Abstract
transformerende vekstfaktor beta (TGF-β) signalveien er en tumor-suppressor sti som vanligvis inaktivert i tykk- og endetarmskreft (CRC). Den inaktivering av TGFBR2 er den vanligste genetiske arrangement som påvirker TGF-β signalveien. Imidlertid er mekanismen ved hvilken kreftceller nedregulere TGFBR2 er uklart. I denne studien fant vi at TGFBR2 protein nivåer konsekvent ble oppregulert i CRC vev, mens dets mRNA nivåer variert i disse vev, noe som tyder på at en post-transcriptional mekanisme er involvert i reguleringen av TGFBR2. Fordi microRNAs (mirnas) er kraftige post-transcriptional regulatorer av genuttrykk, utførte vi bioinformatiske analyser for å søke etter mirnas som potensielt rettet mot TGFBR2. Vi identifiserte den spesifikke målrettingen stedet av MIR-135b i 3′-utranslaterte område (3′-UTR) av TGFBR2. Vi identifiserte ytterligere en invers korrelasjon mellom nivåene av MIR-135b og TGFBR2 protein, men ikke mRNA, i CRC vevsprøver. Ved overekspresjon eller stanse MIR-135b i CRC celler, vi eksperimentelt bekreftet at Mir-135b binder direkte til 3′-UTR av TGFBR2 transkripsjon og regulerer TGFBR2 uttrykk. Videre ble de biologiske konsekvensene av målretting av TGFBR2 av MIR-135b undersøkt ved hjelp av in vitro-celleproliferasjon og apoptose analyser. Vi viste at Mir-135b hatt en svulst fremmende effekt ved å indusere spredning og hemme apoptose av CRC celler via den negative reguleringen av TGFBR2 uttrykk. Til sammen våre funn gir den første bevis som støtter den rollen MIR-135b som et onkogen i CRC via hemming av TGFBR2 oversettelse
Citation. Li J, Liang H, Bai M, Ning T, Wang C Fan Q, et al. (2015) MIR-135b Fremmer Cancer Progresjon av Targeting transformerende vekstfaktor beta-reseptor II (TGFBR2) i tykktarmskreft. PLoS ONE 10 (6): e0130194. doi: 10,1371 /journal.pone.0130194
Academic Redaktør: Shrikant Anant, University of Kansas School of Medicine, USA
mottatt: 9 februar 2015; Godkjent: 16 mai 2015; Publisert: 10 juni 2015
Copyright: © 2015 Li et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av Natural Science Foundation National of China (No. 81201946, 81372394, 81250044, 81401257), Kunnskapsdepartementet forskningsfond for doktorgrads program (No. 2012202120013), Foundation Science of Medical University of Tianjin (No.2011KY15), National Research Platform of Clinical Evaluering teknologi for nye kreftmedisiner (No. 2013ZX09303001). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er i dag den tredje vanligste kreftformen og den nest største årsaken til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis [1]. Oppbyggingen av genetiske og epigenetiske forandringer formidler CRC dannelse og progresjon av dereguleringen viktige signalveier i kreftceller [2,3]. I CRC, er en av de mest inaktiverte signalveier den transformerende vekstfaktor beta (TGF-β) signalveien, som har vært forbundet med etablering og progresjon av intestinale svulster [4].
TGF β signalveien spiller viktige roller i mange cellulære prosesser, inkludert cellesyklusregulering, cellemigrering, apoptose, og immunmodulering via to tilhørende trans serin /treonin-kinase-reseptorer av type i og type II serin /treonin-kinase-reseptorer [5]. TGF-β signalering blir initiert når liganden bindes til type II-reseptoren, som er etterfulgt av dimerisering av type II-reseptoren med type I reseptor. Innenfor dette heteromert kompleks, type II reseptor fosforylerer og aktiverer den type I reseptor-kinase, som forplanter signal ved å målrette komponenter nedstrøms av denne veien [6]. TGF-β signalveien virker som en tumor-suppressor i løpet av den tidlige fasen av CRC, som ofte blir inaktivert via nedregulering av TGFBR2 [7]. En reduksjon i TGFBR2 ekspresjonsnivåene er blitt assosiert med øket tumorgenisitet i en rekke humane tumorer, inkludert CRC [8]. Den inaktivering av TGBR2 på grunn av genetisk endring eller promoter metylering har blitt rapportert i spiserøret, mage og prostata cancer [9-11]. Inaktivering av TGFBR2 skyldes genetisk mutasjon eller metylering ble rapportert å først og fremst skje i mikro-ustabil CRC på grunn av DNA mismatch repair defekter [12-14]. Men svulster utviser mikro ustabilitet bare står for 10-15% av alle CRC tilfeller [15]. Mekanismen underliggende ikke-mismatch reparasjon-mangel CRC er fortsatt uklart. Disse observasjoner tyder på at andre molekylære mekanismer kan være involvert i nedregulering av TGFBR2; denne hypotesen krever videre undersøkelser.
microRNAs (mirnas) er en klasse av små ikke-koding, single-strandet RNA som spiller en viktig rolle i reguleringen av genekspresjon på post-transkripsjonsnivået [16-18 ]. Nyere bevis har indikert at mirnas kan fungere som onkogener eller tumor suppressors av repressing kreftrelaterte gener [19]. Endringer av miRNA uttrykket har blitt observert i en rekke humane tumorer, inkludert CRC [20,21]. Noen av disse miRNAs har tiltrukket seg spesiell oppmerksomhet på grunn av sitt engasjement i initiering, progresjon, og metastasering av kreft hos mennesker [22,23]. For eksempel er MIR-143 og MIR-145 (MIR-143/145) nedregulert i mange typer kreft, inkludert CRC [24,25]. Videre ble det rapportert at MIR-143/145 fungerer som tumor suppressors via hemming av KRAS oversettelse i menneskelig CRC [26-28]. Disse funnene understreker behovet for en grundig søk etter mirnas som er avvikende uttrykk under kolorektal kreftutvikling og behovet for en intensiv etterforskning av sin rolle i tumorbiologi.
Selv om deregulering av TGFBR2 og miRNAs er assosiert med tumorigenesis i menneskelig CRC, er lite kjent om hvilke mirnas handle på TGFBR2. I denne studien hypotese vi at TGFBR2 er et mål på MIR-135b. Etter måling uttrykket nivåer av MIR-135b og TGFBR2 i CRC vev og paret noncancerous vev, vi har oppdaget en invers korrelasjon mellom MIR-135b og TGFBR2 uttrykk i CRC. Videre i denne studien, vi eksperimentelt bekreftet direkte regulering av TGFBR2 av MIR-135b og den biologiske rollen Mir-135b-mediert regulering av TGFBR2 uttrykk i menneskelig CRC.
Materialer og Metoder
Menneskelig vev
CRC vev og sammenkoblede tilstøtende noncancerous vev ble oppnådd fra pasienter som gjennomgår kirurgiske prosedyrer på Affiliated Gulou Hospital of Nanjing University (Nanjing, Kina). Både tumor og noncancerous vev ble utsatt for histologisk analyse for diagnostisk bekreftelse. Den patologisk type hver kreft ble identifisert som adenokarsinom. Skriftlig samtykke ble gitt av alle pasientene eller deres foresatte, og etikkomiteen av The First Affiliated Hospital Anhui Medical University godkjent alle aspekter ved denne studien. Vevsfragmentene ble umiddelbart frosset i flytende nitrogen ved tidspunktet for kirurgi og ble lagret ved -80 ° C. De kliniske kjennetegn ved pasientene er oppført i S1 tabell.
Cell kultur
Den menneskelige CRC cellelinjer HT-29 og SW-480 ble kjøpt fra Shanghai Institute of Cell Biology av den kinesiske Academy of Sciences (Shanghai, Kina). HT-29 og SW-480-celler ble dyrket i RPMI-1640 medium (Gibco, Carlsbad, CA, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (Gibco) i en fuktet inkubator ved 37 ° C i 5% CO
2.
RNA isolering og kvantitativ RT-PCR
Total RNA ble ekstrahert fra de dyrkede celler og vev ved hjelp Trizol reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Analyser å kvantifisere modne miRNAs ble utført ved hjelp av TaqMan miRNA sonder (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Kort fortalt, en mikrogram total RNA ble revers-transkribert til cDNA ved hjelp av AMV revers transkriptase (Takara, Dalian, Kina) og en stilk-løkke RT primer (Applied Biosystems). Reaksjonsbetingelsene var som følger: 16 ° C i 30 min, 42 ° C i 30 minutter og 85 ° C i 5 minutter. Real-time PCR ble utført ved hjelp av en TaqMan PCR kit og en Applied Biosystems 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Reaksjonene ble inkubert i en 96-brønners optisk plate ved 95 ° C i 5 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min. Alle reaksjoner ble utført i tre eksemplarer. Etter reaksjonene var fullført, ble syklusen terskel (C
T) data samlet inn ved hjelp faste terskelinnstillinger, og gjennomsnittlig C
T ble bestemt ut fra tredoble PCR. En sammenlignende C
T metoden ble brukt til å sammenligne hver transkripsjon til kontrollene. U6 snRNA ble anvendt som en intern kontroll, og den relative mengde av miRNA normalisert til U6 snRNA nivåene ble beregnet ved bruk av formelen 2
-ΔΔCT, hvori ΔΔC
T = (C
T miRNA – C
T U6)
target – (C
T miRNA – C
T U6)
kontroll
for å kvantifisere TGFBR2 og GAPDH mRNA nivåer, en mikrogram total. RNA ble revers-transkribert til cDNA ved hjelp av oligo d (T) 18 primere (Takara) og ThermoScript reverstranskriptase (Invitrogen). Reaksjonsbetingelsene var som følger: 42 ° C i 60 min og 70 ° C i 10 min. Real-time PCR ble deretter utført på RT produkt, SYBR grønt fargestoff (Invitrogen) og spesifikke primere for TGFBR2 eller GAPDH. Sekvensene til primerne var som følger: TGFBR2 sense: 5′-GTAGCTCTGATGAGTGCAATGAC-3 «; TGFBR2 antisense: 5»-CAGATATGGCAACTCCCAGTG-3 «; GAPDH sense: 5»-GATATTGTTGCCATCAATGAC-3 «; og GAPDH antisense: 5»-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3 «. Reaksjonene ble inkubert ved 95 ° C i 5 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 30 s, 55 ° C i 30 s og 72 ° C i 1 min. Etter reaksjonene ble fullført, C
T-verdier ble bestemt i henhold til en fast terskel. Den relative mengde av TGFBR2 mRNA ble normalisert til GAPDH-mRNA-nivå.
miRNA overekspresjon
miRNA overekspresjon ble oppnådd ved å transfektere celler med en miRNA ligner, som er en syntetisk oligonukleotid-RNA dupleks ligne miRNA forløper sekvens. Syntetiske RNA-molekyler, inkludert pre-MIR-135b og en egge negativ kontroll RNA (pre-MIR-kontroll), ble kjøpt fra GenePharma (Shanghai, Kina). HT-29 og SW-480 celler ble sådd på seks-brønns plater og ble transfektert hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen) dagen etter, når cellene var omtrent 70% sammenflytende. For miRNA overekspresjon eksperimenter, ble 100 pmol av pre-MIR-135b brukt. Etter 6 timer ble mediet av HT-29 og SW-480-celler ble endret til RPMI-1640 medium supplementert med 2% føtalt bovint serum. Cellene ble høstet ved 24 timer eller 48 timer etter transfeksjon for isolering av total RNA eller protein, respektivt.
Plasmid konstruksjon og siRNA effektivitet assay
A pattedyr-ekspresjonsplasmid (pReceiver-M98 -TGFBR2) designet spesielt uttrykke full lengde åpen leseramme (ORF) av menneskelig TGFBR2 uten Mir-135b-responsive 3′-UTR ble kjøpt fra FulenGen (Guangzhou, Kina). Et tomt plasmid tjente som en negativ kontroll. SiRNA sekvens (5′-GATTCAAGAGTATTCTCACTT-3 «) rettet mot human TGFBR2 designet og syntetisert av Ribobio (Guangzhou, Kina). En kryptert siRNA (Ribobio) ble anvendt som en negativ kontroll. Overekspresjon plasmid eller siRNA ble transfektert inn i HT-29 under anvendelse av Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i overensstemmelse med produsentens instruksjoner. Totalt RNA eller protein ble isolert 24 timer eller 48 timer etter transfeksjon. De TGFBR2 mRNA og protein uttrykk nivåer ble vurdert gjennom kvantitativ henholdsvis RT-PCR og Western blot,.
Luciferase reporter analysen
Hele 3′-UTR av menneskelig TGFBR2 ble forsterket via PCR bruker menneskelig genomisk DNA som et templat. PCR-produktene ble deretter satt inn i pMIR-RAPPORT plasmid (Ambion, Austin, TX, USA). Den vellykkede innføring av denne sekvens ble bekreftet via DNA-sekvensering. For å vurdere binding spesifisitet, ble sekvensene som samhandler med frø regionen MIR-135b mutert (fra AGCUAUG til UCGAUAC for Mir-135b bindingssetet), og mutant TGFBR2 3′-UTR ble satt inn i en tilsvarende luciferase reporter plasmid. For luciferase reporter-analyser, ble HT-29 og SW-480-celler sådd ut på 24-brønners plater og ko-transfektert med 0,8 pg av den ildflue luciferase reporter plasmid, 0,8 ug av den β-galaktosidase (β-gal) ekspresjonsplasmid (Ambion ), og like mengder (20 pmol) av MIR-135b etterligne eller en egge negativ kontroll RNA bruker Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Den β-gal plasmid ble brukt som en kontroll transfeksjonseffektivitet. Cellene ble høstet 24 timer etter transfeksjon og ble utsatt for luciferaseaktiviteten analyse ved bruk av et luciferase-assay kit (Promega, Madison, WI, USA).
Protein isolasjon og Western blot
Celler eller vev ble lysert i RIPA lysebuffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% NP-40, 0,25% natrium-deoksycholat, og 1 mM EDTA, pH 8,0) inneholdende fersk tilsatt protease inhibitor cocktail (Roche) i 30 min på is og ble deretter sentrifugert ved 16 000 x g ved 4 ° C i 10 min. Supernatanten ble oppsamlet, og proteinkonsentrasjonen ble beregnet ved bruk av en BCA proteinanalysesett (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA). Proteinene ble separert via SDS-PAGE (Bio-Rad). Etter elektroforese ble proteinene elektrooverført til PVDF-membraner (Bio-Rad) og deretter blokkert med 5% skummet melk i 1 time. Membranene ble deretter inkubert i primære antistoffer ved 4 ° C i 12 timer. Etter tre vaskinger i TBST, ble membranene inkubert i et pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff i 1 time ved romtemperatur. Etter tre vaskinger ble membranene inkubert i SuperSignal West Pico kjemiluminescens-substrat (Pierce). Den samme Membranen ble probet med et GAPDH-antistoff for å tjene som en lasting kontroll. Antistoffene mot TGFBR2 og GAPDH ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (sc-400 og sc-365062, henholdsvis Santa Cruz, CA, USA).
Celleproliferering analysen
HT-29 celler ble sådd ut ved 5 x 10
4 celler per brønn i 96-brønners plater og inkuberes deretter over natten i RPMI-1640 supplert med 10% FBS. Cellene ble samlet opp ved 12, 24, 36, 48 eller 60 timer etter transfeksjon. Etter transfeksjon, ble 10 ul av celletellingsleder-8-løsning (CK04-500, Dojindo) tilsatt til de tilsvarende testet brønnene og inkubert i 1 time. Absorbansen ble målt ved en bølgelengde på 450 nm. Alle forsøk ble utført in triplo.
apoptose assays
apoptose av HT-29 celler ble vurdert ved hjelp av en Annexin V-FITC /propidiumjodid (PI) farging assay. HT-29 celler ble dyrket i 12-brønners plater og transfektert med pre-MIR-135b, anti-MIR-135b, TGFBR2 siRNA eller TGFBR2 overekspresjon plasmidet til å indusere apoptose. Pre-MIR-kontroll, anti-MIR-kontroll, kontroll siRNA, og en kontroll-plasmid tjente som negative kontroller. Cellene ble dyrket i 24 timer i serum-utarmet medium; da, det vedlagte og flytende cellene ble høstet. Strømningscytometrisk analyse av apoptotiske celler ble utført ved anvendelse av en Annexin V-FITC /PI farging kit (BD Biosciences, CA, USA). Etter vasking med kald PBS ble cellene resuspendert i bindingsbuffer (100 mM HEPES, pH 7,4, 100 mM NaCl, og 25 mM CaCl
2), etterfulgt av farging med Annexin V-FITC /PI ved romtemperatur i mørket i 15 min. Den apoptotiske celler ble deretter evaluert ved å portstyre de PI- og annexin V-positive celler ved bruk av en fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) strømningscytometer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Alle forsøk ble utført in triplo.
Videre kjerner ble farget med DAPI å evaluere morfologiske forandringer i apoptotiske celler. I korthet etter transfeksjon og kultur i 24 timer i serum-utarmet medium, ble HT-29-celler farvet med DAPI i 15 minutter ved 37 ° C under 5% (volum /volum) CO2. Etter vasking med kald PBS og fiksering i 4% (v /v) formalin, celler ble undersøkt ved anvendelse av et Olympus mikroskop IX81 (200 x) er utstyrt med X-Cité fluorescens-belysning (Series 120Q; blå fluorescens). Omfanget av apoptose ble kvantifisert ved å beregne forholdet mellom kondenseres til total kjerner. Resultatene er vist fra dataene fra tre uavhengige eksperimenter med 3 tilfeldige mikroskopiske felt fra hver prøve. Kondenskjerner i den mikroskopiske feltet ble talt.
Statistisk analyse
Alle de Western blot og spredning analyse bilder er representative for minst tre uavhengige forsøk. De kvantitative RT-PCR og luciferase reporter-analyser ble utført i tre eksemplarer, og hver enkelt eksperiment ble gjentatt flere ganger. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SE av minst tre uavhengige eksperimenter. De observerte forskjellene ble ansett for å være signifikant ved p 0.05 basert på t-test.
Resultater
oppregulering av den TGFBR2 protein, men ikke mRNA, i CRC vev
Vi først bestemt uttrykk mønstre av TGFBR2 i menneskelig CRC vev. Etter å måle protein nivåer av TGFBR2 i fem sammenkoblede CRC og normal tilstøtende vev, fant vi at TGFBR2 protein nivåer ble dramatisk redusert i CRC vev i forhold til de normale tilstøtende vev (Fig 1A og 1B). Men selv om TGFBR2 protein ble konsekvent nedregulert i CRC vev, de TGFBR2 mRNA nivåer var ikke signifikant forskjellig mellom kreft og noncancerous vev (fig 1c). Dette misforhold mellom protein og mRNA-ekspresjon av TGFBR2 i CRC sterkt antyder at en post-transkripsjonell mekanisme er involvert i reguleringen av TGFBR2.
(A og B) Western blot analyse av de TGFBR2 proteinnivåer i fem sammenkoblet CRC og normale nærliggende vev (NAT) prøver. A: representant bildet; B: kvantitativ analyse. (C) Kvantitativ RT-PCR analyse av TGFBR2 mRNA nivåer i fem sammenkoblede CRC og NAT vevsprøver. * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001.
Identifikasjon av konserverte MIR-135b målse innenfor 3′-UTR av TGFBR2
Tre beregningsalgoritmer, TargetScan [29], Miranda [30] og PicTar [31 ], ble brukt i kombinasjon for å identifisere potensielle mirnas som er rettet mot TGFBR2. Alle tre algoritmer spådd MIR-135b som en regulator av TGFBR2. De predikerte interaksjoner mellom MIR-135b og målse innenfor 3′-UTR av TGFBR2 er illustrert i figur 2A. En spådd hybridisering ble observert mellom MIR-135b og 3′-UTR av TGFBR2. Det var perfekt komplementaritet mellom frøet region (kjernen sekvens som omfatter de første 2-8 baser av den modne miRNA) og den antatte målsekvensen. Minste fri energi verdien av hybridisering mellom MIR-135b og TGFBR2 var -20,7 kcal /mol, som er godt innenfor rekkevidden av ekte miRNA-target par. Videre Mir-135b bindende sekvenser i TGFBR2 3′-UTR ble svært konservert over arter. Dermed ble MIR-135b valgt for videre eksperimentell verifikasjon av sin binding til TGFBR2.
(A) Skjematisk av de hypotetiske tomannsboliger dannet av samspillet mellom bindingssteder i TGFBR2 3′-UTR (øverst) og MIR-135b (nederst). Den spådde fri energi verdien av denne interaksjonen er indikert. Frøet gjenkjenningsseter er merket, og alle nukleotider i disse regionene er svært konservert over flere arter, inkludert menneske, mus og rotter. (B) Kvantitativ RT-PCR analyse av MIR-135b nivåer i fem sammenkoblede CRC og NAT vevsprøver. (C) Pearsons korrelasjon spredningsdiagram av fold endring av MIR-135b og TGFBR2 protein i menneskelige CRC vev. (D) Pearsons korrelasjon spredningsdiagram av fold endring av MIR-135b og TGFBR2 mRNA i menneskelige CRC vev. * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001.
Identifikasjon av en invers korrelasjon mellom MIR-135b nivåer og TGFBR2 protein nivåer i CRC vev
mirnas er generelt antatt å vise uttrykk mønstre som er motsatt for de av sine mål [16-18]. Interessen for sammenhengen mellom MIR-135b og TGFBR2 ble også støttet av den nylige identifikasjon av denne miRNA som kandidat onkogen og TGFBR2 som en tumor suppressor i CRC [2,32]. Vi neste undersøkt om Mir-135b nivåer inverst korrelert med TGFBR2 protein uttrykk nivåer i CRC vev. Etter å bestemme nivåene av MIR-135b i fem sammenkoblede CRC og normal tilstøtende vev, fant vi at uttrykket nivået av MIR-135b øker betydelig hos CRC vev (Fig 2B). Den inverse sammenhengen mellom MIR-135b og TGFBR2 proteinnivåer (Fig 2C) og forskjellen mellom de MIR-135b og TGFBR2 mRNA nivåer (Fig 2D) ble ytterligere illustrert ved hjelp av Pearsons korrelasjon spredningsplott. Resultatene indikerte at MIR-135b uttrykk nivå omvendt korrelerer med TGFBR2 protein uttrykk nivå i menneske CRC vev. Dermed TGFBR2 var fast bestemt på å være en MIR-135b mål basert på både beregnings spådommer og omvendt korrelasjon mellom nivåene av MIR-135b og TGFBR2 protein, men ikke mRNA, i CRC.
Validering av TGFBR2 som en direkte mål på MIR-135b
sammenhengen mellom MIR-135b og TGFBR2 uttrykk ble videre undersøkt ved å evaluere TGFBR2 uttrykk i den menneskelige CRC cellelinjer HT-29 og SW-480 etter overekspresjon og knockdown av MIR-135b . I disse forsøkene ble MIR-135b overekspresjon oppnådd ved trans HT-29 og SW-480 celler med pre-MIR-135b, som er et syntetisk RNA oligonukleotid som etterligner MIR-135b forløper; mens MIR-135b knockdown ble oppnådd ved trans celler med anti-MIR-135b (kjemisk modifisert antisensoligonukleotider designet spesifikt mot modne MIR-135b). Den effektive overekspresjon eller knockdown av MIR-135b er vist i figur 3A. Åpenbart cellulære MIR-135b nivåene ble betydelig økt når HT29 og SW480 celler ble transfektert med pre-MIR-135b og falt dramatisk når HT29 og SW480 celler ble behandlet med anti-MIR-135b. Ekspresjon av TGFBR2 protein ble signifikant inhibert ved innføring av pre-MIR-135b i HT29 (figur 3B) og SW480 (figur 3C) celler, mens anti-MIR-135b betydelig økt TGFBR2 proteinnivå i HT29 (figur 3B) og SW480 celler (figur 3C). For å finne ut hvilket nivå MIR-135b regulerer TGFBR2 uttrykk, vi gjentok ovenfor eksperimenter og undersøkt uttrykk for TGFBR2 mRNA etter transfeksjon. Overekspresjon eller knockdown av MIR-135b ikke påvirke mRNA stabilitet TGFBR2 (Fig 3D). Disse resultatene viste at MIR-135b regulerer spesifikt TGFBR2 uttrykk ved post-transkripsjonelle nivå, som er det mest vanlig mekanisme for dyr miRNA handling.
(A) Kvantitativ RT-PCR analyse av MIR-135b nivået i HT-29 og SW-480 celler behandlet med egge pre-MIR-kontroll, pre-MIR-135b, anti-MIR-kontroll eller anti-MIR-135b. (B og C) Western blot analyse av de TGFBR2 proteinnivåene i HT-29 og SW-480-celler behandlet med pre-MIR-kontroll, pre-MIR-135b, anti-MIR-kontroll eller anti-MIR-135b. B: representant bildet; C: kvantitativ analyse. (D) Kvantitativ RT-PCR analyse av TGFBR2 mRNA nivåer i HT-29 og SW-480 celler behandlet med pre-MIR-kontroll, pre-MIR-135b, anti-MIR-kontroll eller anti-MIR-135b. (E) Direkte binding av TGFBR2 3′-UTR til MIR-135b. HT-29 og SW-480-celler ble ko-transfektert med et ildflue luciferase reporter inneholdende enten villtype (WT) og mutant (Mut) MIR-135b bindingsseter i TGFBR2 3′-UTR og enten pre-MIR-kontroll eller pre-MIR-135b. Tjuefire timer etter transfeksjon ble cellene vurdert ved anvendelse av et luciferase-analysesett. Resultatene vises som forholdet mellom ildflue luciferase aktivitet i MIR-135B-transfekterte celler til at i kontrollcellene. * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001.
For å avgjøre om de negative regulatoriske virkningene av MIR-135b på TGFBR2 uttrykk ble formidlet av bindingen av MIR-135b til den anslåtte målområder i 3′-UTR av TGFBR2 mRNA, den fulle lengde 3′-UTR av TGFBR2 inneholdende den forutsagte MIR-135b-bindingssete ble innført nedstrøms for ildflue luciferase-genet i en reporter plasmid. Det resulterende plasmid ble ko-transfektert inn i HT-29 og SW-480-celler med en transfeksjon styre plasmid (β-gal) og enten pre-MIR-135b eller en kryptert negativ kontroll RNA. Som forventet, ble luciferase-aktivitet markert redusert i cellene transfektert med pre-MIR-135b. Videre introduserte vi punktmutasjoner i de tilsvarende komplementære områder i 3′-UTR av TGFBR2 å forstyrre den anslåtte MIR-135b bindingssteder. Dette mutert luciferase reporter var upåvirket av overekspresjon av MIR-135b (figur 3E). Dette funnet antydet at den antatte miRNA bindingsseter av TGFBR2 bidrar sterkt til dette miRNA-mRNA interaksjon, som formidler den post-transcriptional undertrykkelse av TGFBR2 uttrykk. I konklusjonen, våre resultater viste at Mir-135b binder direkte til 3′-UTR av TGFBR2 mRNA-transkript for å undertrykke TGFBR2 uttrykk i CRC celler.
MIR-135b fremmer spredning og hemmer apoptose av CRC celler ved å målrette TGFBR2
Vi neste analysert de biologiske konsekvensene av MIR-135b-drevet undertrykkelse av TGFBR2 uttrykk i CRC celler. Vi først undersøkt om overekspresjon eller stanse av TGFBR2 påvirker HT-29 celleproliferasjon og apoptose. Å slå ned TGFBR2 uttrykk, ble siRNA sekvens rettet mot ulike områder av menneskelig TGFBR2 cDNA designet og transfektert inn i HT-29 celler. For å overuttrykker TGFBR2, ble et plasmid som uttrykker TGFBR2 ORF transfektert inn i HT-29 celler. Den effektive overekspresjon av TGFBR2 er vist i figur 4A og 4B. I samsvar med tidligere studier som viser at TGFBR2 hemmer celledeling [3], HT-29 celler der TGFBR2 uttrykk ble slått ned ved hjelp av siRNA proliferated på et betydelig høyere rente, mens cellene transfektert med TGFBR2 overekspresjon plasmid viste signifikant redusert spredning (fig 4C og 4D). På samme måte, HT-29-celler hvori TGFBR2 ekspresjon ble slått ned ved hjelp av siRNA oppviste betydelig økt apoptose, mens de som er transfektert med TGFBR2 overekspresjon plasmid oppviste redusert apoptose (figur 4E).
(A og B) Western blot-analyse av de TGFBR2 proteinnivåer i HT-29 celler behandlet med egge kontroll siRNA, TGFBR2 siRNA, tak vektor eller TGFBR2 vektor. A: representant bildet; B: kvantitativ analyse. (C) CCK8 cellenes levedyktighet ble utført 12, 24, 36, 48 og 60 timer etter transfeksjon av HT-29-celler med enten kryptert kontroll siRNA eller TGFBR2 siRNA. (D) CCK8 cellenes levedyktighet ble utført 12, 24, 36, 48 og 60 timer etter transfeksjon av HT-29-celler med enten kontroll vektor eller TGFBR2 vektor. (E) apoptose analyser ble utført etter transfeksjon av HT-29 celler med egge kontroll siRNA, TGFBR2 siRNA, kontroll vektor eller TGFBR2 vektor. Venstre panel: representant bildet; panel høyre: kvantitativ analyse. * P 0,05; ** P 0.01.
Vi neste analysert de biologiske konsekvensene av MIR-135b-mediert hemming av TGFBR2 uttrykk i CRC celler. Til støtte for tanken om at Mir-135b fungerer som en nøkkel proto-onkogen miRNA [32], HT-29 celler transfektert med pre-MIR-135b utstilt økt spredning; i motsetning til knockdown av MIR-135b hadde motsatt effekt på celleproliferasjon (Fig 5A). Videre, sammenlignet med celler transfektert med pre-MIR-135b, cellene ko-transfektert med pre-MIR-135b og den TGFBR2 overekspresjon plasmid oppviste en betydelig redusert formeringshastigheten (figur 5F), noe som tyder på at MIR-135b-resistente TGFBR2 ekspresjon reddet undertrykkelse av TGFBR2 uttrykk ved MIR-135b og svekket den pro-proliferativ effekt av MIR-135b.
(A) CCK-8 celle levedyktighet ble utført 12, 24, 36, 48 og 60 timer etter transfeksjon av HT-29 celler med pre-MIR-kontroll, pre-MIR-135b, anti-MIR-kontroll eller anti-MIR-135b. (B-E) apoptose ble utført 24 timer etter transfeksjon av HT-29 celler med pre-MIR-kontroll, pre-MIR-135b, anti-MIR-kontroll eller anti-MIR-135b. B: representant andel av apoptotiske HT-29 celler ved hjelp av flowcytometrisk analyse; C: representant andel av apoptotiske HT-29 celler ved hjelp av DAPI farging; D: representant bilde ved hjelp av flowcytometrisk analyse; C: representant bilde av apoptotiske HT-29 celler ved hjelp av DAPI farging. * P 0,05; ** P 0,01. (F) CCK-8 cellenes levedyktighet ble utført 12, 24, 36, 48 og 60 timer etter transfeksjon av HT-29-celler med det forvrengte styre miRNA og kontrollvektor, kryptert kontroll miRNA og TGFBR2 vektor, pre- MIR-135b og kontroll vektor, eller pre-MIR-135b og TGFBR2 vektor. (GJ) apoptose analyser ble utført 24 timer etter transfeksjon av HT-29-celler med det forvrengte styre miRNA og kontrollvektor, kryptert kontroll miRNA og TGFBR2 vektoren, pre-MIR-135b og styrevektor, eller pre-MIR -135b og TGFBR2 vektor. G: representant andel av apoptotiske HT-29 celler ved hjelp av flowcytometrisk analyse; H: representant andel av apoptotiske HT-29 celler ved hjelp av DAPI farging; I: representant bilde ved hjelp av flowcytometrisk analyse; J: representant bilde av apoptotiske HT-29 celler ved hjelp av DAPI farging. * P 0,05; ** P 0.01.
Vi har undersøkt effekten av MIR-135b på CRC celle apoptose via flowcytometrisk analyse og DAPI farging. Resultatene viste at andelen av apoptotiske celler var signifikant lavere blant HT-29-celler transfektert med forhånds MIR-135b, men var høyere blant HT-29-celler transfektert med anti-MIR-135b (figur 5B, 5C, 5D og 5E ). Videre, når HT-29 celler ble samtidig tilført med pre-MIR-135b og TGFBR2 overekspresjon plasmid, anti-apoptotisk effekt av MIR-135b ble dramatisk svekket (Fig 5G, 5H, 5I og 5J). Disse resultatene indikerte at MIR-135b kan modulere celle apoptose ved downregulating TGFBR2 i CRC-celler.
diskusjon
TGF-β signalveien spiller en kompleks rolle i den ondartede utviklingen av svulster, og dens effekter, for eksempel veksthemming, apoptose, differensiering og andre TGF-p-regulerte prosesser synes å være kontekstavhengig [33].
