Abstract
Thymosin β
10 (Tβ
10) regulerer aktin dynamikk som en cytoplasma G-aktin sequestering protein. Tidligere har vi vist at Tβ
10 reduserer tumorvekst, angiogenese, og formering ved å avbryte aktin og ved inhibering av Ras. Men lite er kjent om virkningsmekanismen og biologisk funksjon. I den foreliggende undersøkelse har vi etablere en ny genterapi modellen ved hjelp av en genetisk modifisert adenovirus, referert til som Ad.TERT.Tβ
10, som kan overuttrykker den Tβ
10 gen i cancerceller. Dette ble oppnådd ved å erstatte det native Tβ
10-gen-promotoren med det menneskelige TERT-promoteren i Ad.TERT.Tβ
10. Vi undersøkte cancersuppresjon aktiviteten av Tβ
10 og funnet at Ad.TERT.Tβ
10 påfallende indusert kreft-spesifikk ekspresjon av Tβ
10 samt apoptose i en ko-kultur modell for menneskelig primær eggstokk kreftceller og normale fibroblaster. I tillegg Ad.TERT.Tβ
10 redusert mitokondriemembranpotensiale og økt (ROS) produksjon reaktive oksygenforbindelser. Disse effektene ble amplifisert ved samtidig behandling med anticancer legemidler, slik som paclitaxel og cisplatin. Disse funnene tyder på at økningen i ROS produksjon på grunn av aktin avbrudd av Tβ
10 overekspresjon øker apoptose av menneskelige eggstokkreft celler. Faktisk, kreft-spesifikke overekspresjon av Tβ
10 ved Ad.TERT.Tβ
10 kan være et verdifullt anti-cancer terapeutisk for behandling av ovarialcancer, uten toksisitet overfor normale celler.
Citation : Kim YC, Kim BG, Lee JH (2012) Thymosin β
10 Expression Drevet av Human tert arrangørens induserer Eggstokkreft Spesifikke apoptose gjennom ROS produksjon. PLoS ONE 7 (5): e35399. doi: 10,1371 /journal.pone.0035399
Redaktør: Yoshiaki Tsuji, North Carolina State University, USA
mottatt: 20 desember 2011; Godkjent: 16 mars 2012; Publisert: May 18, 2012 |
Copyright: © 2012 Kim et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Midlene kilden er den koreanske regjeringen. Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
thymosiner er en familie av små proteiner som opprinnelig ble isolert fra kalvethymus, og er delt inn i tre klasser (α, p og y) på basis av sitt isoelektriske punkt [1]. P-thymosiner, som har en gjennomsnittlig molekylvekt på omtrent 5 kDa, er sterkt konserverte sure proteiner som finnes i nesten alle eukaryot celle. P-thymosiner hemme pigg ende aktin polymerisasjonen ved sekvestrering av aktin monomerer [2], [3]. Som en av de mest tallrike p-thymosiner i pattedyrarter, thymosin β
10 (Tβ
10) påvirker metastase og proliferasjon i mange kreftceller [4] – [6]. Den anti-kreft-effekter av Tβ
10 ser ut til å være nært knyttet til sin funksjon som en regulator av aktin dynamikk i tumorceller [7], [8]. Actin dynamikk kan bli forstyrret ved tilsetning av aktin-stabiliserende midler eller innføring av mutasjoner, forårsaker endringer i cellulær arkitektur og interne cellulære bevegelse. Videre har nylige rapporter indikert at endringer i aktin dynamikk kan resultere i frigjøring av reaktive oksygenarter (ROS) fra mitochondria og påfølgende celledød, understreker viktigheten av å opprettholde dynamisk regulering av aktin cytoskjelettet [9] – [14].
Nylig telomerase har blitt anerkjent som et bredt spekter svulst markør og er nå regnet som en av de viktigste terapeutiske mål for kreftbehandling. Human telomerase revers transkriptase (hTERT), den katalytiske subenhet av telomerase, blir detektert i ca. 90% av kreftceller fra tumorvevet, men er ikke detekterbare på normale vev [15] – [17]. Tidligere studier har vist at hTERT-promoteren kan regulere ektopisk ekspresjon av gener av interesse i telomerase-positive cancerceller, noe som indikerer at hTERT-promoteren er en lovende kandidat for generering av kreftspesifikke adenovirus [18] -. [22]
Her beskriver vi et rekombinant adenovirus, Ad.TERT.Tβ
10, som ble konstruert ved innsetting av Tβ
10 genet under kontroll av hTERT-gen promotoren inn i adenovirus p-shuttle plasmid for å indusere tumor-spesifikke Tβ
10 genuttrykk. Vi har også etablert en co-kultur modell av primære humane eggstokkreft celler og normale fibroblaster og senere behandlet denne co-kultur med Ad.TERT.Tβ
10 å belyse de kreftspesifikke effekter av Ad.TERT.Tβ
10. I tillegg har vi undersøkt mekanismen for Tβ
10-indusert apoptose i 2774 menneske eggstokkreft celler som ble behandlet med Ad.TERT.Tβ
10. Disse eksperimentene viste bevis for at Ad.TERT.Tβ
10 induserer kreft-spesifikke uttrykk for Tβ
10, og dermed resultere i kreft-spesifikke apoptose gjennom ROS produksjon. Sammen disse funnene tyder på at kreftspesifikke overekspresjon av Tβ
10 ved Ad.TERT.Tβ
10 kan faktisk være et verdifullt anti-cancer terapeutisk for behandling av ovarialcancer, uten toksisitet overfor normale celler og eventuelt andre kreft .
Resultater
thymosin β
10 Uttrykt på lave nivåer i Eggstokkreft
i vår forrige undersøkelse, rapporterte vi at Tβ
10 mRNA nivåer var forhøyet i normale eggstokker, sammenlignet med annet vev, slik som milt, thymus, prostata, testikkel, tynntarm, tykktarm, perifere blodleukocytter, men mRNA-nivåene av Tβ
10 ble redusert i eggstokk-kreft [23]. Vi har derfor bekreftet at mRNA og protein uttrykk nivåer av thymosin β
10 (Tβ
10) i serøs Type ovariekreft og mucinous typen eggstokk-kreft, så vel som i livmorhalskreft og udødeliggjorte ovarie cancer-cellelinjer, f.eks som 2774, OVCAR3, og SKOV3. Våre funn at mRNA (figur 1A) og protein (figur 1 B) nivåer av Tβ
10 var høy i normal ovarievev, men ble redusert i alle Serøs karsinom, mucinous Carcinoma, og udødeliggjorte ovarie cancer-cellelinjer, var i overensstemmelse med vår forrige undersøkelse. Men vi var ikke i stand til å oppdage endringer i normal cervical vev, adenokarsinomer, og plateepitelkarsinom. Spesielt høye ekspresjonsnivåer av Tβ
10 er karakteristiske for normale eggstokker, men disse nivåene reduseres i eggstokk-kreft, noe som tyder på at Tβ
10 spiller en rolle i utvikling av kreft i eggstokkene.
(A) mRNA uttrykk nivåer av Tβ ble bestemt
10 ved real-time PCR ved hjelp av total RNA isolert fra humane normale og kreft vev inkludert eggstokkreft cellelinjer, slik som serøs karsinom (seriøst. C) og mucinous karsinom (mucinous. C), udødelig menneskelige eggstokkreft cellelinjer (2774, OVCAR3, og SKOV3), og adenokarsinom (Adeno. C) og plateepitelkarsinom (plateepitelkarsinom. C) i livmorhalsen. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SE for n = 3 separate prøver per celletype gruppering, og er uttrykt som prosentandel av normale eggstokk. Signifikante forskjeller mellom gruppene er betegnet med en stjerne (*), P 0,05; en dobbelt stjerne (**), P . 0.01 (B) Protein Ekspresjonsnivået av Tβ
10 ble bestemt ved immunhistokjemi i normalt vev eggstokk og sammenlignet med det i serøs og mucinkjertler typer av kreft i eggstokkene, henholdsvis
kreft spesifikke uttrykk for thymosin β
10 ved Ad.TERT.Tβ
10
for å belyse hvilken rolle Tβ
10 i menneskelig eggstokkreft, vi etablert en ny fysiologisk modell ved ko-dyrking av primære eggstokkreft celler med normale fibroblaster, og ved hjelp av en cancer-spesifikk gen avgivelsessystem som omfatter et genetisk modifisert adenovirus. Vi konstruerte rekombinante adenovirus, Ad.TERT.Tβ
10, ved å erstatte den Tβ
10-gen-promoteren med hTERT-promoteren, og vi bekreftet integriteten til Ad.TERT.Tβ
10 ved hjelp av polymerase kjedereaksjon ( PCR) ved hjelp av Ad-tERT, Tβ
10, og E1A primere (figur 2A). For å bekrefte graden av Tβ
10 genekspresjon, behandlet vi 2774-celler med Ad.TERT.Tβ
10 ved en multiplisitet av infeksjon (MOI) på 10, og deretter følges endringer i Tβ
10 ekspresjon ved hjelp immunocytokjemi (ICC) og RT-PCR. Våre resultater viser at Ad.TERT.Tβ
10 opphøyd Tβ
10 uttrykk i cytosol (figur 2B).
(A) Skjematisk fremstilling av rekombinant adenovirus, Ad.TERT.Tβ
10, generert av rekombinasjon av pSuttle.TERT.Tβ
10 og ryggrad plasmid pAdEasy-en i BJ5183. Det modifiserte pShuttle plasmid, betegnet som pSuttle.TERT.Tβ
10, ble klonet ved velordnet innsetting av den humane TERT-promoteren og Tβ
10 gen for å generere en rekombinant adenovirus. Integriteten til Ad.TERT.Tβ
10 ble bestemt ved polymerasekjedereaksjon (PCR) ved anvendelse av primere Ad-TERT, Tβ
10, og E1A. (B) Subkonfluente 2774 eggstokkreft celler ble infisert med 10 MOI av Ad.TERT.LacZ eller Ad.TERT.Tβ
10. Etter 24 timer ble Tβ
10 protein og mRNA-nivåer bestemt ved immunocytokjemi og RT-PCR, respektivt. (C) Subkonfluente primære, humane ovarie cancer-celler ko-dyrket med fibroblastceller ble utsatt for 10 MOI på Ad.TERT.LacZ i 7 dager. β-galaktosidase-ekspresjon nivået ble bestemt ved β-gal-farging (blå farge). Pil i senter av figuren angir en primær eggstokkreft cellemasse. (D) Subkonfluente primære, humane ovarie cancer-celler ko-dyrket med fibroblastceller ble også utsatt for 10 MOI på Ad.TERT.Tβ
10 i 24 timer. Tβ
10 uttrykksnivået ble bestemt av immunocytochemistry (grønn farge). Piler på bunnen av figuren indikerer primære eggstokkreft celler.
Vi har også evaluert kreft-selektiv induksjon av genuttrykk av rekombinante adenovirus, Ad.TERT.Tβ
10 og Ad.TERT.LacZ på vår co-kultur modell av primære eggstokkreft celler og normale fibroblaster. På dag 7 etter behandling med 10 MOI av Ad.TERT.LacZ, observerte vi at eggstokkreft celler hadde vokst godt på lag dannet av vanlige fibroblast celler som blir observert i ubehandlet gruppe. Videre X-gal-positive celler, noe som indikerer β-galaktosidase-ekspresjon ved Ad.TERT.LacZ, ble påvist bare i primær eggstokkreft celler (figur 2C). På dag 1 etter behandling med Ad.TERT.Tβ
10, grønn fluorescens, noe som indikerer Tβ
10 ekspresjon ble påvist i primær eggstokkreft celler, men ikke i normale fibroblast celler (figur 2D), noe som tyder på at det TERT-promoteren overfører eggstokkreft spesifikke genuttrykk.
effekter av Thymosin β
10 på ovarian Cancer Cell Migration
Tidligere rapporter har vist at de anti-kreft effekt av Tβ
10 er tett relatert til dens rolle i regulering av aktin dynamikk i tumorceller [7], [8]. Vi har derfor undersøkt hvilken rolle Tβ
10 i kreft celle migrasjon og invasjon. Vi har funnet at både kreftcellemigrering og invasjon ble signifikant redusert i 2774 celler infisert av Ad.TERT.Tβ
10, sammenlignet med 2774 celler infisert med Ad.TERT.LacZ og uinfiserte 2774 celler (figur 3A). I forhold til cellemigrering ble celle bevegelse også estimeres ved sårhelende analysen. 2774 cellemotilitet på en plastoverflate ble betydelig redusert ved Ad.TERT.Tβ
10 behandling (figur 3B).
(A) Subkonfluente 2774 menneske eggstokkreft celler ble infisert med 10 MOI av Ad.TERT .LacZ eller Ad.TERT.Tβ
10 i 12 timer. Etter resuspendering, ble celler inkubert i 12 timer i det øvre kammer av en Transwell® plate belagt med kollagen et monolag for migreringen assay eller med dobbelt lag av kollagen og matrigel for invasjonen analysen. Resultatene er uttrykt som en prosentandel av bærerkontrollen og er gjennomsnitt ± SE (søyler) av tre eksperimenter. Signifikante forskjeller fra bærerkontrollgruppen blir betegnet med en stjerne (*), P 0,05; en dobbelt stjerne (**), P 0,01 (B) De virus-infiserte celler ble også ytterligere inkubert i et 35 mm μ-antenne, lav, med en kultur-Insert (Ibidi) i 12 timer, og etterfulgt av observasjon av retningen og hastigheten av cellemigrering under sårhelende. De sårhelende Resultatene er uttrykt som en prosentandel av bærerkontrollen og er gjennomsnitt ± SE (søyler) av tre eksperimenter. Vesentlige forskjeller fra kjøretøy kontrollgruppen er merket med en dobbel stjerne (**), P . 0,01
Induksjon av kreft-spesifikke Apoptose av Ad.TERT.Thymosin β
10
for å undersøke effekten av overekspresjon av Tβ
10 på kreftcelle levedyktighet, ble subsammenflytende 2774 eggstokkreft celler infisert med Ad.TERT.LacZ eller Ad.TERT.Tβ
10 ved en MOI på 10, og MTT-bioanalysen ble utført daglig i 6 dager. Vi fant at Tβ
10 betydelig redusert eggstokkreft celleviabilitet, sammenlignet med kontroller media med eller uten Ad.TERT.LacZ (figur 4A). Ved siden av, for å undersøke hvorvidt den reduksjon i celleviabilitet skyldes apoptose, vi utførte FACS-analyse for Annexin V-FITC og funnet at overekspresjon av Tβ
10 indusert apoptose, men ikke nekrose, i 2774 ovarian cancer-cellelinje (figur 4B). Videre på dag 1 etter behandling av Ad.TERT.Tβ
10 i co-kultur modell av primær menneskelig eggstokkreft med normale fibroblaster, vi klart observert atom fragmentering (blå fluorescens) bare i eggstokkreft celler som overexpressed Tβ
10 (grønn fluorescens). Dessuten var vi ikke i stand til å oppdage kjernefysiske fragmentering eller Tβ
10 uttrykket ovenfor bakgrunnsnivå normal fibroblast. Disse resultatene indikerer at kreftspesifikke overekspresjon av Tβ
10, noe som lettes ved det TERT-promoteren, stimulerer cancer-spesifikk atom fragmentering som en av de morfologiske kjennetegn på apoptose (figur 5A). I tillegg observerte vi slående morfologiske endringer av eggstokkreft celler behandlet med Ad.TERT.Tβ
10 for over 90 timer ved hjelp av en real-time bildebehandling mikroskop. Etter 10 timers behandling med Ad.TERT.Tβ
10, observerte vi typiske apoptotiske morfologiske endringer i eggstokkreft celler slik som plasmamembran blebbing, tap av celle-celleinteraksjoner, cytoplasmatisk vacuolization, og celle krymping på grunn av den raske dehydrering. Apoptotiske celler gradvis forsvant av celledød, mens normale fibroblast celler syntes å være upåvirket av Ad.TERT.Tβ
10 for over 90 timer (figur 5B; Movie S1)
(A) Subkonfluente 2774 eggstokkene. kreftceller ble holdt i 5 dager i fullstendig kulturmedium inneholdende Ad.TERT.LacZ eller Ad.TERT.Tβ
10 ved en MOI på 10 eller 100, og den MTT-bioanalysen ble utført daglig. (B) På den andre dag etter virusinfeksjon, ble en FACS Annexin V /propidiumjodid (PI) analyse utført i henhold til produsentens (Clontech) protokoll. Representative spredningsplott viser fordelingen av annexin V- og PI-farget celler. I toppfelter, X-aksen (FL1-H) indikerer annexin V-FITC fluorescens påvist ved 518 nm, og Y-aksen (FL2-H) indikerer PI fluorescens detektert ved 620 nm. Som nedre venstre (LL) kvadrant indikerer levende celler, øverst til venstre (UL) kvadranter indikere nekrotiske celler, øverst til høyre (UR) quadrats indikere sent apoptotiske celler, og nederst til høyre (LR) kvadrant viser tidlige apoptotiske celler (topplater) resultatene er uttrykt som en prosentandel av totale celletall og er gjennomsnitt ± SE (søyler) av tre individuelle eksperimenter. Vesentlige forskjeller fra kjøretøygruppe er merket med en stjerne (*), P 0,05; en dobbel stjerne (**), P . 0,01
(A) Co-kulturer av subsammenflytende primære humane eggstokkreft celler og fibroblaster ble utsatt for 10 MOI av Ad.TERT.Tβ
10 i 24 timer, og deretter immunocytochemistry ble utført for å observere de nukleære morfologiske endringer indusert av Tβ
10 uttrykk. Differential interferens kontrast (DIC) bilde ble slått sammen med 4,6-diamidino-to-phenylindole (DAPI) farging (blå) og Alexa 488 farging (grønn) for å vurdere atom fragmentering av Tβ
10 uttrykk. Pilene angir atom fragmentations. (B) Co-dyrkede primære humane subsammenflytende eggstokkreft celler og fibroblaster ble utsatt for 10 MOI på Ad.TERT.Tβ
10 i over 90 timer, og morfologiske endringer ble så observert ved hjelp av et sanntids-bildedanningssystem. Hvite piler indikerer selektive morfologiske trekk ved apoptose, for eksempel celleplasmamembran blebbing, cytoplasmatisk vacuolization, og celle krymping (etter 10 timer), etterfulgt av tap av celle-til-celle interaksjoner (etter 15 timer). Og svarte pilene sporing en av fibroblaster indikerer at fibroblaster aktivt flytte om det inntil 90 timer.
Forholdet mellom thymosin β
10 og Fas Expression
For å undersøke om eggstokkreft cancer-spesifikk apoptose skyldes apoptose-fremme genekspresjon og påfølgende signaltransduksjon, vurderte vi Fas-ekspresjon og kaspase 3 aktiveringen med primær ovarial kreft celler ko-dyrket med normale fibroblaster, i tillegg til 2774 ovarian cancer cellelinje. Vi fant ut at Ad.TERT.Tβ
10 indusert Fas mRNA og protein uttrykk i 2774 eggstokkreft celler (Figur 6A). I den primære ko-kulturmodell, ble Fas ekspresjon detektert i primær eggstokkreft celler, men ikke i normale fibroblaster. Disse funn er i overensstemmelse med cancer-spesifikk ekspresjon av Tβ
10 etter infeksjon med Ad.TERT.Tβ
10 (figur 6B). Viktigere, Tβ
10 økt caspase 3-aktivitet som gjorde Cytochalasin D (Cyt D), en potent hemmer av aktin polymerisasjon. Den økte kaspase 3 aktivitet ble også inhibert ved tilsetning av kaspaseinhibitor Z-VAD-FMK. Videre disse dataene er konsistent med Celleviabilitet resultatene som oppnås ved alarmar blå analysen (figur 6C).
(A) Subkonfluente 2774 menneske eggstokkreft celler ble utsatt for Ad.TERT.LacZ eller Ad.TERT. Tβ
10 ved en MOI på 10 i 48 timer og etterfulgt av neste forsøk som RT-PCR og Western blotting å oppdage FAS (CD95) mRNA og protein uttrykk, henholdsvis. (B) Subkonfluente primære humane ovarie kreftceller co-dyrkede med fibroblaster ble også utsatt for 10 MOI av Ad.TERT.Tβ
10 for 24 timer og etterfulgt av immunocytochemistry. Spesifikk FAS /CD95 antistoff farging (Alexa 488, grønn) ble slått sammen med differensial interferens kontrast (DIC) bilder og kjernefysiske farging bilder (DAPI, blå) ved hjelp av bildebehandlingsprogrammer. Hvit og oransje piler indikerer fibroblaster og eggstokkreft celler, henholdsvis. (C) Cellene ble utsatt for Ad.TERT.LacZ eller Ad.TERT.Tβ
10 ved en MOI på 10 med eller uten kaspaseinhibitor (zVAD, 40 uM), og aktin polymerisasjonsinhibitor (cytokalasin D, 1 ug /ml) i 48 timer. De 2774 eggstokkreft celler ble deretter farget i henhold til den kommersielle caspase 3 testsettet protokollen (Thermo) og avbildes med en Thermo Scientific Cellomics ArrayScan høyt innhold screening (HCS) leser. I stolpediagrammet, er de verdier som representerer en prosentandel av bærerkontrollen, etterfulgt av forholdet mellom arealet av kaspase 3 aktiveringen og arealet av kjernen. Og resultatene er gjennomsnitt ± SE (søyler) av tre forskjellige eksperimenter. Vesentlige forskjeller fra kjøretøygruppe er merket med en dobbel stjerne (**), P 0,01 (venstre søylediagram). Cytotoksisitet under samme forhold ble bestemt i dyrkede eggstokkreft celler ved hjelp av Alamar Blå (AB) assay som en
in vitro
alternativ modell. Resultatene er uttrykt som en prosentandel av bærerkontrollen og er gjennomsnitt ± SE (søyler) av tre eksperimenter. Signifikante forskjeller fra bærerkontrollgruppen blir betegnet med en stjerne (*), P 0,05; en dobbel stjerne (**), P 0,01 (høyre søylediagram)
Effekter av Thymosin β
10 på mitokondriell dysfunksjon og ROS Produksjon
Tidligere rapporter har indikert at forstyrrelse av aktin cytoskjelettet induserer den ekstracellulære produksjon av ROS, spesielt O
2
-, som forsterker Fas-avhengig apoptose [13], [24]. I tillegg vil redusert aktin dynamikk årsak depolarisering av mitokondriemembranen og en økning i ROS-produksjon, noe som resulterer i celledød [14]. Tatt sammen, hypotese vi at inhibering av aktin polymerisasjon av Tβ
10 åpnes mitokondriemembranen porer eller kanaler i et lengre tidsrom, noe som resulterer i reduksjon av mitokondriemembranpotensialet (MMP) og en økning i frigivelse av ROS inn i cytoplasma. Derfor har vi målt Tβ
10-induserte endringer i MMP ROS-nivåer, og funnet ut at i utgangspunktet høye nivåer av MMP ble markert redusert med Tβ
10 overekspresjon (figur 7A). Videre ble ROS produksjonen økte med Tβ
10 overekspresjon, som er konsistent med resultatet av MTT bioassay.
(A) Cellene ble utsatt for Ad.TERT.LacZ (10 MOI), Ad. TERT.Tβ
10 (10 MOI), og aktin polymerisasjonsinhibitor (cytokalasin D, 1 ug /ml) i 48 timer, og deretter en mitokondriemembranpotensialet (MMP) analyse ble utført. MMP-analysen ble utført ved anvendelse av MMP-analysesett-protokoll (Thermo), og resultatene ble fotografert ved anvendelse av en Thermo Scientific Cellomics ArrayScan høyt innhold screening (HCS) leser. (B) Celler ble utsatt for Ad.TERT.LacZ (10 MOI), Ad.TERT.Tβ
10 (10 MOI) med eller uten anti-kreftmidler, slik som paclitaxel (taxol, 5 ug /ml) og cisplatin (platina, 10 ug /ml), i 48 timer. Resultatene ble sammenlignet med de fra andre behandlinger, for eksempel hvert anti-cancer middel eller aktin polymerisasjonsinhibitor (cytokalasin D, 1 ug /ml). Nivåene av intracellulære reaktive oksygenarter (ROS) ble påvist ved en fluorescens ELISA system med redoks-følsomme fluorescerende probe 2, 7-dichlorofluorescein diacetat (DCF-DA). I tillegg til ROS-analysen ble en MTT-bio-analyse også utført under de samme betingelser. De alle resultatene er uttrykt som en prosentandel av bærerkontrollen og er gjennomsnitt ± SE (søyler) av tre eksperimenter. Signifikante forskjeller fra bærerkontrollgruppen blir betegnet med en stjerne (*), P 0,05; en dobbelt stjerne (**), P. 0,01
Det er blitt rapportert at cellulære ROS-nivåene øker under betingelser med stress ved behandling med anticancermidler så som taxol (paclitaxel) og platina (cisplatin) . Denne ROS økningen fører til induksjon av proapoptotiske molekyler, slik som p53 og mitogenaktiverte proteinkinaser (MAPK), som fører til cellulær apoptose [25] – [30]. Vi brukte Ad.TERT.Tβ
10 som et ko-behandling med to klasser av anticancermidler, og funnet at ko-behandling resulterte i synergistiske effekter, noe som øker ROS generasjon og minkcellelevedyktigheten (figur 7B). Disse funnene tyder på at eggstokkreft apoptose indusert av Tβ
10 overekspresjon skyldes ROS produksjon i respons til redusert MMP.
Diskusjoner
SS-thymosin familiemedlemmer, thymosin ß
4 (Tβ
4), thymosin ß
10 (Tβ
10), og thymosin ß
15 (Tβ
15) har blitt studert i kreftutvikling. De har vært innblandet i aktin håndtering. Imidlertid er funksjonen til beta thymosiner stor grad ukjent, og deres rolle i neoplastisk sykdomsutvikling er fortsatt kontroversielt.
forhøyet uttrykk for Tβ
4 og Tβ
10 har vært ansett som en karakteristikk av menneskelige kreftutvikling. Overekspresjon av Tβ
4 forekommer i en rekke forskjellige humane karsinomer. Tβ
4 påvirker angiogenese og kreftcellemigrering i mange kreftcelletyper [31] – [34]. Likeledes overekspresjon av Tβ
10 er blitt rapportert i en rekke humane karsinomer, inkludert melanomer [1], karsinomer i nyre, bukspyttkjertel [35], og mage [36], så vel som medullære thyroid carcinomer [37].
Paradoksalt Tβ
4 og Tβ
10 kan være involvert i kreft degenerasjon, som rapporter har indikert at Tβ
4 har svulst undertrykkende effekter i myelom [38], og Tβ
10 er deregulert i nyrecellekreft [39] og eggstokkreft [40]. I tillegg Tβ
10 inhiberte cellemigrering og kapillar-rør som dannelse av humane koronare arterie endotelceller [6]. Våre funn også implisere Tβ
10 i kreft degenerasjon, som den høye Tβ
10 transkripsjoner i normal eggstokk ble betydelig redusert i eggstokkene karsinomer. Videre ble ektopisk uttrykk for Tβ
10 i eggstokkene carcinoma cellelinjer, redusert cellulær proliferasjon og bevegelse, og apoptose akselerert. Derfor Tβ
10 overekspresjon i normale eggstokk-celler ser ut til å fungere som en negativ regulator av carcinogenese, selv om den eksakte mekanismen er uklar. Men som Tβ
4 blir indusert i eggstokkreft [34] og spiller en rolle i aktin beslaglegging som Tβ
10, ektopisk uttrykk for Tβ
10 i vårt eksperimentelle system kan føre til økt aktivitet av ß thymosiner og påfølgende forstyrrelse av aktin dynamikk. Dette konseptet er støttet av rapporter som Tβ
4 og Tβ
10 handle på fartøy utvikling i en komplementær måte in vivo [6] og at ubalansen av G-aktin og F-aktin forårsaker celle avrunding og død [41 ]. Derfor vurderte vi en mulig strategi for kreftforskning og genterapi med Tβ
10. Vi har derfor laget en rekombinant adenovirus, Ad.TERT.Tβ
10, for å bruke for human genterapi og å belyse mekanismen av Tβ
10 i forebygging eggstokkreft.
rekombinant adenovirus systemer er allsidig for genuttrykkstudier og terapeutiske anvendelser, og mange forskere har brukt rekombinante adenovirus med stor suksess gjennom årene. Imidlertid er deres lave spesifisitet en ulempe som begrenser anvendeligheten av disse vektorene som
in vivo
terapeutiske midler. Vektorer som kombinerer høy smittsomhet med kreft celle-spesifikke uttrykk er derfor nødvendig. Flere studier har vist at human telomerase revers transkriptase (hTERT) blir høyt uttrykt i de fleste tumorvev, men ikke i normalt vev. For eksempel, er hTERT promoteraktivitet høyere i humane og murine cancerceller avledet fra lunge, tykktarm, lever, bryst, eggstokk, og hjerne [42] – [47]. Omvendt, de har vist at hTERT-promoteren er aktiv i normale humane fibroblaster [42], og normale humane epitelceller fra trachea [42], bryst-[47], og eggstokk [45], [48]. Derfor undersøkte vi hvilken rolle Tβ
10 i eggstokkreft ved hjelp av en rekombinant adenovirus (Ad.TERT.Tβ
10). Ad.TERT.Tβ
10 ble konstruert ved innsetting av Tβ
10 genet under kontroll av hTERT-promoteren til adenovirus p-shuttle-plasmid for å få cancer-spesifikk ekspresjon, og det ble sammenlignet med Ad.TERT .LacZ som en kontroll. I et ko-kultur modell av primære, humane ovarie kreftceller og normale fibroblaster, β-galaktosidase drevet av hTERT-promoteren ble uttrykt i eggstokkreft celler bare, men ikke i normale fibroblaster. Cytotoksiske og apoptotiske morfologiske forandringer var fraværende fra de normale fibroblaster behandlet med 10 MOI på Ad.TERT.LacZ over en 7 dagers periode, i motsetning til den ovarian cancer-spesifikk apoptose indusert ved behandling av cellene med 10 MOI på Ad.TERT. Tβ
10 over en 10-timers periode. Videre har vi funnet at kreftspesifikk ekspresjon av Tβ
10 fra Ad.TERT.Tβ ble fulgt
10 ved den forhøyede ekspresjonen av Fas, noe som resulterer i cancer-spesifikk apoptose. Derfor har vi antatt at anticancer virkning av Ad.TERT.Tβ
10 så ut til å være assosiert med overekspresjon av Tβ
10 i stedet for ikke-spesifikk viral toksisitet.
Tidligere studier har rapportert at et høyt nivå av ROS har en positiv virkning på kreftutvikling og spredning [49] – [56]. Men vi fant at aktin beslaglegging av overekspresjon av Tβ
10 var på grunn av mitokondriell dysfunksjon og ROS høyde, der apoptose signale ble aktivert. Ideen om at cancercellene er sårbare for angrep av ROS er støttet ved den terapeutiske anvendelse av anerkjente anticancer-medikamenter slik som taxol og cisplatin. Begge disse stoffene øke ROS generasjon i 2774, og cotreatment av cytostatika med Tβ
10 resultat i en additiv effekt av ROS heving og påfølgende induksjon av apoptose. Derfor synes skjebnen til kreftcellen som skal bestemmes av ROS balanse. Mild heving av ROS kan hjelpe kreftutvikling, men overdreven ROS høyde i kreftceller i visse påkjenninger som Tβ
10 overekspresjon og behandling av kreft narkotika synes å stimulere apoptotiske signaler.
I tillegg til induksjon av apoptose , Tβ
10 overekspresjon potent redusert bevegelighet i 2774 eggstokkreft celler, og denne effekten var uavhengig av apoptose induksjon. I 2774 eggstokkreft celler, ble apoptose indusert mye senere enn i grunnskolen eggstokkreft celler. Ad.TERT.Tβ
10-indusert apoptose i grunnskolen eggstokkreft celler og udødeligkreftcellelinjer som 2774, OVCAR3, og SKOV3 skjedde 10- og 48-timer senere, henholdsvis. Som analysene av invasjonen og migrasjon ble utført før observasjon av apoptose, foreslår vi at Tβ
10 overekspresjon i eggstokkreft kan ha positive celledrepende effekt av primærtumorceller samt metastatiske celler.
våre funn tyder på at anti-cancer aktiviteten til Tβ
10 kan være på grunn av ROS generasjon. Videre Tβ
10 og anti-kreftmidler, slik som taxol og cisplatin, hadde en synergistisk effekt på kreftcelledød. Vi fant også at kreftspesifikke overekspresjon av Tβ
10 drevet av hTERT promoter resulterte i kreft-selektiv apoptose gjennom forsterkning av FAS signalering. Denne studien gir innsikt i mekanismen bak den anti-kreft effekt av Tβ
10 i eggstokk, som kan være nyttig for utviklingen av effektive eggstokkreft behandling uten bivirkninger.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
arbeidene med humane prøven ble mottatt skriftlig samtykke fra en pasient og godkjent av den koreanske Association of Institutional Review Board (KAIRB).
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP og Primær Cell Culture
human ovarian cancer-cellelinje 2774 ble erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC), og primære humane ovarialcancer og fibroblast-celler ble isolert fra pasienter med klasse III endometrioid adenokarsinom (kreft) og ko-dyrket videre glassflater. Celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS; Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, USA) og 100 U /ml penicillin /streptomycin (Invitrogen ).
virale vektorer
rekombinant adenovirus, «Ad.TERT.Tβ
10″, ble konstruert i henhold til standard prosedyre brukes i Adeasy ™ Adenoviral Vector System (Stratagene, La Jolla, CA, USA).
