Abstract
Telomerase spiller viktige roller i utvikling og progresjon av ondartede svulster, og dens aktivitet bestemmes i hovedsak av transkripsjonsregulering av menneskelig telomerase revers transkriptase (hTERT). Flere mRNA alternative spleisevarianter (ASVs) for hTERT har blitt identifisert, men det er fortsatt uklart om telomerase aktivitet er direkte forbundet med hTERT spleise transkripsjoner. I denne studien har vi utviklet nye real-time PCR protokoller ved hjelp av molekylære beacons og brukes på lungekarsinom cellelinjer og kreft vev for kvantifisering av telomerase aktivitet og tre viktige hTERT sletting transkripsjoner hhv. Resultatene viste at lunge carcinoma-cellelinjer konsekvent vist telomeraseaktivitet (14.22-31.43 TPG enheter pr 100 celler) og ulike hTERT alternativ spleising transkripter. For 165 lungekreft tilfeller telomerase aktivitet viste signifikant korrelasjon med tumor differensiering (poorly- moderately- godt differensiert, P 0,01) og med histotypes (kombinert småcellet og plateepitelkarsinom plateepitelkarsinom adenosquamous carcinoma adenokarsinom, P 0,05). Selv om de overordnede hTERT transkripsjoner ble påvist i alle prøvene, ble de ikke forbundet med telomerase aktivitet (r = 0,092, p = 0,24). Telomerase-aktivitet ble signifikant korrelert med den transkripsjonelle bestanddel forholdet mellom α-delesjon (r = -0,267, p = 0,026), β-delesjon (r = -0,693, P = 0,0001) og γ-delesjon (r = -0,614, P = 0,001). Den positive hastighet og gjennomsnittskomponenten forholdet mellom β-delesjons transkripter (92,12%, 0,23) var høyere enn de i α-delesjon (41,82%, 0,12) eller γ-delesjon (16,36%, 0,18) transkripter. Den kombinerte små-celle og plateepitelkreft karsinomer uttrykt mindre sletting transkripsjoner, spesielt β-sletting, enn andre histotypes, noe som kan forklare sin høyere telomerase aktivitet. I konklusjonen, de molekylære beacon-basert real-time PCR protokoller er raske, sensitive og spesifikke metoder for å kvantifisere telomerase aktivitet og hTERT ASVs. Telomeraseaktivitet kan tjene som en pålitelig og effektiv molekylær markør for å hjelpe til evaluering av histologisk subtype og differensiering av lungekarsinomer. Videre studier på hTERT sletting skjøting transkripsjoner, snarere enn den generelle hTERT transkripsjoner, kan forbedre vår forståelse av telomerase regulering
Citation. Liu Y, Wu Bq, Zhong Hh, Tian Xx, Fang Wg (2012) Kvantifisering av alternativ spleising Varianter av menneskelige Telomerase revers transkriptase og Korrelasjoner med Telomerase aktivitet i lungekreft. PLoS ONE 7 (6): e38868. doi: 10,1371 /journal.pone.0038868
Redaktør: Chi Zhang, University of Texas Southwestern Medical Center, USA
mottatt: 11 februar 2012; Godkjent: 15 mai 2012; Publisert: 18 juni 2012
Copyright: © 2012 Liu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd til WG Fang fra 973 Program (2010CB529402) fra The of Science and Technology i Kina departementet. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Normal somatiske celler gjennomgå prosessen med mobilnettet senescence grunn av progressiv telomerer forkortes etter hver celledeling. Aktivering av telomerase antas å være ansvarlig for å opprettholde tilstrekkelig telomeric lengde i tumor eller stamceller. Disse cellene har overvunnet dette proliferativ blokken ved å uttrykke enzymet telomerase, som gir celler med evnen til å dele seg kontinuerlig. Således regulering av telomeraseaktivitet har viktige implikasjoner for mange utviklingsmessige prosesser, inkludert celleproliferasjon, differensiering og aldring så vel som tumorigenesis. Telomerase aktivitet er påvist i nesten 90% av alle menneskelige kreftformer, noe som gjør det til et opplagt mål for kreft diagnostikk og terapeutiske strategier.
Den menneskelige telomerase revers transkriptase (hTERT) er en viktig del av den holoenzyme kompleks som legger telomeric gjentar til endene av kromosomene. Ekspresjonen av normal fullengde hTERT korrelerer godt med telomeraseaktivitet og synes å være det hastighetsbegrensende faktor for telomerase-aktivitet i humane celler. Den hTERT genet består av 16 eksoner og spenner ~37 kb av genomisk DNA, hvorav ~33 kb er intronic sekvenser og de resterende ~4 kb tilsvarer hTERT mRNA-transkript. Nylig ble tre hoved alternative spleisevarianter (ASVs) i revers transkriptase motiver av hTERT funnet å være involvert i kontrollen av telomerase-aktivitet: i) α-delesjon: mangler 36 bp fra ekson 6 inkludert motiv A; ii) β-sletting: mangler 182 bp fra eksoner 7 og 8, som fører til en tull mutasjon og avkorting proteinet før de konserverte RT motiver; iii) γ-sletting: mangler 189 bp fra ekson 11 i motivene D og E [1]. Det er flere mulige kombinasjoner av disse alternative spleisesteder, noe som resulterer i et stort antall potensielle spleising transkripter, men de med mer enn to spleisesteder er ustabile og brytes ned for raskt som skal påvises. På grunn a, p og γ delesjons transkripter resultere i trunkeringer eller mutasjoner i revers transkriptase domene nødvendige for katalytisk aktivitet, er de enten ikke-funksjonelle (β-delesjon eller γ-delesjon), eller selv har dominerende-negative effekter (α-delesjon) [1 ] – [4]. Derfor, er korrelasjonen mellom hTERT genekspresjon og telomeraseaktivitet komplisert.
Telomerase aktivitet og hTERT ekspresjon ble funnet i 67-85% og 48-95% av lungesvulster henholdsvis [5], [6], og begge var signifikant assosiert med dårlig total overlevelse og sykdomsfri overlevelse hos pasienter med ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) [6], [7]. Men forholdet mellom telomerase aktivitet eller hTERT og clinicopathological variabler var kontroversielt. Lantuejoul S og kolleger rapporterte at hTERT uttrykk var betydelig lavere i adenokarsinom (ADC) enn i plateepitelkarsinom (SCC), basaloid karsinom og småcellet lungekreft, og telomerase aktivitet var lavere i fase I lungekarsinom enn i andre faser (II- IV) [5]. Wu TC og medarbeidere har vist at verken telomerase aktivitet eller hTERT uttrykk i NSCLCs var korrelert med clinicopathological egenskaper som klasse, tumor etapper, tumortyper eller TNM verdier [8]. Spesielt, de fleste tidligere studier testet kun telomerase aktivitet eller samlede hTERT transkripsjoner, og ikke skille de forskjellige spleising variant transkripsjoner. I den foreliggende undersøkelse, en sanntids telomere gjenta amplifikasjonsprotokoll (TRAP) med en revers primer-bundet probe (RPP), en slags molekyl lykt sonde gre revers primer og fluorescens-merket probe i et molekyl, ble utviklet for telomerase aktivitet kvantifisering i lungetumorcellelinjer og vev. En annen real-time PCR-analyse med molekyl beacons ble utviklet for å analysere uttrykket nivåer av hTERT ASVs i de samme prøvene. Dermed har vi undersøkt karakterisering av telomerase aktivitet og hTERT sletting skjøting transkripsjon i lungekarsinom, noe som kan gi viktig informasjon for forståelsen av telomerase regulering i tumorigenesis.
Metoder
tumormateriale og cellelinjer
kreft~~POS=TRUNC prøver~~POS=HEADCOMP ble innhentet fra 165 lungekreftpasienter (115 menn, 50 kvinner, median alder, 60 år, range, 31-79 år). Innen 10 minutter etter kirurgi, ble vevene uten nekrose og blødning dissekert fra svulsten, etterfulgt av flash-frosset i flytende nitrogen og lagret ved -70 ° C. En del av hver prøve ble underkastet konvensjonell histologisk undersøkelse for å sikre at prøvene inneholdt minst 80% tumorceller. Diagnose, sortering og patologisk TNM (Tumor, Node, metastaser) staging ble bestemt uavhengig av to erfarne patologer i henhold til WHO og UICC klassifisering.
Den menneskelige ikke-liten lungekreft cellelinjer A549, H1299, SPC-A1 og PAA ble brukt som positive kontroller for telomerase aktivitet og hTERT genuttrykk. PAA ble etablert fra en pasient med kinesisk lunge adenokarsinom og holdt i vårt laboratorium, mens andre cellelinjer ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM), supplementert med 100 ml /l varme-inaktivert føtalt bovint serum (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), ved 37 ° C under 5% CO
2. Celler ved 80-90% av konfluens ble høstet med 0,25% trypsin-EDTA og vasket med is-kald fosfat-bufret saltvann (PBS, pH 7,4). Etter celletelling, ca 10
6-celler ble vasket to ganger med PBS og pelletert ved sentrifugering ved 2000 g i 5 min ved 4 ° C. Cellen pellets ble lagret ved -70 ° C for telomerase analysen innen seks måneder.
Etikk erklæringen
Denne studien ble godkjent av Peking University Institutional Review Board med godkjenning nr IRB00001052- 10004. Alle deltakerne i denne studien har gitt skriftlig samtykke, som har vært gjennomgangen prosedyren for etikkomité.
Grunning og Probe Design
Den tradisjonelle TRAP er en to-trinns analyse hvor telomerase legger telomeric gjentas på 3′-enden av substratet oligonukleotid, og deretter den utvidede produktene er forsterket ved hjelp av polymerase-kjedereaksjon (PCR) ved bruk av TS og en revers primer som er komplementær til de telomeric gjentas. I denne studien ble en sanntids TRAP analyse utviklet ved anvendelse av en revers primer-bundet probe (RPP), som kombinerte revers primer og fluorescens-merket probe i ett molekyl. Prinsippet for denne RPP-basert sanntids TRAP-analysen er vist skjematisk i fig. 1. revers primer bundet probe ble syntetisert ved Biosearch Technologies (Novato, CA, USA). Kvantifisering av telomerase aktivitet ble utført ved å overvåke fluorescerende signalene som sendes ut fra RPPs som hadde blitt innlemmet i fellen produkter (Figur S1). Molekylære sjømerker for kvantifisering av hTERT samlet eller sletting transkripter utspent ikke-spleisende eksoner eller slettingssetene henholdsvis, i henhold til GenBank tiltredelse NM_198253 (figur S2). Primere og prober ble utformet med Primer PREMIER 5.0 og OLIGO 6.0-programvare hhv. Deres sekvenser er vist i tabell S1. Delta entropien av den andre struktur i hver probe ble beregnet ved Mfold programvare (https://www.idtdna.com/Scitools/Applications/mFold/) for å kontrollere stabiliteten av stammesløyfe. Beacon prober for hTERT og Taqman probe for kontroll genet GAPDH (glyceraldehydes-3-fosfat-dehydrogenase-gen) ble syntetisert ved Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Alle primersett ble syntetisert og renset ved AuGCT Bioteknologi (Beijing, Kina). Spesifisiteten til PCR-amplifikasjoner ble bedømt ved 10% ikke-denaturerende polyakrylamidgel-elektroforese.
Celleekstrakter ekvivalente til de indikerte antall A549-celler ble testet for telomerase-aktivitet. Resultater i gel elektroforese (til venstre), forsterkning plottet (over) og standardkurver (under) konsekvent indikerte lineær sammenheng mellom telomerase aktivitet og A549 celle nummer, mens fem representerte en negativ kontroll.
Fast -time Kvantifisering analyse av Telomerase aktivitet
CHAPS lysis buffer ble fremstilt som beskrevet tidligere [9]. Cellepelletene ble resuspendert i iskald lyseringsbuffer (5000 celler /ul) og inkubert i 30 min på is. Etter sentrifugering (12 000 xg, 30 min, 4 ° C), ble supernatantene samlet opp omhyggelig og raskt frosset ved -70 ° C. De lagrede vevsprøver ble delvis tint og ca. 30 mg vev ble oppmalt under sterile betingelser inntil en glatt konsistens ble erholdt. Prøven ble deretter overført til et sterilt 1,5 ml mikro-sentrifugerør, og blandet med 200 ul lyseringsbuffer CHAPS. RNase-inhibitor (Takara Biotechnology, Dalian, Kina, 100 enheter /ml) ble tilsatt til CHAPS lyseringsbuffer før ekstraksjonen. Proteinkonsentrasjonen ble målt ved Bradford-metoden [10]. De siste ekstraktene ble fortynnet til en konsentrasjon på 2 ug /mL protein med lyseringsbuffer, og umiddelbart lagret i alikvoter ved -70 ° C.
Det totale volum av reaksjonsblandingen var 20 ul og inneholdt 1 x GoTaq Flexi buffer , 1,8 mM MgCl
2, 50 uM hver dNTP, 160 nM modifisert substrat oligonukleotid primer (MTS), 140 nM revers primer-bundet probe, 1unit av GoTaq DNA-polymerase (Promega Corporation, Madison, WI, USA), og 1 ul telomerase ekstrakter. PCR ble utført ved hjelp av en ABI StepOne Real-Time sykler (Applied Biosystems, Framingham, MA, USA). Etter 30 min inkubasjon ved 30 ° C i telomerase forlengelse, ble reaksjonsblandingen oppvarmet ved 95 ° C i 3 minutter for å inaktivere telomerase, etterfulgt av en 40-syklus forsterkning (94 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 60 sek inkludert 10- sek plate lesing). Ti mikroliter av hver prøve ekstrakt ble inkubert ved 95 ° C i 10 minutter og deretter dens en-tiendedel volum ble lagt inn i en annen parallell reaksjon som den varme-inaktive kontroll. I hvert eksperiment, 1 pl av lyseringsbuffer CHAPS substituert for proteinekstrakt ble anvendt som en negativ kontroll.
TSR8 er et oligonukleotid identisk med MTS primeren utvidet med åtte telomeric gjentas AG (GGTTAG)
7, som kan anvendes som en standard for å estimere størrelsen på MTS primere med telomeric gjentakelser utvidet ved telomerase i en gitt ekstrakt. Videre er detektering av TSR8 indikerer at amplifikasjonstrinn av TRAP-analysen ble utført på en effektiv [11]. For å utføre TRAP-analysen, 1 ul av hver TSR8 fortynning (0,2 amol /pl, 0,04 amol /pl, 0,008 amol /pl og 0,0016 amol /henholdsvis pl,) ble anvendt for å oppnå standardkurve hvor 0,001 amol TSR8 svarer til hvert enhet av TPG (Total Production genererte). For en gyldig analyse, er passende kontroller blitt inkludert i hver analyse:
i) varme-inaktivering kontroll: ekstraktet aliquot oppvarmet ved 95 ° C i 10 min; ii) negativ kontroll: lysebuffer substituert for proteinekstrakt og iii) positiv kontroll: telomerase-positive celleekstrakter. Noen ganger, positiv telomerase-aktivitet kunne kun påvises i den fortynnede ekstrakt og kan ikke påvises i mer konsentrerte ekstrakter fordi vevsekstrakt kan inneholde Taq-polymerase-inhibitorer. Så for hver vevsprøve, minst tre proteinkonsentrasjoner (2 ug /mL, 0,2 ug /ul, 0,02 ug /ul) ble testet i duplikater, hvor den høyeste TPG verdien ble ansett som den endelige telomeraseaktivitet.
RNA Utvinning og real-time RT-PCR analyse av HTERT ASVs
Total cellulær RNA ble ekstrahert fra frosne prøver med TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. RNA kvalitet ble vurdert ved denaturerende agarosegel-elektroforese. Bare prøver med skarpe 18 S og 28 S rRNA band og uten degradering ble brukt for videre analyse. To mikrogram RNA fra hver prøve ble anvendt for cDNA-produksjon ved hjelp av M-MLV revers transkriptase og tilfeldige heksamerer (Promega Corporation, Madison, WI, USA). Den fortynnede cDNA (1:10 fortynning) ble anvendt for amplifikasjon av kontroll GAPDH for å vurdere revers transkripsjon effektivitet så vel som RNA integritet.
Sanntids PCR ble utført i et totalt volum på 15 ul inneholdende 1 x GoTaq flexi buffer, 5 mM MgCl
2, 200 mM hver av dNTP, en enhet av GoTaq DNA polymerase, 800 nm primere (forover og bakover), 400 nm prober og 1 mL fortynnet cDNA (1:10 fortynning). Glødetemperaturen var forskjellig for ulike ASV. Sykling protokollen besto av 3 min innledende denaturering ved 95 ° C og en 40-syklus forsterkning (94 ° C i 15 sekunder, annealing temperatur i 60 sek inkludert plate lesing). Ved testing av hver ASV transkripsjon med den spesifikke primer sett, to transkripsjonelle produkter, med eller uten delesjon, ville bli forsterket samtidig, men den Beacon sonden bare hybridisert med slettingen transkripsjonelle produkt og emittert fluorescens [12]. Den Ct-verdien av hver hTERT spleisevariant ble normalisert til den Ct-verdien av GAPDH ved å subtrahere GAPDH-Ct-verdi fra målet Ct-verdien. Den relative uttrykket nivået for hvert mål PCR ble beregnet ved hjelp av ligning [13]: Relativ uttrykk = 2
– [Ct (mål) -Ct (GAPDH)] × 10 000. Den hTERT ASV bestanddel ratio (beregnet ved å dele den relative uttrykket verdien av de samlede transkripsjoner av at av de ASVs) ble også bestemt for hver vevsprøve.
Statistical Analysis
Grunn beskrivende statistiske data var oppnådd ved bruk av SPSS 11,0 programvare. Spearmans korrelasjonskoeffisienter (r) ble beregnet til å vurdere assosiasjoner blant telomerase aktivitet, hTERT ASV uttrykk og clinicopathological data. Forskjeller i telomerase aktivitet eller kvantitativ hTERT uttrykk mellom de analyserte undergrupper ble evaluert av uparet t-test eller enveis ANOVA. En p-verdi 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
Kvantifisering av Telomerase aktivitet og HTERT ASVs i tumorcellelinjer
Følsomheten og linearitet av RPP-basert sann. -time TRAP analysen ble evaluert med ikke-småcellet lungekreft cellelinje A549. Cellepelletene som inneholdt omtrent 10
6-celler ble resuspendert i 200 ul lyseringsbuffer CHAPS, så ekstraktene tilsvarte telomeraseaktivitet på 5000 celler per mikroliter. Telomerase-ekstraktene ble fortynnet serie 1000-1 celle pr mikroliter, og 1 ul ekstrakt ble brukt i kvantifisering av telomerase-aktivitet i triplikater. Telomerase i ekstrakter vil legge telomeric gjentas på 3′-enden av substratet oligonukleotid (MTS) i den første inkuberingstrinnet, og produktene ble amplifisert som templat i påfølgende PCR-prosessen. Som vist i figur 1, ved hjelp av TRAP-polyakrylamid-gelelektroforese (TRAP-PAGE) analyse, kan telomerase-aktivitet påvises i minst ti A549 celler, indikert ved tilstedeværelsen av et synlig hexanucleotide stige av PCR-produkter på polyakrylamidgel. Men ved å bruke RPP-basert sanntids TRAP assay, telomerase-aktivitet kunne påvises i løpet av så lite som en A549-celle. Et lineært forhold ble også observert mellom telomeraseaktivitet og logaritmen av antall celler som strekker seg fra 1 til 1000 celler. Korrelasjonskoeffisienten beregnet fra den lineære regresjonsmodellen var opp til 96,4%. Inkludert telomerase ekstrahering, kunne RPP-basert sanntids TRAP assay bli ferdig i løpet av tre timer, mens det TRAP-PAGE vil ta minst 5 timer. Viktigere, RPP-basert sanntids TRAP analysen var nøyaktig kvantitativ og reproduserbar. Som vist i tabell 1, cellelinjer A549, H1299, SPC-A1 og PAA konsekvent vist telomeraseaktivitet fra 14,22 til 31,43 TPG enheter pr 100 celler.
Molecular radiofyr er sensitiv og spesifikk fordi probene ikke hydrolyseres i forsterkning og bare gjenkjenne perfekt komplementære mål. I kvantifisering av hTERT ASVs, hybridiserer den molekylære lykt proben til de tilsvarende transkripter og overvåker syntesen av de spesifikke nukleinsyrene i sanntid. For eksempel, er sonden H1810 komplementære til DNA-sekvensen i krysset av exon 3 og exon 4 av hTERT-gen, og vil hybridisere til alle hTERT transkripsjonene og derfor detektere generelle hTERT transkripter som omfatter normale og variantskjøte transkripter. Men sonden A2173, B2331 og R2699 bare bestemme a, B eller γ sletting transkripsjoner hhv. Ved hjelp av den nyutviklede kvantifisering-protokollen, i SPC-A1-celler, ble alle de tre delesjonsskjøte transkripter påvises, idet forholdet 0,21, 0,26 og 0,04 for a, p eller γ sletting transkripter (Tabell 1 og figur 2), noe ville indusere delvis formålsløse utskrifter og kan forklare den lave telomerase aktivitet. Med andre cellelinjer ble avskrift γ-sletting ikke oppdages og uttrykket nivåer av α-sletting transkripsjoner (spredning, 0,25 til 0,44) var høyere enn beta sletting transkripsjoner (tabell 1).
Representant lineære forsterkningskurver ble vist for kvantitativ påvisning av samlet hTERT (A), α-delesjon (B), β-delesjon (C) og γ-delesjon (D) transkripter respektivt. GAPDH fungerte som en intern kontroll. NC:. Negativ kontroll
Kvantifisering av Telomerase aktivitet og HTERT ASVs i lungetumoren Samples
I FELLE analysen av svulst vevsprøve, resultatene i både polyakrylamidgelelektroforese og forsterkningskurver av RPP-basert sanntids TRAP indikerte lineær sammenheng mellom telomeraseaktivitet og logaritme av proteinkonsentrasjon (figur 3). I ett tilfelle av karsinomer, kan telomerase-aktivitet påvises ved en proteinkonsentrasjon så lav som nesten 0,002 ug /ul. For å få pålitelige kvantitative TRAP resultat ble minst tre proteiner konsentrasjoner (0,02, 0,2 og 2 ug /ul) i duplikat for hver tumorprøve analyseres med to separate eksperimenter.
seriefortynnede proteinekstrakter fra 2 ug til 0,0002 ug ble testet for telomeraseaktivitet i ett tilfelle av karsinomer. Resultater i gel elektroforese (til venstre), forsterkning plottet (over) og standardkurver (under) konsekvent indikerte lineær sammenheng mellom telomerase aktivitet og proteinkonsentrasjonen, mens seks representerte en negativ kontroll.
I alle 165 eksemplarer av lunge tumorvev, telomerase aktivitet varierte fra 0.39-482.46 TPG enheter (tabell 2). Den gjennomsnittlige telomerase-aktivitet hos mannlige pasienter som var signifikant høyere enn den hos kvinnelige pasienter (P = 0,006). Telomeraseaktivitet var negativt assosiert med tumor differensiering (r = 0,022, p = 0,005), hvor de dårlig differensierte tumorer viste den høyeste telomerase-aktivitet. Telomerase aktivitet var signifikant forskjellig mellom de fire viktigste histologiske fenotyper av lungekarsinom (P = 0,001), som også ble evaluert i par. Den kombinerte småcellet og plateepitelkarsinom (CSS) viste den høyeste telomerase aktivitet (kontra tre andre histotypes, P = 0,001), etterfulgt av Scc og adenosquamous karsinom (ASC) (kontra tre andre histotypes, P = 0,025 henholdsvis), mens Adc viste den laveste telomerase aktivitet (kontra andre tre histotypes, P = 0,001). Ingen sammenheng mellom telomerase aktivitet og TNM stadium ble funnet i denne studien (P 0,05)
Kvantifisering av de samlede og sletting spleise hTERT transkripsjoner ble utført i alle tumorprøver.. I Spearmans analyse, var det ingen signifikant korrelasjon mellom ekspresjonen av hTERT samlede transkripter og telomeraseaktivitet (r = 0,092, p = 0,241), og mellom ekspresjonen av hTERT samlede transkripter og en hvilken som helst clinicopathologic parameter (P 0,05). Den a, B og γ slettings transkripter ble detektert på 41,82%, 92,12% og 16,36% av pasientene, og deres gjennomsnittskomponenten-forholdet var 0,12, 0,23 og 0,18 henholdsvis. Kun 16 pasientene uttrykte alle de tre delesjons transkripter på samme tid. Det var bemerkelsesverdig at alle tre sletting transkripsjoner «konstituerende forhold ble signifikant korrelert med telomerase aktivitet, mens korrelasjonskoeffisienten var -0,267 for α-sletting transkripsjon (P = 0,026), -0,693 for β-sletting transkripsjon (P = 0,0001) og -0,614 for γ-sletting transkripsjon (P = 0,001), henholdsvis. Hos mannlige pasienter, de gjennomsnittlige konstituerende forhold av de tre strykninger var lavere enn de i kvinnelige pasienter, i samsvar med den høyere telomeraseaktivitet blant dem. Imidlertid vil bare β-delesjon og γ-delesjon viste signifikant forskjell mellom (P = 0,006, p = 0,027, respektivt) mannlige og kvinnelige pasienter. Som for parvise sammenligninger mellom histologiske subtyper og tre sletting transcriptional konstituerende forholdstall, CSS viste signifikant lavere bestanddel forholdet i β-sletting (P = 0,011) og γ-sletting (P = 0,015) enn ADC. SCC bare presenteres lavere bestanddel forholdet i γ-sletting (P = 0,006) enn ADC. Det var ingen signifikant sammenheng mellom en delesjon transkripsjonen bestanddel forhold og tumor differensiering, scene eller lymfeknutemetastase. Videre pasienter med metastase pleuralt viste signifikant høyere transkripsjonelle bestanddel forholdet i β-delesjon (P = 0,041), men ikke i andre to delesjoner (P = 0,227 og P = 0,735 henholdsvis).
diskusjon
Siden telomerase uttrykkes i nesten 90% av alle kreft hos mennesker, har det vært stor interesse for å utvikle en telomerase-analyse egnet for klinisk testing [14]. Som et endepunkt og semikvantitativ analyse, er den tradisjonelle TRAP lav gjennomstrømning, begrenset i nøyaktig kvantifisering og sannsynligvis vil være falskt negativt fordi PCR-amplifisering effektiviteten kan bli inhibert av proteinet i celleekstrakt. Kvantifisering av telomerase aktivitet med real-time analyse er mer presis, fordi det er avhengig av Ct-verdier bestemt i løpet av den eksponentielle fasen av PCR ved relativt lave konsentrasjoner av PCR-produktet før metning eller platå. Tidligere sanntid kvantitativ TRAP med fluorescerende fargestoffer eller Taqman probe er mindre spesifikk og mer begrenset i sin kvantitativ potensial på grunn av noe en-til-en korrespondanse mellom fluorescens og PCR-produkt [15], [16]. Her beskrev vi en ny kvantitativ FELLE analyse ved hjelp av en omvendt primer bundet probe (RPP). RPP er en molekylær bryter for å påvise DNA-amplifikasjon ved å utnytte energioverføring mellom fluorofor (FAM) og slukkeren (Dabsyl). Den AV til PÅ overgang oppstår når konformasjonen til RPP endrer seg fra en «lukket» intramolekylær stammesløyfestrukturen til en «åpen» forlenget struktur. Denne strukturendring oppnås når man RPP er inkorporert i en dobbeltkjedet DNA-molekyl ved hjelp av PCR. Forsterkningen kan overvåkes ved å måle fluorescensen av reaksjonsblandingen. I denne studien, telomerase-aktivitet viste tilfredsstillende lineære relasjoner med logaritmen av dyrkede celletallet eller proteinkonsentrasjon i riktig område. Telomeraseaktivitet kunne påvises i løpet av så lite som en dyrkede tumorcelle eller så lite som 0,002 pg protein fra tumorvev. I samsvar med forrige rapport, fluorescein-probe-basert real-time FELLE analysen ga mer raske, nøyaktige resultater for telomerase aktivitet kvantifisering enn tradisjonell felle med gel elektroforese [17]. I vår tidligere studie undersøkte vi telomeraseaktivitet av 60 lungekreft vev ved hjelp av SYBR grønn sanntid TRAP, en relativ kvantitativ analyse, og bare funnet forskjellen i telomeraseaktivitet mellom NSCLC og CSS [9]. I denne studien, søkte vi RPP-basert sanntids TRAP til et større antall lungetumor vevsprøver (165 tilfeller) og brukt standardkurve analyse. En vesentlig forskjell i telomerase aktivitet blant fire histologiske typer ble funnet: CSS Scc ASC ADC, som var i samsvar med Fujiwara rapport [18]. Ohmura og Maniwa har rapportert høyere telomeraseaktivitet i NSCLC (henholdsvis 42.3 og 75.24 TPG enheter), i hvilken de undersøkte 60 og 40 tilfeller henholdsvis, og brukte semi-kvantitative metoder [19], [20]. Vi mener at slike motsetninger kunne tilskrives mangfold i populasjoner og prøvestørrelse, og spesielt til de forskjellige teknikker som brukes for å detektere telomerase-aktivitet. Det ble også i konflikt i litteratur om nivået av telomerase-aktivitet ble korrelert med de aggressive clinicopathological funksjoner, for eksempel tumor differensiering og TNM trinn [6], [19] – [21]. Ved hjelp av RPP-basert sanntids TRAP, ble det observert en sterk korrelasjon mellom telomeraseaktivitet og tumor differensiering. Det var interessant at ble observert forskjell i telomeraseaktivitet mellom kvinnelige og mannlige pasienter i denne studien. At kvinnelige pasienter hovedsakelig led av ADC, som hadde lavere telomerase aktivitet enn andre subtyper, kan bidra til deres lavere telomerase aktivitet enn mannlige pasienter. Således synes telomerase-aktivitet for å være en nyttig markør for å bestemme histologisk type og differensiering i lungekarsinomer.
Noen forfattere hevdet at påvisning av hTERT mRNA ved hjelp av RT-PCR eller in situ hybridisering kan brukes til å evaluere telomerase aktivitet [5]. Imidlertid, den transkripsjonelle og posttranskripsjonelt regulering av hTERT var komplekse og ikke fullt ut klarlagt. Tidligere ble primer sett eller Taqman sonde spenner slettingen området brukes i de fleste studier for skjøting variant undersøkelser [22] – [26]. Men kan disse primersett eller sonder forsterke både full-lengde transkripsjoner og sletting transkripsjoner grunn av forskjøvet annealing med blandede maler. I denne studien, har vi utviklet en kvantitativ analyse av molekylære beacons og oppdaget alle tre sletting transkripsjoner i SPC-A1 celler. Vi fant en relativ høy bestanddel ratio (range, 0,21 til 0,44) for α-sletting transkripsjoner i fire lunge kreft cellelinjer, noe som ikke er forenlig med de data som viser lavere bestanddel ratio (range, 0,06 til 0,15) tidligere [1] , [25], [27]. Dette kan tilskrives bruken av mer spesifikk molekyl sjømerke, snarere enn den semi-kvantitative nestede PCR-analyser. Mønstrene hTERT ASVs ble vist å være variert i bryst, lever, mage, tykktarm, skjoldbruskkjertelen og lungesvulster, der de positive tallene for hTERT ASVs ble sannsynligvis overestimert ved å forsterke en region som strekker seg over både sletting nettsider [1], [11] , [21] – [24], [26], [28]. Vår kvantitativ analyse for hver sletting transkripsjon gir en løsning for å nøyaktig kvantifisere ASV uttrykk og vurdere sitt forhold til klinikken-patologisk parametere.
I denne studien ble det observert noen sammenheng mellom den generelle hTERT transkripsjoner uttrykk og telomerase aktivitet, i samsvar med tidligere rapporter i andre svulster [29], [30], som indikerte at det ikke var rimelig å erstatte den samlede hTERT mRNA deteksjon for telomerase aktivitet evaluering. Vi har funnet at mer enn 92% av pasientene uttrykte minst en delesjon transkripsjon, men bare 9,7% uttrykt alle de tre delesjons transkripter. Spesielt de bærende prosenter av de tre sletting transkripsjoner var signifikant korrelert med telomerase aktivitet. De β-sletting transkripsjoner var de mest vanlige spleisevarianter i de fleste lungekarsinom og viste den sterkeste korrelasjonen med telomerase aktivitet. Dette er i likhet med de foregående funn i andre tumortyper, [11], [22] – [24], [26].
