av IACUC (Institutional Animal Care og bruk Committee) ved Chang Gung University og fulgt retningslinjene i vår institusjonens forskningsrådet for omsorg og bruk av forsøksdyr. Et minimalt antall mus ble benyttet for undersøkelsen, og alle forsøk ble gjennomført for å redusere lidelse. Fremgangsmåten for generering av xenotransplantater ble utført som tidligere beskrevet [23]. Kort sagt ble en total av seks hann BALB /C-null-mus ved 5 ukers alder anvendt i eksperimentet. En total av 5 x 10
5 stabil DSG3 lyddemping (shDSG3) celler eller stabil vektor-transfiserte celler ble injisert subkutant inn i den øvre del av bakbenet. Svulsten størrelse ble overvåket daglig ved å beregne volumet som lengde × bredde × høyde ved hjelp av målepunktene. Den tumorvekt ble målt etter at musene ble avlivet på dag 38. xenograft tumorer ble fjernet og underkastet immunhistokjemi (IHC) eller western blot-analyse.
IHC ble utført som tidligere beskrevet [24]. Kort sagt ble vevsprøver fiksert i en formaldehydoppløsning og innstøpt i parafin. Snittene ble deparaffinized med xylen, kokt i citrat-buffer for å hente antigener, og blokkert med hydrogenperoksyd. Platene ble deretter inkubert med primære antistoffer. Følgende primærinnsidere antistoffer ble brukt: anti-DSG3 (klone 32-6300, Zymed Laboratories Inc., CA, USA), anti-c-myc (klone 9E10, Santa Cruz Biotech, CA, USA), anti-cyclin D1 (klone M20, Santa Cruz Biotech, CA, USA), eller anti-MMP-7 (MAB3315, Millipore, Corporation, Bedford, MA). IHC analyse og fargeutviklingen ble utført ved hjelp av en Dako Envision system (Dako, Carpinteria, CA) etter produsentens anvisninger. Antistoff fortynningsmidler ble byttet ut med de primære antistoffene som negative kontroller, og deretter motfarget med hematoksylin (HE). Fargereaksjonene ble bestemt ved mikroskopisk undersøkelse.
Statistisk analyse
De statistiske analysene ble utført ved bruk av Student t-test for å sammenligne to sett av data mellom forskjellige prøver. Alle p-verdiene var tosidig. En
p
verdi. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
DSG3 lyddemping forstyrrer sin interaksjon med plakoglobin og induserer plakoglobin trans til Nucleus
For å demonstrere cellefunksjon DSG3, etablerte vi shDSG3 stabilt uttrykker celler avledet fra valg av HNC cellelinjer OECM1 og SAS etter transfeksjon av shRNA targeting DSG3. Effekten av DSG3 knockdown er vist i Figur 1A. I OECM1 celler, begge kloner (SH1 og SH2) viste signifikant knockdown av DSG3 (mer enn 90%) sammenlignet med celler transfektert med den tomme vektoren. I SAS celler, SH1 og SH2 redusert DSG3 ekspresjonen til 60% og 30%, respektivt. Derfor brukte vi OECM1-SH1 og SAS-SH2 klone celler i hele videre studier.
(A) DSG3 uttrykk ble undertrykt i shDSG3 celler ved hjelp av RNAi. OECM1 og SAS-celler ble transfektert med den DSG3 spesifikke shRNA ekspresjonsplasmid eller tom vektor plasmidet, og kloner ble valgt ut ved hjelp av G418. Fire kloner (OECM1-SH1 og OECM1-SH2 i OECM1 celler og SAS-SH1 og SAS-SH2 i SAS celler) av shDSG3 celler ble valgt og analysert ved hjelp av Western blot analyser for å bestemme DSG3 proteinnivå. To kloner (OECM1-V i OECM1 celler og SAS-V i SAS-celler) av vektoren-transfekterte celler ble også valgt som kontroller. Aktin Proteininnholdet ble bestemt som en intern kontroll for proteinekspresjon. (B) DSG3 stanse redusert interaksjon av DSG3 med plakoglobin, som bestemt ved immunutfelling (IP) og immunoblot (IB) analyse. To sett av celler ble undersøkt, tom vektor-transfekterte celler og shDSG3-transfekterte celler. I hver prøve, ble proteinene ekstrahert og immunopresipitert med anti-DSG3 (D3), anti-plakoglobin (Pg), muse IgG (IgG) (som en negativ kontroll), som angitt ovenfor, hver kjørebane. Hver prøve ble deretter immunoblottet med enten en plakoglobin (Pg) – eller DSG3 (D3) -spesifikk antistoff, som angitt på venstre side av hvert sett av prøver. (C) DSG3 lyddemping indusert plakoglobinn trans fra cytoplasma til kjernen. Immunfluorescens og Konfokalmikroskopi ble brukt for å undersøke lokalisering av DSG3 og plakoglobin i begge tomme vektor-transfektert og shDSG3-transfekterte celler. DSG3 ble påvist ved anvendelse av en DSG3-spesifikt primært antistoff med et FITC-konjugert sekundært antistoff og er vist i grønt. Plakoglobin ble påvist ved anvendelse av en plakoglobin-spesifikt primært antistoff med rhodamin-konjugert sekundært antistoff og er vist i rødt. DAPI farging ble utført for nukleær farging og vises i blått. Bildene ble slått sammen for å identifisere subcellulære lokalisering av DSG3 og plakoglobin. Målestokk indikerer størrelsen som 40 mikrometer. (D) Total og kjerneproteinekstrakt ble anvendt for å undersøke plakoglobin nivå av immunblot-analyse. Protein tetthet ble målt ved bilde J programvare. Totalt proteinekstrakter ble normalisert med aktin; atomproteinekstrakter ble normalisert med HDAC å beregne relative ekspresjonsnivået.
Siden DSG3 er en komponent av desmosom og samhandler med andre desmosomale proteiner, slik som plakoglobin, for å opprettholde celle-celle adhesjon. Vi undersøkt hvorvidt den signalveien fra DSG3 ble mediert gjennom dets interaksjon med nedstrøms molekylet plakoglobin. Som vist i figur 1B, DSG3 stanse hadde ingen signifikant effekt på ekspresjonsnivået av plakoglobin. Når proteinprøver fra de tomme vektor-transfiserte celler ble immunopresipitert med en DSG3-spesifikt antistoff og immunoblottet med en plakoglobin-spesifikt antistoff, er disse to molekyler interaksjon med hverandre. I shDSG3 cellene, DSG3 oppviste en mye svakere forbindelse med plakoglobin enn i de tomme vektor-transfekterte celler. Lignende resultater ble også funnet i den motsatte eksperimentet. Når proteinprøver ble immunopresipitert med en plakoglobin-spesifikt antistoff og immunoblottet med en DSG3-spesifikt antistoff, selv om interaksjoner ble funnet mellom disse to molekyler i de tomme vektor-transfekterte og den shDSG3 cellene, shDSG3 cellene viste en mye svakere krets. Resultatene indikerte at DSG3 knockdown forstyrrer samspillet mellom DSG3 og plakoglobin.
Forstyrrelse av samspillet mellom DSG3 og plakoglobin i sh-D3-celler ble ytterligere demonstrert ved hjelp av immunfluorescens. Som vist i de sammenslåtte nukleær farging og fluorescens bilder i figur 1C, DSG3 og plakoglobin samlokalisert på cellemembranen i kontrollcellene. I de sh-D3-celler, ble denne co-lokalisering ikke observert. I stedet knockdown av DSG3 lettes plakoglobin translokasjon fra cellemembranen til desmosom knutepunkter til kjernen. Videre ble totalt protein og kjernekraft proteinekstrakter undersøkt plakoglobin fordeling av immunoblot analyse. I figur 1D, plakoglobin nivå forhøyet i kjerneproteinekstrakt i sh-D3-celler enn vektorkontrollceller, men mengden av plakoglobin i total proteinfraksjon fant ingen signifikant forskjell mellom sh-D3 og vektorkontrollceller. Disse resultatene antydet at DSG3 knockdown forstyrrer sin interaksjon med plakoglobin og induserer plakoglobin translokasjon til kjernen
DSG3 knockdown øker samspillet av plakoglobin med transkripsjonsfaktoren TCF
Plakoglobin er nærmeste virveldyr slektning av β -catenin, som er et nedstrøms effektor-molekyl i den kanoniske Wnt signalveien, selv om de har forskjellige potensialer transaktivering [25] – [28]. Wnt signale initierer en kaskade av hendelser som tillater β-catenin å flykte fra proteasom-mediert nedbrytning, som normalt sikrer at det er bare et lavt nivå av basal β-catenin i cytoplasma. β-catenin er da i stand til å translocate til kjernen hvor det komplekser med T-celle faktor /lymfoide Enhancer bindende faktor (TCF /LSF) familie transkripsjonsfaktorer og aktiverer transkripsjon av målgener [25], [28]. Vi undersøkte derfor om plakoglobin kjernefysisk trans utløst av knockdown av DSG3 påvirker samspillet mellom plakoglobin og transkripsjonsfaktoren TCF. Immunoutfellingen og Immunoblotanalyse metoder ble anvendt for å undersøke både OECM1 (figur 2A) og SAS-celler (figur 2B). Som vist, DSG3 stanse økt binding av TCF4 med plakoglobin men det hadde ingen signifikant effekt på samspillet med β-catenin. Immunfluorescens analyser avslørte også konsistente resultater. Sammenlignet med kontroll celler transfektert med vektoren, knockdown DSG3 økte mengden av plakoglobin i kjernen, som hadde blitt vist fremtredende ko-lokalisering med transcriptional faktor TCF4 (figur 2C). Disse resultatene antydet at knockdown av DSG3 indusert plakoglobin trans i kjernen, noe som førte til økt binding til transkripsjonsfaktoren TCF.
(A, B) knockdown av DSG3 økt plakoglobin binding til TCF4 Transkripsjonsfaktor, som bestemmes av immunoutfelling (IP) og immunoblot (IB) analyse som bestemt i OECM1 (A) og (B) SAS-celler. Cellulære ekstrakter av vektoren eller den shDSG3 stabile transfekterte celler ble immunopresipitert med anti-TCF4, kanin IgG (IgG) (som en negativ kontroll) og deretter immunoblottet med plakoglobin eller β-catenin antistoff. (C) immunfluorescens og Konfokalmikroskopi ble brukt for å undersøke samspillet mellom plakpglobin og TCF4. Vektor eller shDGS3 stabile transfekterte celler ble co-farget med enten plakoglobin og TCF4 antistoffer. Etter vasking ble platene inkubert med rhodamine- eller FITC- konjugert sekundært antistoff. DAPI farging ble utført for nukleær farging. Målestokk indikerer størrelsen som 40 mikrometer.
DSG3 lyddemping undertrykker TCF /LSF transkripsjonen aktivitet og nedstrøms målgener c-myc, cyclin D1, og MMP-7
videre undersøkt om plakoglobin kjernefysisk trans utløst av DSG3 lyddemping også induserte virkninger på TCF /LSF transkripsjonen aktivitet. Siden rolle plakoglobin på Wnt banen ikke er godt definert, identifiserte vi derfor funksjonen av plakoglobin på TCF /LSF transkripsjonen aktivitet. Den TOPflash /FOPflash luciferase reporter-analysen ble anvendt for [28]. Som vist i figur 3A, knockdown av plakoglobin uttrykk økte TCF /LEF transkripsjonen aktivitet i løpet av to-fold i begge OECM1 og SAS-celler etter en dag. Disse resultatene antydet at i motsetning til p-catenin, plakoglobin fungerer som en negativ regulator av Wnt signalisering og TCF /LSF transkripsjonen svei.
(A) og (B) Virkningen av TCF /LEF transkripsjonen aktivitet etter Plakoglobin eller DSG3 knockdown. Den stabile plakoglobin lyddemping (sh-Pg) eller DSG3 lyddemping (sh-D3) celler ble transfektert med TOPflash eller FOPflash luciferase reporter plasmid og Renilla plasmid. Etter 24 timer ble luciferase aktiviteten bestemmes ved hjelp av Steady-Glo Luciferase Reagens. Firefly luciferase aktiviteten ble normalisert mot Renilla luciferase aktivitet og dobling av TOPflash aktivitet i forhold til FOPflash aktivitet ble rapportert. (C) og (D) Et uttrykk for TCF /LEF nedstrøms målgener c-myc og cyclin D1 ble bestemt i celler som er stabilt transfektert med spesifikk shRNAs mål å plakoglobin (SH-Pg) eller DSG3 (sh-D3) celler, i forhold til vektoren transfektert stabilt celler. I hver prøve, ble proteiner trukket ut og analysert ved Western blot analyser for å bestemme uttrykket nivåer av c-myc, cyclin D1, og MMP-7.
Den potensielle effekten av DSG3 stanse på TCF /LEF transkripsjonen aktivitet ble undersøkt. Som vist i figur 3B, knockdown av DSG3 trykkes TCF /LSF transkripsjonen aktivitet til et nivå på 53% av kontrollcellene i OECM1-celler og 59% i SAS-celler etter en dag. Sammen med tidligere studier, disse resultatene viste at DSG3 knockdown avbrutt sin interaksjon med plakoglobin (figur 1B), forårsaker plakoglobin atom import (figur 1C), tilrettelegging for samspill med TCF (figur 2), og som fører til forbedring av sin undertrykkende effekt på TCF /LSF transkripsjonen aktivitet (figur 3B).
for ytterligere å undersøke hvordan DSG3 regulerer plakoglobin-TCF /LSF signalveien som fører til endringer i mobilnettet homeostase, vi undersøkte flere TCF nedstrøms målmolekylene, inkludert c-myc , cyklin D1, og matriks-metalloproteinase-7 (MMP-7) [29] – [31], som alle har viktige funksjoner på cellevekst og invasjon. Som bestemmes av western blot analyse, plakoglobin stanse betydelig økt uttrykk av c-myc, cyclin D1, og MMP-7 i OECM1 og SAS cellelinjer (figur 3C), mens DSG3 stanse trykkes uttrykk for disse proteinene i begge cellelinjer (Figur 3D). Disse resultatene antydet at DSG3 stanse trykt TCF /LSF transkripsjonen aktivitet, noe som vil ytterligere hemme uttrykk for nedstrøms molekyler c-myc, cyclin D1, og MMP-7.
DSG3 lyddemping hemmer cellevekst og induserer celle syklus arrest i G0 /G1 fase
Siden DSG3 har vist som en molekylær svinger for å regulere uttrykk for c-myc, cyclin D1 og MMP7 undersøkte vi om dette molekylet fungert i cellevekst regulering. Som vist i figur 4A, DSG3 stanse trykkes cellevekst av OECM1 celler med 64% på dag 3 og undertrykket cellevekst av SAS-celler med 76% på dag 3. Dette fenomenet ble ytterligere understøttet ved hjelp av kolonidannelse analyser viste at 90% veksthemming i OECM1-shD3 celler og 80% vekst hemninger i SAS-shD3 celler. For å undersøke effekten av DSG3 på cellesyklusregulering, strømningscytometri-analyse ble utført. Som vist i figur 4B, knockdown av DSG3 resulterte i celler som arrestert i G0 /G1 fase, som vist ved forsinkelsen i å gå inn i S-fasen. OECM1 cellene begynte å gå inn i S-fasen på 12 timer (45,0%), mens OECM1-shD3 celler ikke startet inngåelse S-fasen inntil ca 18 timer (49,3%). Tilsvarende SAS cellene begynner å gå inn i S-fasen på 3 timer (48,9%), mens SAS-shDSG3 celler ikke inngå S-fasen inntil ca 6 timer (40,27%). Disse resultatene antydet at DSG3 knockdown hemmet cellevekst ved å arrestere celler i G0 /G1 fasen forsinket skriv til S-fasen.
(A) Celleveksten ble redusert i shDSG3 celler. Totalt 10
5 celler av tom vektor-transfiserte eller shDSG3-transfekterte (sh-D3) celler ble sådd på en 10 mm plate og dyrket i 3 dager. Eksperimenter ble utført i tre eksemplarer (***, p 0,001) (øvre panel). Kolonidannelse ble redusert i shDSG3 celler. En total på enten 1000 tom vektor-transfiserte celler eller shDSG3-transfektert (sh-D3) celler ble sådd inn i en 6-brønns plate og inkubert i 7 dager for å tillate kolonidannelse. Cellekolonier ble visualisert og tellet etter farging med 5% krystallfiolett. (***, P 0,001) (Nedre panel). (B) cellesyklus arrestert på G0 /G1 fase i shDSG3 celler. De shDSG3 (sh-D3) celler (5 x 10
5 celler pr 10 cm plate) ble synkronisert i G0 /G1 fase ved å dyrke dem i serum-fritt medium i 24 timer. Den cellekulturmedier ble deretter endret til å fullføre media for å tillate cellene å gå inn i cellesyklus. Celler ble samlet opp hver 6. eller 3 timer, og deres cellesyklus status ble bestemt ved hjelp av flow cytometri. (C) Et cellemigrering egenskaper ble redusert i shDSG3-celler, som bestemt ved anvendelse av en Transwell migrasjonsanalyse. Enten tom vektor-transfiserte eller shDSG3-transfekterte (sh-D3) celler ble sådd ut ved en tetthet på 10
5 celler per brønn i en 6-brønns plate med Transwell innsatser som hadde en porøs polykarbonatmembran (8 mikrometer størrelse) og inkuberes i vanlig media. Etter 24 timer ble celler som hadde migrert til undersiden av Transwell innsatser farget med krystallfiolett. Hvert forsøk ble utført in triplo. (***, P 0,001). (D) Den celle invasjon egenskaper ble redusert i shDSG3-celler, som bestemt ved anvendelse av en Matrigel invasjon assay. Enten tom vektor-transfiserte eller shDSG3-transfekterte (sh-D3) celler ble sådd ut ved en tetthet på 10
5 celler per brønn i en 24-brønns plate med Matrigel-belagte Millicell invasjons kammer og inkubert ved 37 ° C i 24 timer. Antallet av celler som migrerte gjennom Matrigel til det nedre kammer ble bestemt hver 12. og 24 timer. Hvert forsøk ble utført i tre eksemplarer (***, p 0,001).
DSG3 lyddemping hemmer cellemigrasjon og invasjon
Siden DSG3 funksjoner i celle-celle interaksjoner, vi undersøkt om DSG3 knockdown påvirket celle migrasjon og invasjon. Cellemigrasjons Resultatene fra Transwell analyse er vist i figur 4C. Vandringen av to sh-D3-cellelinjer ble dramatisk redusert etter 24 timer når sammenlignet med kontrollcellelinjer. Den celle invasjon Resultatene fra Matrigel analyse er vist i figur 4D.
