Abstract
Tropomyosin-relaterte reseptor-kinase B (TrkB) signal, stimulert av hjerne-avledet neurotrofisk faktor (BDNF) ligand, fremmer tumorprogresjon, og er relatert til dårlig prognose av forskjellige maligniteter. Vi ønsket å undersøke den kliniske relevansen av BDNF /TrkB uttrykk i kolorektal kreft (CRC) vev, sin prognostisk verdi for CRC pasienter, og terapeutisk potensiale
in vitro Hotell og
in vivo
. To hundre og tjuetre CRC pasientprøver ble brukt til å bestemme både BDNF og TrkB mRNA nivåer. Uttrykket av disse proteinene i sine primære og metastatiske svulster ble undersøkt ved immunhistokjemi. CRC cellelinjer og rekombinant BDNF og K252a (en selektiv farmakologisk pan-Trk hemmer) ble brukt for
in vitro
celle levedyktighet, migrasjon, invasjon, anoikis motstand og
in vivo
peritoneal metastase analyser. Tissue BDNF mRNA ble forbundet med leveren og peritoneal metastaser. Tissue TrkB mRNA ble også assosiert med lymfeknutemetastase. Samtidig uttrykk for BDNF og TrkB var forbundet med leveren og peritoneal metastaser. Pasienter med høyere BDNF, TrkB, og co-uttrykk for BDNF og TrkB hadde en betydelig dårlig prognose. BDNF øket tumorcellelevedyktigheten, migrasjon, invasjon og inhiberte anoikis i trkB-uttrykkende CRC-cellelinjer. Disse effektene ble undertrykt av K252a. I mus injisert med DLD1 ko-uttrykker BDNF og TrkB, og deretter behandlet med K252a, ble peritoneale metastatiske noduler funnet å bli redusert, sammenlignet med kontrollmus. BDNF /TrkB signale kan således være et potensielt mål for behandling av peritoneal karsinomatose som følge av kolorektal kreft
Citation. Tanaka K, Okugawa Y, Toiyama Y, Inoue Y, Saigusa S, Kawamura M, et al. (2014) Brain-nevrotrop Factor (BDNF) indusert Tropomyosin-Related kinase B (Trk B) Signa er en potensiell terapeutisk mål for peritoneal karsinomatose Som følge av tykktarmskreft. PLoS ONE 9 (5): e96410. doi: 10,1371 /journal.pone.0096410
Redaktør: Vincenzo Coppola, Ohio State University Comprehensive Cancer Center, USA
mottatt: 15 oktober 2013; Godkjent: 07.04.2014; Publisert: 06.05.2014
Copyright: © 2014 Tanaka et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis med tilskudd fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi fra Japan (KAKENHI 24591972 Yi, og 25.462.051 til SS). Ingen ekstra ekstern finansiering ble mottatt for denne studien. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
den enestående fremgang i behandling av metastatisk kolorektalcancer (mCRC) har blitt grunnlagt på de siste multi-drug kombinasjon kjemoterapi, som nå produserer median overlevelse ganger overstiger 20 måneder [1]. Imidlertid kan peritoneal karsinomatose (PC) oppstår fra CRC. PC er assosiert med ekstremt dårlig overlevelse, og svært få terapeutisk eller palliativ behandling er tilgjengelig [2]. Dermed er en bedre forståelse av molekylære og biologiske oppførsel av PC som oppstår fra CRC presserende behov for å legge til rette for utvikling av nye terapeutiske strategier.
Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) er et medlem av neurotrofin ( NT) familie. BDNF spiller en viktig rolle i utviklingen og reparasjon av nervesystemet [3]. Det binder seg til sine to store reseptorer, den tropomyosin-relaterte reseptor-kinase B (TrkB) med høy affinitet og spesifisitet, og det pan-NT-reseptor p75 (p75
NTR) med lav affinitet [4]. Binding av BDNF til TrkB fører til autofosforylering av tyrosiner i det intracellulære domenet med aktivering av nedstrøms signalveier som RAS /MAPK og PI3K /AKT [4], [5]. BDNF binder også lav affinitet reseptor p75
NTR som utøver ulike funksjoner som regulering av celleoverlevelse og differensiering i nevronale utvikling [6].
Selv om både TrkB og p75
NTR involvert i spredning, differensiering, overlevelse og apoptose av neuronale og ikke-neuronale tumorer [7], [8], p75
NTR fortrinnsvis fungerer som et samspill partner av TrkB, modulerer TrkB aktivering av BDNF, og påvirkninger prosurvival effekt av BDNF /TrkB signale [ ,,,0],9].
BDNF /TrkB signalering har blitt rapportert å være assosiert med tumorprogresjon, metastase, og respons på kjemoterapi i flere menneskelige maligne lidelser som neuroblastom [10], eggstokk [11], hode og nakke [12 ], lunge [13], hepatocellulær [14], bukspyttkjertel [15], blære [16], prostata [17], multippelt myelom [18], og brysttumor [19]. TrkB har også vist seg å fremme resistens mot anoikis (en form for løsgjøring-indusert apoptose) [20], og derved til å gi metastatiske egenskaper eller epitelial-mesenkymale overgang (EMT) [21], [22]. I motsetning til den rolle TrkB i kreft, p75
NTR ser ut til å ha enten tumor-fremmende eller tumorhemmende funksjoner i henhold til tumortyper [8]
Tidligere har studier i vårt laboratorium viste.: en sammenheng mellom TrkB nivåer tumorprogresjon og pasient prognose i magekreft [23]; foreningen av TrkB med kjemoterapi motstand i spiserørskreft [24]; og TrkB engasjement i EMT av tykktarmskreft [25]. Mer nylig har vi demonstrert involvering av BDNF /TrkB sti i tumorprogresjon i magekreft [26].
Med hensyn til BDNF /TrkB signalisering i CRC, ble BDNF eller TrkB overexpressed i både klinisk svulst eksempler og i forbindelse med aggressive tumor fenotyper [27] – [30].
In vitro-
studier har vist at BDNF /TrkB signalering er involvert i proliferative eller invasive egenskaper [27] – [30], og effekt eller motstand av anti-epidermal vekstfaktor-reseptor monoklonalt antistoff cetuximab [31] eller gastrin- frigjørende peptid reseptor [32]. Disse linjene av bevis indikerte at BDNF /TrkB signale fremmer tumorprogresjon, noe som fører til en dårlig prognose for ulike menneskelige kreftformer, og at det har dukket opp som en potensiell terapeutisk mål [33], [34].
Målet med denne studien var å undersøke: sammenhengen mellom BDNF /TrkB uttrykk og clinicopathological variabler i en serie av menneskelige CRC vev; den prognostiske verdien av BDNF /TrkB signalering i CRC pasienter; og sin terapeutiske potensial in vitro og in vivo.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne undersøkelsen ble gjennomgått og godkjent av Institutional Review Board og lokale etikkkomité Mie Universitetet Graduate School of Medicine (nr 2126). Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter (voksne og foreldre til barn) innrullert på studien.
De eksperimentelle protokollene av in vivo studier ble gjennomgått og godkjent av Animal Care og bruk komité ved Mie Universitetsstudiene school of Medicine.
pasienter
totalt 223 pasienter med CRC, som ble behandlet ved Institutt for Gastrointestinal og Pediatric Surgery i Mie Universitetet Graduate school of Medicine 2000-2008, var inkludert i denne studien. Pasienter med ufullstendige kliniske data, manglende oppfølging eller prøvetaking utilstrekkelig vev ble ekskludert fra studien. Alle pasientene hadde histologisk bekreftet adenokarsinom i tykktarmen eller endetarmen. Median alder for pasientene var 67 år (range: 12-91 år). Median oppfølgingstid var 30,6 måneder (variasjon: 1,5 til 107,2). Totalt 49 pasienter døde av CRC-relaterte årsaker i denne perioden.
Staging var basert på klinisk vurdering og histopatologiske analyser ved hjelp av International Union Against Cancer (UICC) TNM staging system. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasientene som deltok på undersøkelsen, ifølge lokale etiske retningslinjer. Denne studien ble godkjent av Institutional Review Board.
Eksempel samlinger
kreft vev ble frosset i flytende nitrogen umiddelbart etter kirurgisk reseksjon og lagret ved -80 ° C inntil bruk. Diagnosen CRC ble bekreftet for alle 223 pasienter basert på clinicopathologic funn.
Total RNA ekstraksjon, cDNA syntese
kreft vev ble hakket og homogenisert med en mikser Mill MM 300 homogenisator (Qiagen, Chatsworth , CA, USA). Totalt RNA ble isolert ved anvendelse av en RNeasy Mini Kit (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner. cDNA ble syntetisert fra 5 mikrogram total RNA med en tilfeldig heksamer primer og Hevet III revers transkriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner.
Sanntids kvantitativ revers transkripsjon polymerase chain reaction (RT -PCR) og relative genuttrykk nivåer
Kvantitativ PCR (qPCR) analyser ble utført ved hjelp av en TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Uttrykket nivåer av målet genet transkripsjoner, målt ved bruk av TaqMan prober for BDNF (analysen ID, Hs00380947_m1) og TrkB (analysen ID, Hs00178811_m1), ble normalisert til GAPDH (analysen ID, Hs02758991_g1) og evaluert med Applied Biosystems StepOne programvare (v2. 1).
Den relative BDNF og TrkB genuttrykk nivåer ble bestemt ved hjelp av en standardkurve. Standardkurven ble dannet ved anvendelse av en fem-gangers seriell fortynning av tilfeldig-primet qPCR Humant referanse cDNA (TAKARA BIO INC., Clontech, Japan). Alle standardkurver ble lineær innen området ble brukt til analysen, med en akseptabel tilsvarende korrelasjonskoeffisienten (R «sup> 2). Graden av ekspresjon av målgenet ble beregnet fra standardkurven, og normalisert mot GAPDH. Til slutt ble målgen mRNA nivå uttrykkes som et forhold i forhold til GAPDH-mRNA-nivå. Sanntids kvantitativ PCR analyser ble utført i triplikat for hver prøve og den midlere verdi ble benyttet ved beregning av mRNA-ekspresjonsnivåene.
amplifiserte PCR-produktene ble separert elektroforetisk, visualisert og fotografert under UV-lys etter etidiumbromidfarging.
Immunohistochemistry
Immunohistochemistry ble utført som beskrevet tidligere [25]. §§ 2-3 mikrometer tykke ble kuttet fra formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) eksemplarer av CRC pasienter. Etter deparaffinization og dehydrering, ble prøvene kokt i 10 mM natriumsitrat-buffer i 15 minutter for å avsløre antigener. Seksjonene ble deretter blokkert med normalt geiteserum (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA) i 60 minutter og inkubert med primært antistoff over natten ved 4 ° C. Antistoff binding ble oppdaget ved hjelp av Envision reagenser (Envision kit /HRP, Dako Cytomation, Danmark). Alle deler ble kontra med hematoksylin. En primær kanin polyklonale antistoff mot BDNF (H-117, 1:350, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) og en muse monoklonalt antistoff mot TrkB (1:100, R D Systems, Foster City, CA, USA) ble anvendt. Negative kontroller ble også kjøre samtidig ved å utelukke de respektive primære antistoffet.
CRC cellelinjer
Menneskelige kolorektal kreft cellelinjer DLD1, LoVo, SW480, HT29, og CaCO2 ble innhentet fra Celle Ressurssenter for Biomedical Research (Tohoku University, Japan). autentisering testing cellelinjen som har blitt utført for disse cellelinjene. Disse cellelinjene ble holdt i RPMI-1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum, 100 IU /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C og 5% CO2.
Reagenser
Rekombinant human BDNF ble kjøpt fra Peprotech (Rocky Hill, NJ, USA) og utarbeidet i henhold til produsentens instruksjoner. Rekombinant humant BDNF ble oppløst i PBS (10 mikrogram /ml) for
in vitro
analyser.
K252a ble kjøpt fra Calbiochem (San Diego, California, USA) og lagret ved -20 ° C før bruk. K252a ble oppløst i PBS (10 mikrogram /ml) for
in vitro Hotell og
in vivo
analyser.
Western blot analyse
CRC celle linjer ble vasket i iskald PBS mens på fatet. Kald lyseringsbuffer (Tris-bufret saltoppløsning, pH 7,5, inneholdende 1% Triton X-100) ble så tilsatt direkte til fatet. Cellene ble deretter skrapt av fatet, samlet og homogenisert ved hjelp av en mikser Mill MM 300 homogenisator (Qiagen Inc., Chatsworth, CA, USA). Supernatantene ble samlet og frosset ved -20 ° C inntil bruk. Proteinkonsentrasjonen ble målt ved anvendelse av BCA-proteinanalyse (Pierce, Rockford, IL, USA). 20 ug av proteinet lysat ble blandet med et like stort volum av 2 x Laemmli-lastebuffer inneholdende 2-merkaptoetanol og oppvarmet ved 100 ° C i 5 minutter. Prøvene ble elektroforetisk separert på 12,5% gradient polyakrylamidgeler inneholdende 0,1% SDS, fulgt av semi-tørr overføring til en Immun-Blot PVDF-membran (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Membranen ble deretter blokkert ved anvendelse av 5% skummet melk i Tris-bufret saltvann, pH 7,5, supplert med 0,1% Tween 20 (TBS-T).
Blottene ble deretter inkubert med muse-monoklonalt anti-TrkB-antistoff ( R 0,037), mens 121 pasienter hadde lav BDNF mRNA uttrykk. Som vist i tabell 1, ble BDNF mRNA-ekspresjonsnivået i CRC vev funnet å være signifikant assosiert med synkron levermetastaser (P = 0,007) og synkront peritoneal metastase (P = 0,026). Ingen signifikant sammenheng ble observert mellom BDNF mRNA i CRC vev og eventuelle andre clinicopathological variabler.
Den TrkB mRNA nivå i CRC vev
Ifølge TaqMan Gene Expression analyse (Applied Biosystems , Foster City, CA, USA), probe av TrkB (Assay-ID, Hs00178811_m1) er utformet for å spenne over exon 6/7 grenser. Tilsvarende primere amplifisere fragmenter inneholdende eksonene 6-7 som koder for den ekstracellulære del av den TrkB-reseptoren. Derfor registrerer denne primer og probe sett både i full-lengde TrkB (TrkB.FL) og den avkortede TrkB (TrkB.T1) [35].
TrkB mRNA-ekspresjon-forhold, i forhold til GAPDH, i CRC vev var 0,054 ± 0,141 (gjennomsnitt ± SD), alt 0 til 1,149. ROC-kurve analyse viste at den grenseverdi for TrkB mRNA var 0,002 (maksimum prediktiv verdi for OS). Ett hundre og sytti-en pasientene hadde høy TrkB mRNA uttrykk, mens 52 pasienter hadde lav TrkB mRNA uttrykk. Som vist i tabell 1, ble det TrkB mRNA-nivå i CRC vev funnet å være signifikant assosiert med lymfeknutemetastaser (P = 0,022). Ingen signifikant sammenheng ble observert mellom TrkB mRNA nivå i CRC vev og eventuelle andre clinicopathological variabler.
Co-uttrykk for BDNF og TrkB i CRC vev
Ninety-fire pasienter viste både høy BDNF og TrkB mRNA uttrykk. Denne pasientgruppen ble klassifisert som ko-uttrykker både BDNF og TrkB. Som vist i tabell 1, ble ko-ekspresjon av BDNF og TrkB i CRC vev funnet å være signifikant assosiert med synkron levermetastaser (P = 0,03) og synkront peritoneal metastase (P = 0,013). Ingen signifikant sammenheng ble observert mellom TrkB mRNA nivå i CRC vev og eventuelle andre clinicopathological variabler.
Den prognostiske effekten av BDNF, TrkB, og co-uttrykk for BDNF og TrkB i kolorektal kreft vev
Figur 1 viser Kaplan-Meier-kurver for BDNF (A), TrkB (B), og ko-ekspresjon av BDNF og TrkB (C), henholdsvis. CRC pasienter med høyt BDNF mRNA uttrykket (n = 102) hadde signifikant dårligere OS enn de med lav BDNF mRNA uttrykket (n = 121, log-rank test, P = 0,0066). Tilsvarende CRC pasienter med høyt TrkB mRNA uttrykk (n = 171) hadde signifikant dårligere OS enn de med lav TrkB mRNA uttrykk (n = 52, log-rank test, P = 0,0474). CRC pasienter med tumorer co-uttrykt BDNF og TrkB (n = 94) hadde en betydelig dårligere OS enn de med andre uttrykk mønster (n = 129, log-rank test, P = 0,0348).
(A ): Sammenligning mellom total overlevelse av pasientgrupper med høy BDNF mRNA ekspresjon (n = 102) og de med lave BDNF mRNA ekspresjon (n = 121). (B): Sammenligning mellom total overlevelse av pasientgrupper med høy TrkB mRNA ekspresjon (n = 171) og de med lav TrkB mRNA ekspresjon (n = 52). (C): Sammenligning mellom den totale overlevelse for pasientgrupper med høy ko-ekspresjon av BDNF og TrkB (n = 94) og de uten den (n = 129). TrkB mRNA uttrykk viser mRNA-transkript nivåer av både TrkB.FL og TrkB.T1.
BDNF og TrkB protein uttrykk i de primære og metastatiske svulster
Immunohistochemistry viste at BDNF protein ( A, B) ble uttrykt i cytoplasma av humane CRC-celler, og at TrkB protein (C, D) ble uttrykt i kjernen av humane CRC-celler (figur 2). Hos pasienter med både primærtumor (A, C) og peritoneal metastatiske knuter (B, D), menneskelige CRC celler ved peritoneal metastatiske knuter uttrykt både BDNF og TrkB, som gjorde de på primærtumor. Vi bekreftet at anti TrkB antistoff (R P . 0,05
Disse resultater antyder at eksogent BDNF øker tumorcellelevedyktighet i trkB-uttrykkende CRC-celler, og at TrkB reseptorblokade kan gi en potent middel for å inhibere tumorvekst
BDNF fremmer migrasjon i trkB-uttrykke CRC celler
for å undersøke effekten av BDNF på tumor cellemotilitet, DLD1 celler ble brukt for
in vitro
migrasjon analyser. Førti-åtte timer senere, BDNF økte signifikant migrering av DLD1 celler, sammenlignet med de ikke-behandlede kontroller. K252a redusert den vandrende evne til DLD1 celler, som var nesten identisk med de ikke-behandlede kontroller. K252a fulgt av BDNF hemmet migrerende evne til DLD1 celler, sammenlignet med BDNF behandling. De representative bilder av de ovenfor angitte resultater ble vist i figur 5A. Kvantitativ analyse av cellemigrering er også vist (figur 5B). *; *; *; *; *;
