Abstract
Genistein (GEN) er en plante-avledet isoflavon og kan blokkere ukontrollert cellevekst i tykktarmskreft ved å hemme WNT signalveien. Målet med studien var å teste hypotesen om at den økte genekspresjon av WNT signalveien antagonist, er DKK1 av genistein behandling forbundet med epigenetiske modifikasjoner av genet i tykktarmskreftceller. Genistein behandling induserte en konsentrasjonsavhengig G2 fase arrest i den humane koloncancer cellelinje SW480 og redusert celleproliferasjon. Resultater fra flere andre menneskelige tykktarmskreftcellelinjer bekreftet veksthemmende effekten av genistein. Overekspresjon av DKK1 bekreftet sitt engasjement i veksthemming. Knockdown av DKK1 uttrykk av siRNA litt indusert cellevekst. DKK1 genekspresjon ble økt med genistein i SW480 og HCT15 celler. DNA-metylering ved DKK1 promoteren ble ikke påvirket av genistein behandling i alle cellelinjene som ble testet. På den annen side, genistein indusert histon H3-acetylering av den DKK1 promoter-regionen i SW480 og HCT15 celler. Dette indikerer at økt histon acetylering er knyttet til genistein-indusert DKK1 ekspresjon. Sammenhengen mellom histone acetylering og DKK1 genuttrykk er bekreftet av histondeacetylase inhibitor trichostatin A (TSA) behandling. Som konklusjon, minker genistein behandling cellevekst og proliferasjon i colon cancercellelinjer. Effekten er assosiert med økt DKK1 uttrykk gjennom induksjon av histone acetylering på DKK1 promoter omegn
Citation. Wang H, Li Q, Chen H (2012) Genistein Påvirker histonmodifikasjonene på Dickkopf-Related Protein 1 (DKK1) Gene i SW480 Menneskelig Colon Cancer Cell line. PLoS ONE syv (7): e40955. doi: 10,1371 /journal.pone.0040955
Redaktør: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, USA
mottatt: 21 mars 2012; Godkjent: 15 juni 2012; Publisert: 18.07.2012
Copyright: © 2012 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble finansiert delvis av en NIH /NCI tilskuddet til HC (CA135262) og Illinois Soybean Association. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Soya inneholder forskjellige bioaktive komponenter, noe som har fått mye oppmerksomhet i deres potensielle evne til å redusere risikoen for kreft [1], [2]. Epidemiologiske studier har vist at inntak av høyere nivåer av kostsoyaprodukter bidrar til lavere forekomst av kolorektal kreft i asiatiske land [3], [4], [5]. Nærmere bestemt, genistein (4, 5, 7-trihydroksy-isoflavon), en naturlig isoflavon rikelig i soya, har vist seg å redusere tykktarmskreft [6], [7]. Disse studiene gir sterke bevis for behovet for ytterligere å undersøke mekanismene bak genistein er kreft potensial.
I cellekulturstudier har genistein blitt rapportert å endre cellefysiologi i flere tykktarmskreftcellelinjer. En fersk undersøkelse utført av Fan et al. identifisert som tykktarmskreftceller hadde endret morfologi, inkludert kromatin kondens og atom fragmentering etter genistein behandling [8]. I tillegg har høyere konsentrasjoner av genistein av 10 umol /L signifikant induserte inhibering av celleproliferasjon og DNA-fragmentering i en human colon-cellelinje [9]. Videre, i kolon kreftcellelinjer Caco-2 og SW620 ble celledød indusert av soyabønneekstrakt behandling [10]. Derfor blir genistein blir en lovende forbindelse i tykktarmskreft forebygging og behandling. I denne studien har vi ytterligere utforsket antitumor egenskaper genistein ved å teste cellecyklusprogresjonen og celleproliferasjon i flere kolorektal kreftceller i respons på behandling med økende konsentrasjoner av genistein.
Ulike veier og mekanismer har blitt foreslått å være ansvarlig for genistein evne til å redusere kreftrisiko. IGF-IR-signalering, er det AKT-reaksjonsveien, og cellevekstregulering i forbindelse med antitumor virkningene av genistein [9], [11]. I tillegg, genistein også har antioksidantegenskaper ved å etterligne østrogen via østrogen reseptor-mediert fosforylering av ERK1 /2 og aktivering av NFkB signalveien [12]. Ytterligere rapporter fra nyere studier på dyr viste at genistein hemmet hormonavhengig eller-Uavhengig kreftceller ved å regulere samspillet mellom vitamin D og østrogen reseptor [13], [14], [15]. Genistein regulerer gentranskripsjon i ulike kreftcellelinjer av epigenetiske forskrifter, f.eks DNA-metylering og histonmodifikasjonene [16], [17], [18]. Genistein endrer DNA metylering av ulike gener i rotte- og musemodeller [19], [20]. Men fortsatt mekanismene bak genistein rolle i celleproliferasjon eller apoptose under kreft dårlig forstått.
Vingeløse-int (WNT) signalveien består av et stort antall vekstfaktorer som er involvert i organ, spredning, gjenfødelse, celle skjebne bestemmelse og celle-celle-adhesjon [21], [22]. Wnt proteiner binder seg til frizzled reseptorer (Frz) og low-density lipoprotein reseptor-relatert protein (LRP) co-reseptorer, forårsaker cytosolic β-catenin stabilisering og akkumulering. Følgelig atom β-catenin øker og komplekser med TCF /LEF transkripsjonsfaktorer, som fører til økt transkripsjon av målgener, inkludert cyklin D1 [23]. Avvikende WNT signalering er en av de medvirkende til overgangen fra normale kolonepitelet til maligne tumorceller [24], [25]. Genistein ble nylig rapportert å undertrykke WNT signalering i tykktarm kreft cellelinjer [26], [27], noe som gir en mulig mekanisme for genistein er kreft kapasitet.
En av de viktigste regulatorer av Wnt signalveien er dens antagonist Dickkopf 1 (DKK1). DKK1 hindrer β-catenin-mediert signaltransduksjon ved binding til LRP og Kremen proteiner, fremmende cellene differensiering og apoptose [28], [29], [30], [31], [32]. Taushet eller tap av DKK1 er dokumentert i ulike sykdommer. I tykktarmskreft forstummet
DKK1
uttrykk er tett forbundet med mikro ustabilitet av tumor subtyper [33]. Det er rapportert at tumoren suppressing kapasiteten DKK1 blir undertrykt av hypermethylation av dens promoter i avanserte stadier av kolorektal kreft [34]. I humane renale karsinomceller, kjemisk indusering av histon acetylering ved DKK1 promoteren resulterte i gjenaktivering av DKK1 uttrykk, viser at i tillegg til DNA-metylering, kan histon-hale modifikasjoner også bidra til den transkripsjonelle kontroll av kritiske gener relatert til kreftutvikling [ ,,,0],35].
i denne studien har vi undersøkt kreft egenskaper av genistein ved å identifisere dens virkning på kreftcellefysiologi og undersøke mekanistisk grunnlag av
DKK1
aktivering. Spesielt er denne studien blant de første til å lenke genistein-mediert epigenetiske modifikasjoner av
DKK1
til kreft egenskaper av genistein i tykk- og endetarmskreft.
Resultater
Genistein Behandling Selektivt indusert DKK1 Gene Expression men endret ikke DKK1 arrangøren metylering Patterns
for å undersøke sammenhengen mellom DNA metylering på
DKK1
promoter CpG island og effekten av genistein behandling på
DKK1
uttrykk, real-time RT-PCR ble utført for å måle
DKK1
mRNA uttrykk og metylering spesifikk polymerase chain reaction (MSP) og bisulfite sekvensering (BSF) i
DKK1
promoter-regionen ble utført for å undersøke promoteren metyleringen status (fig. 1). Først
DKK1
genekspresjon ble analysert i tilgjengelige tykktarmskreft cellelinjer for å undersøke effektene av genistein behandling. Blant de cellelinjer som ble testet, SW480 og HCT15 celler viste induksjon av DKK1 genekspresjon av genistein (fig. 1A). Analyse av DNA-metylering ved
DKK1
promoter region bekreftet at DKK1 genekspresjon generelt er omvendt relatert til metylering nivået av regionen testet (-159 /+ 109, fig. 1B, 1C og 1D) . Nærmere bestemt, RKO, SW48, og DLD-1-celler utviste meget høy, hvis ikke fullstendig, metylering av regionen (Fig. 1C og 1D). Dette hypermethylation er omvendt relatert til nivået av DKK1 genekspresjon som vist i fig. 1A. For DKK1-uttrykkende cellelinjer HCT15, HT29, og SW480, er det minimalt med DNA-metylering observert (fig. 1C og 1D). Enda viktigere, har genistein behandling ikke endre DNA-metylering av den
DKK1
promoter-regionen i alle cellelinjene som ble testet, uavhengig av nivået av DNA-metylering i regionen (fig. 1C og 1D).
SW480, DLD-en, HCT15, HT29, RKO og SW48 celler ble behandlet med genistein for 2 d før prøvetaking for videre analyse. A) Relativ DKK1 mRNA uttrykk. mRNA-ekspresjon ble analysert ved hjelp av RT-PCR. Data ble normalisert til intern kontroll L7a. Tre uavhengige celleprøver ble analysert og presentert som gjennomsnitt ± SEM. Stjerner (*) indikerer statistisk signifikans sammenlignet med kontroll innenfor den samme cellelinje (p 0,05). B) Skjematisk tegning av DKK1 promoter regionen. Horisontale linjen representerer CpG øy i promotorområdet. De vertikale linjene viser individuelle CpG nettsteder. Svarte pilspisser angir stillingene av primerne anvendt for PCR-amplifikasjoner i for Bisulfite Sequencing (-159 til 109). Piler representerer posisjonene av primerne anvendt for PCR-amplifikasjoner i MSP (-60 + 73). C) MSP av DKK1 promoter-regionen i HCT15, HT29, RKO og SW48. Y-aksen står for metylering nivå og verdiene beregnes som prosentandel av M /(M + UM). Når du ikke sett, feilfelt er i kolonnene. D) Bisulfite sekvensering av DKK1 promoter-regionen i SW480 og DLD-1-celler. Hver åpen sirkel representerer en unmethylated C i et CpG mens en fylt sirkel representerer en metylert C i en CpG. Hver rad med sirkler representerer en individuell klone brukes til sekvensering.
Genistein dose- og tidsavhengig Induced DKK1 Gene Expression
Real-time RT-PCR ble utført for å måle
DKK1
mRNA uttrykk nivåer i respons til forskjellige genistein doser og eksponeringstider. Total,
DKK1
ekspresjon ble økt med genistein i en doseavhengig måte (fig. 2A). Etter 2 d av genistein behandling,
DKK1
mRNA-ekspresjon var tre ganger og åtte ganger høyere følge 50 og 75 umol /L genistein behandlinger respektivt, når sammenlignet med den ikke-genistein kontroll (p 0,05, fig. 2A). MRNA-nivå på
DKK1
i SW480-celler ble også øket ved behandling genistein (75 umol /L) i en tidsavhengig måte (figur 2B.) Og nådde en 10 gangers induksjon ved d 4 sammenlignet til nivået i DMSO kontroll.
A) SW480-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av genistein i 2 dager. mRNA-ekspresjon ble analysert ved RT-PCR. X-aksen indikerer genistein konsentrasjoner og y-aksen viser relative mRNA-ekspresjon nivå. Data ble normalisert til intern kontroll L7a. Stjerne (*) indikerer statistisk signifikans sammenlignet med 0 mikromol /L genistein (
p
0,05). B) Tid løpet av
DKK1
uttrykk i SW480 følgende genistein behandling. SW480-celler ble behandlet med 75 umol /L av genistein og samplet på dag 1, 2, 3 og 4 av behandlingen. Data ble normalisert til intern kontroll L7a. Tre uavhengige eksperimenter ble utført og er presentert som gjennomsnitt ± SEM. Hvor usynlig blir feilfelt som finnes i barene. Stjerne (*) indikerer statistisk signifikans i forhold til d 1 av 75 mikromol /l genistein (
p
0,05). C) DKK1 protein uttrykk. Hele celleproteinekstrakter ble samlet fra SW480 celler og western blot-analyse av DKK1 ble utført som beskrevet i materialer og metoder. En blot fra vestlige Analyse er vist og kvantifisering representerer gjennomsnitt ± SEM fra 3 uavhengige utvalg. Aktin ble anvendt som kontroll lasting. Stjerne (*) indikerer statistisk signifikans sammenlignet med kontroll 0 mikromol /L genistein (
p
0,05).
Induksjon av
DKK1
ble bekreftet av måle dens proteinekspresjon nivå i SW480-celler (fig. 2C). DKK1 proteinekspresjon viste en 3-gangers induksjon ved 75 umol /L av genistein behandling i SW480 celler etter en 4-d behandling når sammenlignet med kontrollen.
Genistein hemmet cellesyklusprogresjon i SW480 celler
for å undersøke effekten av genistein på cellesyklusutvikling av SW480-celler, ble DNA-innhold av SW480-celler målt ved område i form analyse etter flowcytometri analyse. Histogrammene viste at populasjonen av cellene ved G1 ble markert redusert med 75 umol /L av genistein behandling sammenlignet med den ikke-genistein kontroll, med en reduksjon av celler i S-fasen (fig. 3A). På den annen side, genistein behandlingen resulterte i akkumulering av celler i G2 /M fase i SW480-celler.
SW480-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av genistein for to d før prøvetaking. A) Representative DNA-histogrammer av genistein behandling av 0 og 75 umol /L ved strømningscytometri. Y-aksen representerer den relative DNA-innhold og x-aksen viser cellesyklusstadier. B) analyse av genistein behandlede celler Celle syklus. Prosentandelen av celler i G1 (•), S (▴) eller G2 /M (▪) er vist. Data representerer gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. C) WST-1 spredning analysen. WST-1 signaler fra hver brønn ble avlest ved 450 nm for absorbans mot en referansebølgelengde på 630 nm. Absorbans ble omdannet til selve celletall ved hjelp av en standard generert av seriefortynninger av et visst antall celler. Tre uavhengige celleprøver ble analysert og presentert som gjennomsnitt ± SEM. Stjerne (*) indikerer statistisk signifikans sammenlignet med 0 mikromol /L av genistein (
p
0,05).
Effekten av genistein på cellecyklusprogresjonen ble videre analysert ved behandling av celler med genistein i konsentrasjoner 1-75 umol /l. Prosentandelen av celler i forskjellige faser ble beregnet som forholdet mellom gated celler til den totale cellepopulasjonen. Genistein konsentrasjoner over 5 umol /L økte prosentandelen av celler i G2 /M fase signifikant (p 0,05) med den høyeste akkumulering observert ved 75 umol /L av genistein (p 0,05, figur 3B.). Resultatene viser at prosentandelen av celler i G1 fase ble opphevet etter 75 umol /L av genistein behandling (Fig. 3B). Prosentandelen av celler i S-fasen ble signifikant redusert (p 0,05) etter 50 og 75 pmol /L genistein behandlinger etter en forbigående økning av 25 umol /L genistein i forhold til den ikke-genistein kontroll. Til sammen ble cellecyklusprogresjonen i SW480 celler reguleres av genistein på en doseavhengig måte.
Genistein hemmet Cell Proliferation i SW480 og flere andre Colon Cancer Cell Lines
Celleproliferering ble testet av den WST-1 assayet, som viste at genistein behandlinger redusert celle antall SW480-celler på en doseavhengig måte (fig. 3C). Ved genistein konsentrasjoner over 15 umol /L-celletall ble signifikant redusert sammenlignet med den ikke-genistein kontroll (p 0,05). Denne anti-proliferativ effekt av genistein ble bekreftet i flere tykktarmskreftcellelinjer (figur S1). Den AnnexinV-propidiumjodid-analysen viste ingen endring av noen av genistein behandlinger, noe som indikerer at genistein ikke påvirker apoptose rate (data ikke vist). Disse resultatene tyder på at veksten-undertrykke effekten av genistein er generaliseres til de vanlige menneskelige tykktarmskreftcellelinjer.
Cyclin D1 mRNA uttrykk Redusert følgende Genistein Behandling i SW480 Cells
Cellesyklus kontrollgener
p21
,
Cyclin D1 Hotell og
c-MYC
er sterkt korrelert til regulering av cellevekst. Basert på dataene presentert ovenfor, forekom cellesyklus-stans i G2 i SW480-celler ved behandling genistein. For ytterligere å undersøke effekten av genistein på cellesyklusprogresjon, mRNA ekspresjon av cellesykluskontrollgener
p21
,
Cyclin D1
og
c-MYC
ble målt etter sanntids RT-PCR. Våre resultater viste at ekspresjon av
Cyclin D1
ble redusert signifikant (p 0,05) med 50 og 75 pmol /L av genistein sammenlignet med kontrollen (Fig 4, p. 0,05). Uttrykket av
p21 Hotell og
c-MYC
ble ikke påvirket av noen av genistein behandlinger. Den reduserte uttrykk for
Cyclin D1
er i overensstemmelse med cellesyklus data fra flowcytometri viser at cellesyklusprogresjon ble hemmet av genistein behandling.
SW480 celler ble behandlet med 0, 1, 5 , 15, 25, 50 eller 75 umol /L av genistein i 2 dager. De mRNA uttrykk nivåer av
p21, cyclin D1 Hotell og
c-MYC
ble målt ved RT-PCR. L7a ble benyttet som intern kontroll. Tre uavhengige eksperimenter ble analysert og presentert som gjennomsnitt ± SEM. Stjerne (*) indikerer statistisk signifikans i forhold til kontroll, 0 mikromol /L genistein (
p
0,05).
Overuttrykte DKK1 hemmet cellecyklusprogresjonen og celleproliferasjon i SW480 celler
for å undersøke den potensielle rolle
DKK1
i cellesyklusprogresjon, SW480 celler ble transfektert med en pCMV-XL5 plasmid inneholder humant
DKK1
. Overekspresjon av
DKK1
ble bekreftet ved RT-PCR-analyse av mRNA og western blot-analyse av proteiner (Fig. 5A og 5B). Analyse av
Cyclin D1
uttrykk viste at overekspresjon av DKK1 indusert lignende undertrykkelse av genuttrykket som genistein behandling (Fig. 5A). Overekspresjon av
DKK1
betydelig økt prosentandelen av celler i G2 /M fase i forhold til vektorkontrollen (p. 0,05, figur 5C), men i en mindre utstrekning i forhold til genistein behandling. I mellomtiden, prosentandelen av celler i G1 fasen ble signifikant redusert i celler som overuttrykker DKK1 (p 0,05), og det var ingen signifikant endring i antallet av celler i S-fasen. Resultater fra WST-1-analysen viste at overekspresjon av
DKK1
redusert spredning av SW480-celler, men i langt mindre grad i forhold til genistein behandling (p 0,05, figur 5D.). Totalt sett overekspresjon av
DKK1
produsert tilsvarende effekt på å hemme celle progresjon og celleproliferasjon som gjorde genistein behandling, tyder på en rolle DKK1 i disse cellulære hendelser.
pCMV vektor som inneholder menneskelig
DKK1
-genet ble brukt til å transfektere celler før prøvetaking for analyse. PCMV tom vektor ble anvendt som kontrollen for overekspresjon eksperimenter. Tre uavhengige celleprøver ble analysert og presentert som gjennomsnitt ± SEM. A) mRNA uttrykk for
DKK1 Hotell og
Cyclin D1
i vanlig og
DKK1
-transfected SW480 celler. MRNA-ekspresjon ble analysert ved RT-PCR. Data ble normalisert til intern kontroll L7a. B) DKK1 protein uttrykk i vanlige celler og transfektert SW480 celler. Hele celleproteinekstrakter ble samlet fra transfekterte SW480 celler og western blot-analyse av DKK1 ble utført som beskrevet i materialer og metoder. En representant blot er vist og kvantifisering representerer gjennomsnitt ± SEM fra 3 uavhengige retter. Aktin ble anvendt som kontroll lasting. C) Cellesyklus analyse av regelmessig og
DKK1
-transfected SW480 celler. Resultat ble oppnådd ved strømningscytometri. Y-aksen representerer% av gated celler og x-aksen viser ulike cellesyklustrinn, inkludert G1, S og G2 /M. D) WST-1 spredning analysen i vektor- og
DKK1
-transfected SW480 celler. WST-1-signaler ble omdannet til selve celletall ved hjelp av en standard generert av seriefortynninger av et visst antall celler. Data ble normalisert for å kontrollere for genistein behandling og vektor for DKK1 transfeksjon, respektivt. Stjerne (*) indikerer statistisk signifikans sammenlignet med de respektive kontrollgruppen (genistein for å kontrollere, DKK1 til vektor;
p
0,05). For knockdown av DKK1, ble siRNA tomannsboliger mot menneske DKK1 genet transfektert inn SW480 celler. Egge sekvenser ble anvendt som kontroll siRNA. E) mRNA uttrykk for
DKK1 Hotell og
Cyclin D1
kontroll siRNA (N /S si) og
DKK1
siRNA (DKK1 si) -behandlet SW480 celler ved kontroll og genistein behandlinger. MRNA-ekspresjon ble analysert ved RT-PCR. Data ble normalisert til intern kontroll L7a. F) WST-1 spredning analysen kontroll siRNA og
DKK1
siRNA SW480 celler. WST-1-signaler ble omdannet til selve celletall ved hjelp av en standard generert av seriefortynninger av et visst antall celler. Stjerne (*) indikerer statistisk signifikans i forhold til kontroll 0 mikromol /L genistein (
p
0,05). Braketten indikerer statistisk forskjell mellom N /S SI og DKK1 si gruppene behandlet med genistein (p = 0,002).
knockdown av DKK1 i SW480 celler delvis reversert endringene i Cellular profil forårsaket av Genistein Treatment
for å undersøke om endring av cellulære egenskapene SW480 forårsaket av genistein er avhengig av
DKK1
genekspresjon, siRNA rettet mot DKK1 ble transfektert inn SW480 celler etterfulgt av genistein behandling. Real-time RT-PCR viste at siRNA effektivt redusert DKK1 uttrykk i SW480 i både kontroll- og genistein behandlinger (p. 0,05, figur 5E). Videre reduksjon av
Cyclin D1
mRNA uttrykk av genistein behandling som er observert i ikke-spesifikke siRNA-behandlede celler (N /S SI) ble avskaffet ved knockdown av DKK1 (DKK1 si, Fig. 5E). I mellomtiden, selv om vekst-inhibitorisk effekt fra genistein er observert både i N /S siRNA og
DKK1
siRNA-grupper, knockdown av DKK1 økte proliferasjonen av SW480-celler i betydelig grad sammenlignet med den i kontrollen siRNA i genistein behandling (p .. 0.05, DKK1 siRNA vs N /S siRNA i genistein behandlinger, fig 5F)
Genistein Induced Histone acetvlering innenfor DKK1 Gene i SW480 og HCT15 Cells
brikken ble utført for å analysere kromatinstruktur på promoter (-96 /-28), koding (+ 635 /+ 742), og 5 «oppstrøms kontrollregioner (-2781 /-2713) av
DKK1
genet (fig. 6A) . 5′-oppstrømskontrollregion ble anvendt som en negativ kontroll for å vise den relative inaktive området under transkripsjon. DLD-1 celler ble brukt som en negativ kontroll for å vise kromatin status når
DKK1
genuttrykk er forstummet og ikke responderer på genistein behandling. Normal kanin-IgG ble anvendt som en intern kontroll-antistoff og en hvilken som helst DNA-bindingstilsvarende binding i kontroll IgG ble ansett for å være ikke-spesifikk. Økt RNA polymerase II (PolII) binding på
DKK1
promoter regionen indikert økt transkripsjon av
DKK1
genet i SW480 celler i respons til genistein (p 0,05, figur 6B.). I motsetning til dette var det minimal PolII bindings innenfor
DKK1
genet i DLD-1-celler, noe som bekrefter den stilnet transkripsjon av genet i DLD-1-celler (Fig. 6B).
A) En skjematisk tegning av
DKK1
genet. Svart pilspisser representerer primere som brukes for PCR for å teste tre regioner i brikken analysen: promoter, koding og 5 «oppstrøms kontroll. Fylte bokser viser eksoner av
DKK1
genet, mens den åpne boksen representerer
DKK1
promoter. Svarte linjer representerer introner. B) ChIP analyse av den relative protein overflod innenfor ulike områder av
DKK1
genet i SW480 og DLD-1 celler. Immunopresipitert DNA ble analysert ved hjelp av sanntids-PCR. Spesifikke antistoffer anvendt for immunopresipitering er merket på x-aksen. En ikke-spesifikke kanin IgG ble anvendt som den negative kontroll. Data ble plottet som forholdet til en verdi fra 25% av påsatt DNA. Tre uavhengige eksperimenter ble analysert og presentert som gjennomsnitt ± SEM. Stjerne (*) indikerer statistisk signifikans sammenlignet med kontroll bruker samme antistoff i cellelinje (p 0,05).
For å finne ut om økt transkripsjon nivået av
DKK1
gen i respons til genistein ble modulert av endringer av kromatinstruktur, antistoffer mot acetylerte, denaturert, eller fosforylerte histoner ble brukt i brikken analysen. Histonmodifikasjonene på de tre representative regioner av
DKK1
genet ble først undersøkt i SW480 celler etter den genistein behandling, ved hjelp av DLD-1 celler som negativ kontroll. Økninger i acetylert histon H3 på arrangøren og koding regioner av
DKK1
ble observert i SW480 celler etter genistein behandling (p. 0,05, figur 6B, H3Ac), med ingen signifikant acetylering av histoner i DLD-1 celler før eller etter behandling genistein (fig. 6B). Den mengde av den andre acetylert histon testet, den acetylerte histon H4, ble ikke påvirket av genistein behandling enten i cellelinjer (H4Ac). Selv om det var et mye høyere nivå av dimetyl histon H3 lysin 4 i SW480-celler sammenlignet med DLD-1-celler, ble genistein behandling påvirker ikke metylering status for denne histon H3 rest (fig. 6B, H3K4Me2). Fosforylering av histon H3 på serin 10 ble også undersøkt, og resultatet viste at det var en beskjeden nedgang på ulike regioner av
DKK1
gen av genistein behandling i alle cellelinjene som ble testet (p. 0,05, fig 6B, H3S10p). Oppsummert er aktiv transkripsjon av
DKK1
genet var assosiert med økt histon H3 acetylering på sitt gen regionen, noe som trolig førte til rekruttering av PolII til sin promoter.
DKK1 mRNA uttrykk ble indusert av histondeacetylase (HDAC) hemmer i SW480 Cells
TSA er en histondeacetylase (HDAC) hemmer som samhandler med de fleste av HDAC familiemedlemmer og induserer acetylering av histoner. For å bekrefte effekten av genistein-indusert histone acetylering på
DKK1
transkripsjon, behandlet vi SW480 celler med en serie av TSA konsentrasjoner og sammenlignet resultatene til genistein behandling. MRNA-ekspresjon av
DKK1
ble øket betydelig ved TSA behandling på en doseavhengig måte, i likhet med det resultat observert fra genistein behandling (p. 0,05, figur 7).
DKK1
mRNA-nivået ble analysert i SW480 celler behandlet med 50, 100 eller 200 nmol /L av TSA (TSA50, TSA100, og henholdsvis TSA200,) for en f. Genistein behandling ble utført som tidligere beskrevet. mRNA-ekspresjon nivået ble analysert ved hjelp av RT-PCR. Tre uavhengige celleprøver ble analysert og presentert som gjennomsnitt ± SEM. Verdier med ulike bokstaver er forskjellige (
p
0,05).
Diskusjoner
Denne studien hadde til hensikt å identifisere potensielle mekanismer av antitumor effekt av genistein. Vi har observert at både mRNA og proteinnivåene av DKK1 ble oppregulert ved behandling genistein. Våre resultater viser at genistein behandling indusert cellesyklus arrest og hemmet celledeling i SW480 tykktarmskreftceller. Dette ble senere bekreftet i flere andre tykktarmskreft cellelinjer. Både overekspresjon og knockdown av
DKK1
bekreftet involvering av DKK1 ved inhibering av cellesyklusprogresjon og celleproliferasjon. Vår resultat viste at økt DKK1 uttrykket kan være en av årsakene som forårsaket cellesyklus-stans og hemming av celleproliferasjon ved genistein behandling. Videre sammenligning mellom
DKK1
-expressing celler inkludert HCT15, HT29 og SW480, og
DKK1
-repressed celler inkludert RKO, SW48 og DLD-en viste at genet transkripsjon av
DKK1
er omvendt relatert til sin promoter metylering status. Genistein påvirker ikke DNA metylering av
DKK1
promoter. På den annen side, og enda viktigere, har vi gjort den observasjon at genistein induserer histone acetylering i
DKK1
genet og dette er korrelert med aktiveringen av sin gentranskripsjon.
kreft roller genistein, herunder fremme apoptose, inhibering av cellesyklusprogresjon, celleproliferasjon og invasjon, er blokkeringen av angiogenese og metastase i forskjellige typer kreft har blitt godt dokumentert [7], [36], [37], [38]. De molekylære mekanismene bak disse anticancer funksjoner av genistein omfatter modulasjoner av cellesyklus inhibitorer, reguleringen av apoptose-relaterte gener, så vel som inhibering av IGF-IR og PI3K /AKT signalering [11], [39], [40], [41]. Arbeid av vår gruppe har vist at genistein hemmet annen kritisk sti i tykktarmskreft utvikling, Wnt /β-catenin vei, ved å forstyrre arrangøren metylering av spesifikke gener. Spesielt genistein indusert
WNT5a
uttrykk ved å redusere metylering innenfor genet promoter-regionen [27]. Genistein også hemmet Wnt /β-catenin veien ved å aktivere en annen WNT antagonist,
sFRP2
ved demethylating CpG øyer innenfor genet [26]. Den aktuelle studien utvidet kunnskap til å inkludere DKK1 som en annen faktor i WNT signale som formidler responsen fra genistein behandling. Som en repressor av kreft cellevekst, er DKK1 en hoved antagonist som forstyrrer WNT sti og nedregulerer uttrykket av nedstrøms målgener inkludert Cyclin D1 [28], [42], [43].
uttrykk for DKK1 ble brakt til taushet av arrangøren hypermethylation i avansert stadium av tykktarmskreft (Dukes «C og D) [34]. I DLD-en cellelinje fra Dukes «C, et mer avansert stadium av tykktarmskreft, demetylering av DKK1 genet ved 5-aza-2»-deoxycytidine, en DNMT inhibitor, re-aktivert DKK1 uttrykk [34], [44] . Siden genistein er blitt vist å aktivere gener gjennom CpG demetylering [19], vi først testet muligheten for DKK1 promoter demetylering av genistein. Vår resultat bekreftet at metyleringen nivået ved promoteren CpG øya er omvendt relatert til genekspresjon av DKK1. I cellelinjer med hypermethylated promoter-regionen, inkludert DLD-en, RKO, og SW48, det var minimal hvis ikke stilnet DKK1 genuttrykk. Videre gjorde genistein behandling ikke endre hypermethylation av regionen i disse cellene, heller ikke det induserer noen genuttrykk. På den annen side, DKK1 var unmethylated i tidlig stadium av kreft i tykktarmen (Dukes «B) og relaterte cellelinjer inkludert SW480 [34] og HCT15. Både MSP og bisulfitt sekvensering bekreftet at DNA-metylering var meget lite, om noen, i cellelinjene. Videre er hypometylering ikke endres av genistein behandling. Derfor ble DNA demetylering utelukkes som en mekanisme for induksjon av DKK1 genekspresjon av genistein i disse cellelinjene.
Det er blitt rapportert at genistein modulerer også andre epigenetiske markører på kromatin nivå [16], [45 ], [46].
