Abstract
Bakgrunn
microRNAs (mirnas) spiller en avgjørende rolle i tumordannelse, enten som en tumor suppressor eller som et onkogen miRNA, avhengig av ulike krefttyper. Hittil har forskerne fått en betydelig mengde kunnskap med hensyn til mirnas i bukspyttkjertelkreft. Men uttrykket og funksjon av MIR-371-5p i kreft i bukspyttkjertelen er ikke klart belyst. Hensikten med denne studien var å undersøke rollene til Mir-371-5p i bukspyttkjertelkreft og sin tilknytning til overlevelse av pasienter med kreft i bukspyttkjertelen.
Metoder
uttrykk for MIR-371 -5p ble undersøkt i pankreasgang adenokarsinom (PDAC) og deres tilstøtende normale bukspyttkjertelen vev (ANPT) eller i bukspyttkjertelkreft cellelinjer ved QRT-PCR. Foreningen av MIR-371-5p uttrykk med total overlevelse ble bestemt. Spredning og apoptose av SW-1990 og Panc-1 celler, transfektert med MIR-371-5p etterligner eller hemmer, ble vurdert ved hjelp av MTT-analyse og flowcytometri, henholdsvis. Den tumorigenicity ble evaluert via mus xenograft eksperimenter. MIR-371-5p promoter interaksjoner ble analysert av kromatin immunoutfellingsstudier analyser (chip). Protein uttrykket ble analysert ved Western blot.
Resultater
Uttrykket nivået av MIR-371-5p ble dramatisk oppregulert i kliniske PDAC vev sammenlignet med ANPT. Pasienter med høy MIR-371-5p uttrykk hatt en betydelig kortere overlevelse enn de med lav MIR-371-5p uttrykk. Den in vitro og in vivo-analyser viste at overekspresjon av MIR-371-5p resulterte i celleformering og økt tumorvekst, noe som var forbundet med inhibitor for vekst 1 (ING1) nedregulering. Interessant, fant vi også at ING1 i sin tur hemmet uttrykk for MIR-371-5p i promoter regionen.
Konklusjoner
vår studie viser en roman ING1-MIR-371-5p regulatorisk feedback loop, som kan ha en avgjørende rolle i PDAC. Dermed MIR-371-5p kan vise seg å være en roman prognostisk faktor og terapeutisk mål for kreft i bukspyttkjertelen behandling
Citation. Han D, Miao H, Xu Y, Xiong L, Wang Y, Xiang H et al . (2014) MiR-371-5p Forenkler Bukspyttkjertelkreft celleproliferasjon og Reduserer pasientens overlevelse. PLoS ONE 9 (11): e112930. doi: 10,1371 /journal.pone.0112930
Redaktør: Xin Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina
mottatt: 10 juli 2014; Godkjent: 16 oktober 2014; Publisert: 20.11.2014
Copyright: © 2014 Han et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Innovasjon naturvitenskapelige TechnologyCommission Shenzhen Kommune (No. JCYJ20140414103937769). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datacollection og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
PDAC er en svært ondartet fenotype preget av rask progresjon, tidlig metastasering, og en begrenset respons på strålebehandling og kjemoterapi. Til tross for mer enn 10 år med FDA-godkjente terapiregimer og store forbedringer i medisinsk behandling, har ingen signifikant effekt på PDAC pasient overlevelse observert [1]. Nå er det den fjerde største årsaken til kreft-relaterte dødsfall i USA med en 5% 5-års overlevelse årlig [2]. Derfor er det et presserende behov for å identifisere biomarkører som vil fremme tidlig diagnose og lar personlige behandlingsstrategier for pasienter med høy risiko for PDAC.
utvikling og progresjon av PDAC er en kompleks prosess, med dereguleringen av flere gener som er viktige for cellebiologiske prosesser. Transkripsjonsfaktorer (TFS) og mirnas er fremtredende regulatorer for genuttrykk [3]. I de siste 10 årene, mirnas er spesielt viktig i nesten alle svulst utviklingsstudier fordi de kan være mål av genomiske lesjoner, kontrollert av klassiske tumor signaler, og de selv til stede som en klasse av onkogener eller tumor suppressors [4]. Nylig mirnas har blitt foreslått å være nært forbundet med PDAC tumorigenesis [5].
mirnas er små (21-24 nt) ikke-kodende RNA-molekyler som regulerer genuttrykk ved å binde løst komplementære sekvenser i tre « utranslaterte regionen i mål mRNA å undertrykke oversettelse eller indusere mRNA cleavage [6]. Oppdagelsen av miRNAs har kastet nye innsikter om regulering av celledeling, differensiering, apoptose og senescence, og har også bidratt til pasientbehandling, herunder diagnose og behandling [7].
Selv om tidligere studier har avklart rollene av mange miRNAs i kreft i bukspyttkjertelen [8], har ingen studier adressert rollen MIR-371-5p. Nyere studier har vist at MIR-371-5p ble signifikant forhøyet i mage kreft (GC) pasienter og regulert hepatocellulært karsinom (HCC) celleformering ved å akselerere G1 /S overgang [9], [10]. Spesielt ytterligere validering indikerte at serum MIR-371-5p, som en roman biomarkør, hadde stort potensial i å skille GC pasienter fra friske kontroller [9]. Vi har derfor hypotese at MIR-371-5p kan også være en ny mekanisme for å bidra til økt PDAC risiko ved å forstyrre cellesyklusprogresjon via rettet mot cellesyklusrelaterte gener. For å løse dette problemet, sammenlignet vi MIR-371-5p uttrykk profiler mellom PDAC vev og ANPT. Vi her viser at MIR-371-5p ekspresjon var signifikant oppregulert i PDAC vev sammenlignet med ANPT, noe som resulterte i celleformering og økt tumorvekst. Dermed kan MIR-371-5p vise seg å være en roman prognostisk faktor og terapeutisk mål for kreft i bukspyttkjertelen behandling.
Materialer og metoder
Cell kultur
PDAC cellelinjer SW-1990 og Panc-1 ble oppnådd fra den kinesiske Senter for Type Culture Collection (Shanghai, Kina). Celler ble opprettholdt i RPMI-1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum og antibiotika (100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin sulfat). Cellene ble dyrket i en fuktet inkubator ved 37 ° C tilsatt 5% CO2.
celleproliferasjonsanalyse
MTT [3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl) -2 5-diphenyltetrazoliumbr-omide] – baserte analysen ble utført for å anslå effekten av MIR-371-5p på PDAC celleproliferasjon. Celler ble sådd ut i 96-brønners plater (5.000 celler /brønn i 200 ul medium) og inkubert i 24 timer ved 37 ° C, 5% CO
2. PDAC celler ble transfektert med MIR-NC, MIR-371-5p, MIR-kontroll, anti-MIR-371-5p, NC-siRNA eller ING1-siRNA hjelp Lipofectamine 2000 reagens (Life Technologies) for 1, 2, 3 og 4 dager, henholdsvis, i henhold til produsentens instruksjoner. Celler dyrket med komplett medium ble brukt som blindprøve. Ved slutten av kulturen ble 20 ul av 5 mg /ml MTT (Sigma, USA) oppløsning ble tilsatt per brønn, og cellene ble inkubert i ytterligere 4 timer ved 37 ° C. Supernatantene ble fjernet og formazankrystaller ble oppløst i 150 ul dimetylsulfoksid (Sigma, USA). Til slutt ble optisk tetthet bestemt ved 490 nm ved hjelp av multi-mikrotestsystem (Polarstar Optima, Tyskland). I hver analyse ble foretatt fem parallelle brønner, og resultatene ble oppsamlet som gjennomsnitt av mer enn tre uavhengige eksperimenter. Lysates ble høstet for western blot analyse.
Cell syklus analyse
For å analysere cellesyklus, DNA innhold per kopi ble analysert ved hjelp av FACSort Cellquect programvare (BD Biosciences, USA). PDAC Celler ble plassert i seks-brønns plater over natten og transfektert med MIR-NC, MIR-371-5p, MIR-con, anti-MIR-371-5p, NC-siRNA eller ING1-siRNA for henholdsvis 48 timer.
ved slutten av dyrkningen ble cellene fiksert i 75% iskald etanol over natten ved 4 ° C. De fikserte celler ble merket med 50 ug /ml propidiumjodid (PI) inneholdende 50 pg /ml RNase A (DNase fri) i 15 min ved romtemperatur i mørke og analysert ved fluorescens-aktivert cellesortering (Becton Dickinson, USA). Cellene ble eksitert ved 488 nm, og emisjonen ble oppsamlet gjennom et 630 nm filter. I alt ble 20.000 celler hentet fra hver prøve. Cellesyklusfordelingen ble evaluert ved å beregne hvor stor andel av cellene i G0 /G1, S og G2 /M-fase. I hvert uavhengige forsøk ble gjort tre parallelle brønner, og fremgangsmåten ble utført i tre eksemplarer. Data oppnådd ble presentert som gjennomsnitt ± SD.
luciferase reporter-assays
I korthet ble fragmentene av det 3′-ikke-translaterte region (3′-UTR) av ING1 mRNA som inneholder den antatte (WT) var amplifisert ved PCR fra genomisk DNA, og PCR-produktet ble subklonet inn i en pGL3-kontroll-vektor (Promega, USA) umiddelbart nedstrøms av luciferasegenet. For konstruksjon av mutant pGL3-ING1 (MU), ble Quickchange seterettet mutagenese kit (Stratagene) som brukes til å indusere seks punktmutasjoner i UTR-regionen i WT-pGL3-ING1. Plasmid DNA ble sekvensert for autentisitet.
For luciferase reporter analysen ble cellene transfektert med 300 ng av pGL3-ING1-WT eller pGL3-ING1-Mut konstruksjoner og pcDNA3-MIR-371-5p eller negativ kontroll ved hjelp av Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i følge produsentens protokoll. Hver prøve ble kotransfektert med 50 ng av PRL-TK plasmid som uttrykker Renilla luciferase (Promega, USA). Celler ble samlet 48 timer etter transfeksjon og analysert ved anvendelse av dual-luciferase reporter Assay System (Promega, USA). Relative luciferase-målinger ble foretatt 48 timer etter transfeksjon ved bruk av dual luciferase reporter Assay System (Promega, USA) ved anvendelse av en luminescens-teller. Transfeksjonene ble utført i duplikat og gjentatt minst 3 ganger i uavhengige eksperimenter. MiR-371-5p inhibitor, siING1 og deres negative kontroller (NC) ble kjøpt fra Panagene Inc (koreansk) og henholdsvis Santa Cruz (USA). -Sekvenser var som følger: MIR-371-5p inhibitor: 5′-TTTTAACATTGCACT-3 «. Ad-ING1 adenovirus (Cat #: 1601) og dens kontroll Ad-GFP adenovirus (Cat #: 1700) ble kjøpt fra Vector Biolabs (USA)
Kvantitativ RT-PCR
Total RNA. ble isolert ved anvendelse av Trizol reagens (Invitrogen, USA). 2 mikrogram total RNA ble revers transkribert ved hjelp av MIR-371-5p spesifikke revers transkripsjon primere (Ribobio, Kina) med poly-A polymerase basert First-Strand Synthesis kit (Takara Bio, Japan) etter produsentens protokoll, og den relative uttrykk for MIR-371-5p ble fastsatt ved hjelp SYBR Premiks Ex Taq (Takara, Kina). U6 snRNA ble anvendt for normalisering. Delta-Ct-metoden ble anvendt for å evaluere analysene av sanntids-PCR-data. I semikvantitativ RT-PCR, idet ende PCR-produktene etter visst antall sykluser ble elektroforert på 2% agarosegeler etterfulgt av farging med etidiumbromid, og fotografert under UV transilluminasjon. Primere for MIR-371-5p: RT primer, 5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGTGCC-3 «; Forward, 5»-GTCGTATCCAGTGCAGCCG-CCACTCAAACTGTGGGG-3 «. Primere for U6 snRNA: RT primer, 5»-GGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACAAAAT-ATGG-3 «; Forward, 5»-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3 «.
Chromatin immunoprecipitation assay (chip)
ING1 binding til arrangøren av MIR-371-5p ble testet ved hjelp av ChIP analyse. ChIP Analysen ble utført ved bruk av EZ-chip-kit fra Millipore (Millipore, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet, omtrent 3 x 10
6 Panc-1, infisert med enten Ad-GFP-ING1 eller Ad-GFP adenovirus ble kryssbundet ved anvendelse av 1% formaldehyd (Bio-Rad, USA) i 15 minutter ved 37 ° C. Cellene ble høstet etter bråkjøling med 0,125 M glycin og lysert i ChIP lyseringsbuffer (150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 50 mM Tris (pH 8,0), 0,1% deoksykolat, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 ug /ml pepstatin, 1 ug /ml aprotinin og 1 ug /ml leupeptin). Ekstraktene ble sonikert seks ganger i 9 s hver, og lysater ble slynget ved sentrifugering ved 14 000 rpm i 20 min ved 4 ° C. Av dette utvalget, ble 150 ul brukt som input. Supernatantene ble immunoprecipiated med enten anti-ING1 eller med muse-IgG (negativ kontroll) ved 4 ° C i 4 timer, etterfulgt av protein G-Sepharose (Sigma, USA) i 2 timer ved 4 ° C. Immunopresipitatene ble sekvensielt vasket med 1 ml chip lyseringsbuffer to ganger, spon lysis buffer med 500 mM NaCl to ganger og med LiCl /detergentløsning (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 250 mM LiCl, 0,5% NP-40, 0,5% natriumdeoksycholat, 1 mM EDTA) to ganger og til slutt med TE-buffer (10 mM Tris og 1 mM EDTA, pH 8,0). Kulene ble eluert ved anvendelse av 1% SDS og 0,1 M natriumbikarbonatløsning. Inngangen og elueringsmidlet prøvene ble revers-tverrbundet ved hjelp av NaCl i 5 timer ved 65 ° C. DNA fra prøvene ble isolert ved fenol-kloroform, fulgt av etanolutfelling. Promoter binding ble undersøkt ved hjelp av PCR ved anvendelse av primere som spenner over de oppstrøms regioner av MIR-371-5p startsetene, primersekvenser: SMD-ING1, F: 5′-AATGTTCACTGCCGCACTGT-3 «; R: 5»-ACACCTATAATCCCTGC- TAC-3 «; ChIP-neg-F: 5’ACGGCCAACATGCTCAGG-3 «; R: 5»- TGTTTGCAACTGCTGCGTTAG-3 «
Western blot
Cellene ble lysert med 1% RIPA lysebuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0,150 mM natriumklorid, 1. % NP-40, 0,5% natriumdeoksykolat, 0,1% natriumdodecylsulfat, 2 mM EDTA) inneholdende 1 x protease inhibitor cocktail (Roche) 48 timer etter transfeksjon. Supernatantene ble oppsamlet, og proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved anvendelse av BCA Assay Kit (Pierce). Proteinprøvene ble separert på 10% SDS-PAGE og deretter overført til en PVDF-membran. Membranen ble blokkert med 5% ikke-fettholdig melk, etterfulgt av en inkubering over natten ved 4 ° C med en indikert primært kanin-antistoff. Membranen ble vasket tre ganger i TBST og deretter inkubert med et sekundært antistoff. Endelig, ble det bundne antistoff påvist ved kjemiluminescens med ECL deteksjonsreagensen (Pierce). Dataene ble normalisert til GAPDH eller β-aktin.
In vivo
bukspyttkjertelkreft xenograft modell
Panc-1 celler fra moderat differensiert PDAC ble stabilt transfektert med MIR-371 -5p eller MIR-NC-kontroll plasmid. De transfekterte celler ble samlet inn, suspendert i 200 mL PBS (1 × 10
7 celler), og ble injisert subkutant i 4 uker gamle BALB /c naken mus (
n
= 10 /gruppe) . Musene ble holdt i en spesifikk patogen-fritt miljø for 5 uker og deretter avlivet. Svulsten volum
V
ble beregnet ved hjelp av sin lengde
L Hotell og bredde
W
, ifølge ligningen
V
= 0,4
LW
2. Bruken av hårløse mus holdt Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr og studien ble godkjent av Animal Care og bruk komité Southern Medical University.
Pasienter og tumorvev
totalt 60 mennesker kreft i bukspyttkjertelen vev (PC) og matchet normale tilstøtende bukspyttkjertelen vev (NP) ble oppnådd i løpet av kirurgi ved Baoan Hospital (Shenzhen, Kina) mellom januar 2008 og desember 2010. diagnosen var basert på patologisk bevis. Videre ble ytterligere 15 par av PDAC og deres kontrollprøver samlet inn fra pasienter under kirurgiske frioppstillinger og lagret i flytende nitrogen. Alle 75 pasienter gitt skriftlig informert samtykke til bruk av sine vev og studieprotokollen ble godkjent av etikkomiteen av Southern Medical University.
Statistisk analyse
sammenslutninger av MIR-371- 5p uttrykk med de kliniske patologiske egenskaper ble analysert ved hjelp av Chi-kvadrat eller Mann-Whitney tester. Overlevelseskurven ble bygget ved hjelp av Kaplan-Meier metoden og sammenlignet med log-rank test. Grupper ble sammenlignet ved hjelp av en student
t
-test. Korrelasjonsanalyse ble utført med Spearmans korrelasjonsanalyse. Alle sannsynlighets verdier ble analysert ved hjelp av en to-tailed test, og statistisk signifikans ble avsluttet ved
* P 0,05,
** P 0,01,
*** P 0,001; # Representerer ingen statistisk signifikans. Analysene ble utført ved bruk av SPSS (versjon 17.0) programvare (SPSS Inc., USA). Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (SD).
Resultater
oppregulering av MIR-371-5p i kreft i bukspyttkjertelen vev er assosiert med overlevelse
For å bestemme uttrykk nivåer av MIR-371-5p i bukspyttkjertelen kreftpasienter, ble Mir-371-5p påvist i alle de 15 parene av kreft i bukspyttkjertelen vev og deres matchet noncancerous bukspyttkjertelen vev ved hjelp av en QRT-PCR-metoden. Som vist i Fig.1A, PC-vev viste signifikant høyere ekspresjon av MIR-371-5p sammenlignet med den for NP vev (
P
0,05). Videre Kapan-Meier overlevelsesanalyse viste at pasienter med en MIR-371-5p positivt uttrykk (Fig.1B) hadde en betydelig dårligere prognose enn de med et negativt uttrykk (Fig.1C). Den multivariate Cox regresjonsanalyse indikerte at Mir-371-5p uttrykk (farer ratio [HR] = 2,748, 95% konfidensintervall [CI] = 1,211 til 5,914, P = 0,03), var uavhengige prognostiske faktorer for total overlevelse.
(A) Gjennomsnittlig uttrykk nivå av MIR-371-5p i humane PDAC prøver (
n
= 15) og normal bukspyttkjertelen vev (
n
= 15). miRNA overflod ble bedømt ved QRT-PCR og normalisert til U6 RNA. Verdier er presentert som gjennomsnitt ± S.D. (B og C) MIR-371-5p uttrykk nivåer og total overlevelse etter reseksjon av kreft i bukspyttkjertelen med MIR-371-5p -negativ versus MIR-371-5p -positive grupper. Mir-371-5p – positive gruppen hadde signifikant kortere overlevelse enn MIR-371-5p -. Negativ gruppe (n = 30 /gruppe,
P
= 0,021)
MiR-371-5p forfremmet celleproliferasjon både
in vitro Hotell og
in vivo
for å utforske effekten av MIR-371-5p på bukspyttkjertelen kreftceller vekst, PDAC cellelinjer med ulike karakterer SW-1990 og Panc-1 ble transient transfektert med en MIR-317-5p etterligne eller hemmer (anti-MIR-371-5p) og deres respektive norsk sokkel. Den QRT-PCR-analyse viste at Mir-371-5p ligner forårsaket en 14,42 og 6,47 ganger økning i MIR-371-5p uttrykk i PANC-en og SW-1990 celler, henholdsvis (Fig.2A). I mellomtiden ble redusert anti-MIR-371-5p MIR-371-5p ekspresjon ved 3,14 og 3,28 folder i PANC-1 og SW-1990-celler respektivt, sammenlignet med kontrollcellelinjer (Fig.2B). MTT-proliferasjonsanalyse ble utført i SW-1990, og Panc-1-celler som ble transient transfektert med en MIR-371-5p etterligne eller inhibitor. Resultatene viste at Mir-371-5p -mimics forfremmet tumorcellevekst, mens anti-MIR-371-5p hemmet tumorcellevekst (P 0,01, Fig.2C og D) For å undersøke mekanismen som anti-speil 371-5 inhiberer celleproliferasjon, vi analyserte cellesyklusfordelingen av Panc-1 og SW-1990-celler som ble transfektert med anti- MIR-371-5p og kontrollen. En større andel av celler transfektert med det anti- MIR-371-5p akkumulert i G1 fase, mens S-fasen befolkningen redusert (Fig.2E). Imidlertid, en motstående resultat ble observert i celler transfektert med den MIR-371-5p (data ikke vist). Disse resultatene antydet at den proliferative hemming av anti- MIR-371-5p var delvis på grunn av en G1-fase arrestasjonen av de to bukspyttkjertelkreft cellelinjer.
(A og B) Uttrykket nivået av MIR-371 -5p ble testet i 48 timer i kreft i bukspyttkjertelen celler transfektert med MIR-371-5p ligner, anti-MIR-371-5p og deres respektive kontroll (NC, 40 nM) ved QRT-PCR. (C og D) Spredning av PDAC cellelinjer transient transfektert med MIR-371-5p etterligner, MIR-371-5p inhibitor eller kontroll ble analysert ved MTT-proliferasjonsanalyse. (E) Anti-MIR-371-5p øker andelen av celler i G1 som estimeres ved hjelp av flowcytometri (venstre panel **
P
0,01, n = 4). Og representant cellesyklus histographs (anti-MIR-NC vs anti-MIR-371-5p) er presentert (høyre panel). (F) Nude mus ble subkutant inokulert med Panc-1 celler transfektert med MIR-371-5p plasmid eller MIR-NC-kontroll plasmid, i flankene. Bildet er representativt for tumorer dannet i 10 mus. (G) vekstkurver for tumorvolumer. Grafen er representativ for tumorvekst, 5 uker etter inokulering. Tumorvolumet ble beregnet, og alle data er vist som gjennomsnitt ± S.D. (
n
= 10).
For å kunne fastslå om MIR-371-5p var involvert i tumorgenesen, en stabil MIR-371-5p -overexpression cellelinje og kontroll cellelinje ble subkutant injisert inn i nakne mus, og i sin tur, ble tumorvekst aktivitet målt. Når tumorene ble høstet, det gjennomsnittlige volum av svulstene avledet fra MIR-371-5p gruppe var større sammenlignet med kontrollgruppen (Fig.2F og G,
P
0,05). Disse resultatene var konsistente med effekten av MIR-371-5p overekspresjon in vitro og sterkt antydet at Mir-371-5p kan fremme spredning av PDAC celler.
ING1 er et direkte mål på MIR-371-5p og involvert i MIR-371-5p induserende fremme PDAC celler spredning
for å undersøke mulighetene mål gjennom som MIR-371-5p fremmer spredning av kreft i bukspyttkjertelen celler, vi tok fordel av bioinformatikk for å forutsi den antatte MIR-371-5p mål. Både Target Scan og Miranda systemer spådd ING1, en nøkkel tumor suppressor, for å være en antatt mål av MIR-371-5p. For å kontrollere om MIR-371-5p direkte rettet MIR-371-5p mRNA i PDAC svulster og cellelinjer, in vitro og i silico analyse ble gjennomført. Først ble anti- MIR-371-5p eller kontroll transfektert inn i SW-1990 og Panc-1 celler, og vi fant ut at hemmet uttrykk for MIR-371-5p økt ING1 protein nivåer i begge linjer (Fig. 3A). Deretter MIR-371-5p etterligne eller kontroll ble transfektert inn over 2 cellelinjer. Vi fant ut at tvang uttrykk for MIR-371-5p redusert ING1 protein nivåer i begge cellelinjene konsekvent (Fig. 3A). Resultatene indikerte at Mir-371-5p kan fremme spredning av PDAC celler med avtagende av ING1 uttrykk in vitro.
(A) ING1 uttrykk i SW-1990 og Panc-1 celler etter transfeksjon med anti- MIR -371-5p, eller MIR-371-5p etterligner eller kontroll oppdaget av western blotting. (B-I) ING1 ble oppdaget av qRTPCR i 50 bukspyttkjertelkreft (PC) vev og ble matchet de tilstøtende noncancerous bukspyttkjertelen vev (NP). Den ING1 overflod ble normalisert mot GAPDH. (B-II) Forholdet mellom ING1 og MIR-371-5p uttrykk ble utforsket av Spearmans korrelasjon i 50 PDAC vev. ING1 uttrykket er negativt korrelert med MIR-371-5p i 50 PDAC tumorvev. (C) Forutfølge sammenkobling av target 3′-UTR regionen ING1 (villtype eller mutert) og Mir-371-5p moden sekvens. Luciferase-aktivitet på tilstedeværelsen av både villtype ING1 3′-UTR eller mutant og MIR-371-5p ble sammenlignet med kontrollen. (D) Western blot ble utført for å analysere ING1 ekspresjon i transfekterte si ING1 Panc-1 celler. β-aktin ble benyttet som en intern kvantitativ kontroll. (E) Effekt av siING1 på celleformering ble målt ved MTS-analyse. (F) Panc-1 celler ble transfektert med NC, MIR-371-5p hemmer eller MIR-371-5p hemmer og siING1, og deretter MTS analysen ble utført.
For ytterligere å bekrefte regulatoriske forhold mellom MIR-371-5p og ING1, undersøkte vi uttrykket av ING1 i PDAC prøver (PC) og deres tilsvarende normalt vev (NP). Bruke QRT-PCR, fant vi at det gjennomsnittlige nivået på ING1 uttrykk var betydelig lavere i PC-vev i forhold til at av de NP vev (Fig. 3B-I). En signifikant invers korrelasjon ble observert mellom ING1 og MIR-371-5p uttrykk i bukspyttkjertelkreft vev (Spearmans korrelasjon, r = -0,4802) og tilstøtende vev noncancerous (r = -0,4103, data ikke vist) (Fig. 3B-II).
for å vurdere muligheten av MIR-371-5p binding til 3’UTR av ING1, utførte vi en luciferase reporter analysen og observerte en betydelig reduksjon i luciferase aktivitet i nærvær av MIR-371-5p – ING1 i SW-1990 celle, sammenlignet med kontrollene (fig. 3C). For å validere om ING1 var et direkte mål på MIR-371-5p, muterte vi Mir-371-5p bindingsseter i 3’UTR av ING1 og observert tap av undertrykkelse (Fig. 3C). Til sammen viser resultatene at det ING1 var et direkte mål på MIR-371-5p.
For å belyse hvorvidt den vekstfremmende effekten av MIR-371-5p ble formidlet av undertrykkelse av ING1 i PDAC celler, effekten av ING1 på cellevekst ble undersøkt. Først ble Panc-1 celler transfektert med siRNA mot ING1 eller sin kontroll, og da vi undersøkte cellevekst ved MTT-analyse (Fig. 3D). MTT analyseresultatene viste at genet Slå av ING1 fremmet celleproliferasjon av Panc-1 celler (Fig.3E). Dessuten ble den hemmende effekten av MIR-371-5p inhibitor på cellevekst reverseres når ING1 uttrykk ble knockdown (Fig.3F). Samlet utgjør disse funnene indikerte at ING1 er et funksjonelt viktig mål for MIR-371-5p som er involvert i spredning av PDAC celler.
ING1b regulerer MIR-371-5p uttrykk
ING familie av type II tumor suppressors tjene som både epigenetiske «lesere» og målrette histon acetyl transferase (HAT) og histondeacetylase (HDAC) «forfattere «av epigenetisk histone kode [11]. Den ING1-proteinet har også vært implisert i regulering av miRNA nivåer [12]. For å finne ut om ING1 regulerer MIR-371-5p uttrykk, ble Panc-1 celler infisert med adenovirus uttrykker GFP alene eller sammen med adenovirus uttrykker både GFP og ING1. MiR-371-5p ble bekreftet å redusere betydelig og reproduserbart svar på ING1 overekspresjon (Fig.4A). I tillegg, som vist i Fig.4B, suberoylanilide hydroksamsyre (Saha), et histon-deacetylase (HDAC) inhibitor, økt MIR-371-5p ekspresjon betydelig i Panc-1 celler, som er i overensstemmelse med epigenetisk regulering av ING1 som en del av HDAC1 og HDAC2 komplekser. Men Saha ikke endre ING1 uttrykk. ChIP analyse av ING1 viste at ING1 bundet til arrangøren området MIR-371-5p (Fig.4C), noe som indikerer at ING1 direkte regulerer MIR-371-5p uttrykk. Dermed ING1 epigenetiske regulerer MIR-371-5p uttrykk i PDAC.
(A) Uttrykket av MIR-371-5p i Panc-1 celler som svar på ING1 overekspresjon for 48 hs, ble bestemt av kvantitativ real . -Tid PCR-analyser (øvre panel Barer representerer gjennomsnitt ± SD (**
P
. . 0.01, n = 5) (nedre panel) Western blot ble utført for å analysere ING1 uttrykk (B) MIR -371-5p nivå ble bestemt ved anvendelse av sanntids RT-PCR i PANC-1 celler som respons på behandling med HDAC-inhibitoren suberoylanilide hydroksamsyre (Saha). Søyler representerer gjennomsnitt ± SD (øvre panel, *
P
0,05, n = 5) (nedre panel) Western blot ble utført for å analysere ING1 uttrykk (C) Celler infisert med kontroll GFP adenovirus eller med det samme viruset også koder for ING1 ble innhøstet 24 timer senere og forberedt for brikken.. analyse ved hjelp av kontroll eller ING1 antistoffer. PCR av immunoutfellingsstudier produkter viste at ING1 bundet til oppstrøms regionen MIR-371-5p.
Diskusjoner
En fullstendig forståelse av de molekylære mekanismene som ligger til grunn bukspyttkjertelen tumor initiering og progresjon er viktig for nye prognostiske og terapeutiske tilnærminger for å bedre utfallet av pasienter med kreft. I løpet av de siste årene, er mirnas fremstår som en ny klasse av genet regulatorer som er involvert i ulike svulster [13]. Her gir vi den første bevis for at Mir-371-5p spiller en avgjørende rolle i bukspyttkjertelen tumorigenesis. Det er ofte oppregulert i PDAC. Konsekvent, er MIR-371-5p overekspresjon markert forbundet med negative pasientenes overlevelse, noe som tyder på at det er et dårlig prognostisk faktor. Den positive forholdet mellom MIR-371-5p nivåer med spredning støtter forestillingen om at det fungerer som en onko-miRNA.
Egenskapene observert hos pasienter med PDAC er rekapitulert i mus xenograft modeller. MiR-371-5p-overekspresjon celler utvikle store svulster, som er hjemfalt av injeksjoner av en spesifikk hemmer mot den. En motsatt atferd er observert med MIR-371-5p lav-uttrykke celler og injeksjon av den tilsvarende ligne RNA. Til dags dato har MIR-371-5p vist seg å være involvert bare i levercellekarsinom, noe som indikerer at dens overekspresjon er assosiert med mer aggressive svulster og et dårligere utfall [14], i samråd med data innhentet i PDAC. Men bidraget fra MIR-371-5p til denne prosessen må ytterligere undersøkelser.
Vår forståelse av de biologiske funksjonene til miRNA er avhengig av identifisering av relevante målgener. Imidlertid er prediksjon av miRNA mål fortsatt et utfordrende forskningsfelt. Flertallet av miRNA-målsekvens matching er basert på ufullkommen komplementaritet av miRNA med 3′-UTR av målet mRNA. Kravet om komplementaritet av bare syv eller åtte nukleotider kan føre til hundrevis av mulige mål [15]. Så langt, svært få mål gener fra Mir-371-5p har blitt bekreftet i ulike biologiske systemer.
Heri, validere vi ING1 som en direkte funksjonell mål av MIR-371-5p i PDAC, legge til informasjon til tidligere rapportert celletyper [16]. ING familien av type II tumor-suppressorer bidrar til veksten av forskjellige tumorer [17]. Denne familien er godt bevart og inneholder fem gener. Blant dem,
ing1
er best karakterisert medlem og koder fire protein isoformer [18]. ING familie av tumor suppressors fungerer som lesere og forfattere i histone epigenetisk kode, som påvirker DNA-reparasjon, kromatin remodeling, mobilnettet senescence, cellesyklusregulering og apoptose [18]. Overekspresjon av ING1 forårsaket cellesyklus arrest i G1 fasen med påfølgende apoptose, mens undertrykkelse av sitt uttrykk økt koloni fokus dannelse og vekst
in vitro Hotell og tumordannelse
in vivo product: [19]. Men forblir de detaljerte molekylære mekanismer som ING1 fungerer som en tumor suppressor ikke fullstendig definert.
ING1 regulerer genekspresjon via regulere histone acetylering og metylering [20]. ING1 er den viktigste målet for HDAC hemmer Saha, og ser ut til å primært regulere kromatin komprimering og senere, uttrykket av undergrupper av gener gjennom epigenetiske mekanismer. I tillegg har mange mirnas blitt rapportert å være regulert av epigenetiske mekanismer [21]. Derfor spurte vi om MIR-371-5p er regulert av ING1. I denne studien, viser vi at uttrykket av MIR-371-5p er epigenetiske regulert av ING1 og at Mir-371-5p reverserer en betydelig andel av de hemmende effekter av ING1 på celleproliferasjon. Videre endringer i ING1 uttrykk påvirker celleproliferasjon og apoptose, reprodusere i en omvendt-modus effekter på grunn av MIR-371-5p, som ytterligere demonstrert i tumorprøver. Den gjensidige og inverse varianter av ING1 nivåer etter MIR-371-5p modulasjon viser tydelig at de er mekanistisk koblet. Den stramme samspillet mellom ING1 og MIR-371-5p er videre påvist av sin samtidig lyddemping: ING1 knockdown reverserer effektene på celleproliferasjon og apoptose på grunn av MIR-371-5p hemming, identifisere det som en stor nedstrøms effektor av miRNA.
