Abstract
lipokalin-type prostaglandin D syntase (L-PGDS) er en medlem av superfamilien lipokalin, som er sammensatt av sekretoriske transportørproteiner, og binder en rekke små hydrofobe molekyler. Ved hjelp av denne funksjonen, har vi rapportert muligheten for å bruke L-PGDS som en roman stoffet levering kjøretøy for dårlig vannløselige stoffer. I denne studien viser vi utviklingen av et medikamentleveringssystem ved bruk av L-PGDS, en som muliggjør direkte kliniske anvendelse av 7-etyl-10-hydroksy-camptothecin (SN-38), en dårlig vannløselig anti-kreft legemiddel . I nærvær av 2 mM L-PGDS, konsentrasjonen av SN-38 i PBS øket 1130 ganger sammenlignet med det i PBS. Kalorimetriske forsøk viste at L-PGDS bundet SN-38 på et molekylært forhold på 1: 3 med en dissosiasjonskonstant verdi på 60 uM. Resultatene av en
in vitro
veksthemmende analyse avslørte at SN-38 /L-PGDS komplekser viste høy antitumoraktivitet mot 3 humane kreftcellelinjer, det vil si, Colo201, MDA-MB-231, og PC-3 med en styrke lik den til SN-38 anvendt alene. Den intravenøse administrering av SN-38 /L-PGDS komplekser til mus som bærer Colo201 tumorer viste en markert anti-tumor effekt. Intestinal mukositt, noe som er en av bivirkningene av dette stoffet, ble ikke observert i mus administrert SN-38 /L-PGDS komplekser. Tatt sammen, muliggjør L-PGDS den direkte bruken av SN-38 med reduserte bivirkninger
relasjon:. Nakatsuji M, Inoue H, Kohno M, Saito M, Tsuge S, Shimizu S, et al. (2015) Menneskelig lipokalin-Type Prostaglandin D syntase-baserte Drug Delivery System for dårlig vannløselig Anti-Cancer Drug SN-38. PLoS ONE 10 (11): e0142206. doi: 10,1371 /journal.pone.0142206
Redaktør: Han-Chung Wu, Academia Sinica, TAIWAN
mottatt: 10 august 2015; Godkjent: 19 oktober 2015; Publisert: 03.11.2015
Copyright: © 2015 Nakatsuji et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Grants 25242046 (til TI) og 21200076 (til TI) fra Japan Society for Promotion of Science (http: //www .jsps.go.jp /engelsk /)
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
De fleste forbindelser som oppviser anti-tumor aktiviteter er kjent for å være vann-uløselig og for å ha alvorlige bivirkninger på normale vev og organer, og dermed begrense deres effekt og kliniske anvendelse av dem [1]. Noen vanlige fremgangsmåter for å forbedre oppløseligheten av anti-kreft legemidler er den kjemiske modifikasjon av medikamenter og bruken av oppløsningsmidler slik som organiske løsningsmidler, overflateaktive midler, lipider, syklodekstrin, og pH-modifiserende midler. Imidlertid er kjemisk modifikasjon av medikamenter reduserer deres styrke i mange tilfeller. Bruken av oppløsningsmidler er begrenset på grunn av deres toksisitet og tendens til å forårsake ustabilitet medikament. Således, medikamentavleveringssystemer (DDSS) for dårlig vannoppløselige anti-kreft medikamenter som gjør effektiv bruk av forskjellige typer av nano-størrelse levering kjøretøy slik som liposomer, miceller polymer, og dendrimerer, har blitt undersøkt intenst [2-5]. Disse etablert DDSS har imidlertid også støtt på noen problemer i forbindelse med toksisitet, immunogenisitet, hemolyse, og trombogenisitet [6, 7]. Det er derfor et stort behov for utvikling av en ny DDS for dårlig vannoppløselige anti-kreft medikamenter; og dermed mye innsats har blitt fokusert på å forbedre styrken, forbedre sikkerheten, og øker løseligheten av disse stoffene.
Vi har tidligere rapportert at en roman DDS bruker lipokalin-type prostaglandin D syntase (L-PGDS, fig 1A), et medlem av den lipokalin familien proteinet og et ikke-giftig og ikke-immunogent molekyl, kan rette farmasøytisk og klinisk utvikling av dårlig vannløselige forbindelser, så som diazepam og 6-nitro-7-sulfamoylbenzo [f] kinoksalin -2,3-dion, for bruk ved enten oral eller intravenøs administrering [8]. L-PGDS er et multi-funksjonelt protein som virker som en PGD
2-produserende enzym [9], en scavenger av reaktive oksygenarter [10], og en sekretorisk transportproteinet for flere små lipofile molekyler [11]. Videre har vi nylig rapportert at L-PGDS virker som et rensemiddel for biliverdin, hvis degradering produkter som er involvert i aneurysmal subaraknoidalblødning-indusert vasospasme og neuronal celledød [12]. L-PGDS har en typisk lipokalin fold som består av en åtte-strandet anti β-fat, og det indre av dette fatet danner en hydrofob hulrom [13-15] som kan binde et stort utvalg av lipofile ligander innenfor det [11, 16 ]
(A) Crystal struktur av menneskelig L-PGDS. (molekylvekt: 18777,7, PDB ID: 3O2Y). (B, C) Kjemiske strukturer av SN-38 (relativ molekylmasse: 392,4) og CPT-11 (relativ molekylvekt: 677,2)
SN-38, 7-etyl-10-hydroksy. -camptothecin (figur 1B) er en semi-syntetisk analog av anti-kreft alkaloid camptothecin som er rettet mot DNA-topoisomerase i [17]. Imidlertid, til tross for dens potente antitumoraktivitet, SN-38 ikke har vært brukt direkte i klinisk praksis på grunn av dets dårlige vannløselighet [18]. I tillegg laktonringen av SN-38 viser reversibel pH-avhengig hydrolyse, og ved pH under 5,0, SN-38 foreligger i en aktiv form med et tett laktonring i sin struktur, selv om det kan bli omdannet til en inaktiv karboksylert skjema ved fysiologisk pH-verdi ved åpning av ringen [19]. Således er det vanskelig å utnytte SN-38 i henhold til en fysiologisk tilstand. I motsetning til dette, irinotecan hydroklorid (CPT-11, figur 1C), som er et vannløselig prodrug av SN-38, anvendes i kombinasjon med fluorpyrimidiner som førstelinjeterapi for pasienter med langt fremskreden kolorektal kreft [20]. Imidlertid er kjemisk modifikasjon av SN-38 reduserer sin anti-tumor-aktivitet, som fører til 1000 ganger mindre cytotoksisk aktivitet av CPT-11 sammenlignet med den for SN-38 mot forskjellige kreftcellelinjer
in vitro product: [21 , 22]. Således kan den direkte bruk av SN-38 som en aktiv form ved hjelp av DDS være stor fordel for behandling av kreft.
Her har vi detalj utvikling av en DDS under anvendelse av human L-PGDS, en som muliggjorde den direkte bruken av SN-38. Vi undersøkte effekten av L-PGDS på oppløseligheten av SN-38, og undersøkt interaksjonen mellom L-PGDS og SN-38 ved hjelp av isotermisk titrering kalorimetri (ITC) og liten vinkel røntgen-spredning (SAXS). Den cytotoksiske aktivitet av SN-38 /L-PGDS kompleksene ble evaluert ved anvendelse av human kolorektal, bryst og prostata cancer-cellelinjer. Deres anti-tumor aktivitet ble undersøkt i Colo201 human kolorektal tumor xenograft modell. For å estimere bivirkninger av disse kompleksene, utførte vi histopatologisk analyse og målte uttrykket nivåer av inflammatoriske cytokiner i tynntarmen. Til slutt utførte vi anafylaksi-test for å evaluere den immunogene potens av L-PGDS. Resultatene til sammen demonstrert human L-PGDS å være et potent stoff levering kjøretøy for SN-38.
Materialer og metoder
Material
SN-38 ble kjøpt fra Tokyo Chemical Industry Co Ltd (Tokyo, Japan); og CPT-11, fra Yakult Honsha Co., Ltd (Tokyo, Japan).
Rensing av rekombinant human L-PGDS
C65A /C167A (ε
280 = 25 900 M
-1 cm
-1) -substituert L-PGDS ble uttrykt som en glutation
S
-transferase fusjonsprotein i
Escherichia coli
BL21 (DE3; Toyobo, Osaka, Japan) som tidligere beskrevet [16]. Fusjonsproteinet ble bundet til glutation Sepharose 4B (GE Healthcare Bio-Sciences, Little Chalfont, UK) og inkubert over natten med 165 enheter av trombin å frigjøre L-PGDS. Det rekombinante proteinet ble ytterligere renset ved gelfiltreringskromatografi med HiLoad 26/600 Superdex 75 (GE Healthcare Bio-Sciences) i 5 mM Tris-HCl-buffer (pH 8,0) og ble deretter dialysert mot fosfatbufret saltvann (PBS).
Løselighet målinger
Et overskytende beløp av SN-38 ble lagt inn i PBS buffer (pH 7,4). SN-38 /PBS-suspensjon ble pre-inkubert ved 37 ° C i 30 minutter, og deretter blandet med en L-PGDS løsning. Denne oppløsningen ble deretter omrørt ved 37 ° C i 6 timer og deretter konsentrert ved anvendelse av en Amicon ultra Centrifugal Filter enhet (Millipore Corporation, Bedford, MA). Absorpsjonsspekteret av filtratet ble oppnådd ved anvendelse av en 1,0 cm-lys-banen kvartskuvette og DU800 spektrometer (Beckman Coulter, Pasadena, CA). Konsentrasjonene av SN-38 ble bestemt spektroskopisk basert på den molare absorpsjonskoeffisienten av ε
380 i DMSO for SN-38 = 20 985 M
-1 cm
1.
Isoterm titrering kalorimetri (ITC) målinger
kalorimetrisk eksperimenter ble utført med en Microcal VP-ITC instrument (GE Healthcare Bio-fag), med prøven i PBS-buffer (pH 7,4) inneholdende 5% DMSO (v /v) ved 37 ° C. L-PGDS (840 pM) i injeksjonssprøyten ble revers-titrert inn i 50 mM SN-38 i cellen. Titrering eksperimenter besto av 50 injeksjoner fordelt på 300-sec intervaller. Injeksjonsvolumet var 2 eller 5 ul for hver injeksjon, og cellen ble kontinuerlig omrørt ved 286 rpm. Den tilsvarende varme av fortynning av L-PGDS titrert inn i bufferen ble brukt til å korrigere dataene. De termodynamiske parametere ble evaluert ved hjelp av en-sett av uavhengige bindingsseter modell som leveres av Microcal Origin 7.0.
Small-vinkel røntgen-spredning (SAXS) målinger
SN-38 /L-PGDS komplekser i PBS-buffer ble ført gjennom et filter for å fjerne de uløselige forbindelser. Proteinkonsentrasjonen av hver prøve ble justert til å passe SAXS eksperimenter (3,0 mg /ml til 12,0 mg /ml). SAXS data ble samlet på bjelken linje BL40B2 ved fjær 8 (den synkotronstrålingsanlegg, Hyogo, Japan), og alle eksperimentelle prosedyrene var de samme som tidligere beskrevet [23]. To-dimensjonalt innspilte spredningsmønstre ble omdannet til en-dimensjonale profiler ved sirkulær i snitt. Bidrag til spredning intensiteter fra løsningsmidlet ble eliminert fra rådata ved å subtrahere den intensitetskurve oppnådd for bufferoppløsningen. For å beregne rotasjonsradien for hvert protein ble spredningsprofilen analysert ved Guinier største tilnærming som er beskrevet i litteraturen og i våre tidligere rapport [23]. På hvert trinn, ble den interpartikulær innblanding og effekten av aggregering i prøven nøye eliminert.
Cell kultur
Menneskelig tykktarmskreft cellelinje Colo201 ble kjøpt fra Health Science Research Resources Bank (Osaka, Japan); og human brystcancer cellelinje MDA-MB-231, fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Menneskelig prostatakreft cellelinje PC-3 ble vennlig levert av professor R. Yamaji (Osaka Prefecture University, Osaka, Japan). Colo201 og PC-3-celler ble dyrket i RPMI 1640 (Wako, Osaka, Japan) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% Antibiotikum-Anti-fungal (Life Technologies, Carlsbad, CA), mens MDA-MB-231-celler ble dyrket i D-MEM (Wako) inneholder 10% FBS.
in vitro
veksthemmende analyse
effekten av SN-38 /L-PGDS komplekser, SN- 38, og CPT-11 på tumorcelleveksten ble undersøkt ved å utføre den WST-8-analyse (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan). Kolon adenokarsinom-avledede Colo201, bryst adenokarsinom-avledede MDA-MB-231, og prostata adenokarsinom-avledet PC-3-celler ble anvendt i denne analyse. Disse celler ble sådd i 96-brønns plater i tettheter på 5 x 10
3 celler /brønn til 8 x 10
3 celler /brønn. Etter en 24-timers dyrking ble cellene behandlet med forskjellige konsentrasjoner av SN-38 /L-PGDS komplekser, SN-38 eller CPT-11 i 48 timer, og deretter WST-8-løsning ble tilsatt til kulturmediet. Deretter ble cellene inkubert i 3 timer ved 37 ° C. Absorbansen av formazan som frembringes fra WST-8 ble målt ved 450 nm ved anvendelse av en mikroplateleser modell 680 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).
dyrestudie
Alle mus brukt i denne studien ble kjøpt fra Japan SLC Inc. (Shizuoka, Japan). Musene ble plassert på en 12-h /12-timers lys-mørke tidsplan med mat og vann tilgjengelig
ad libitum
for en uke å tillate utvinning fra stress for transport. Alle dyr eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av Osaka Prefecture Universitetet Animal Care og bruk Committee (Permit Number: 21-135). Alle operasjoner ble utført under isoflurananestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse.
In vivo
veksthemmende analyse
Fem uker gamle BALB /c naken mus ble injisert subkutant i høyre flanke med 5 x 10
6 Colo201-celler. Når tumorvolumet hadde nådd 150 mm
3, disse mus ble tilfeldig delt inn i 6 testgrupper. SN-38 /L-PGDS komplekser i en dose på 1,0, 2,0 eller 2,8 mg /kg /d, CPT-11 ved en dose på 4,0 eller 20 mg /kg /dag, eller PBS alene ble administrert intravenøst annenhver dag i 2 uker. Lengden (a) og bredden (b) av tumoren, og kroppsvekten ble målt hver dag, og tumorvolumet ble beregnet som 1/2 (a x b
2).
Patologiske studier på små tarmslimhinnen
PBS eller SN-38 /L-PGDS komplekser ved en dose på 2,8 mg /kg /dag, ble administrert intravenøst til 5 uker gamle ddY-hannmus ved den samme doseringsplan som de som benyttes i veksthemmende analyse
in vivo
. På dag 15 etter første administrasjon, ble musene avlivet; og deres tynntarmen ble så isolert. Prøvene ble fiksert i 10% formalin, dehydrert, og i parafin, etter hvilke deler av 5-mikrometer tykkelse ble utarbeidet og farget med hematoksylin-eosin.
Real-time RT-PCR-analyse
Total RNA ble ekstrahert fra tynntarmen ved hjelp av RNAiso Plus (Takara, Shiga, Japan) i henhold til produsentens protokoll. RNA ble revers-transkribert med reagensene av en PrimeScript RT reagenssett (Takara). Real-time PCR-analyse ble utført ved hjelp THUNDER
® qPCR Mix (Toyobo), og forsterkning ble overvåket med et termosykler Dice
® Real Time System II (Takara). Primere som brukes for denne analysen er oppført i S1 tabell.
Anafylaksi test
Seks uker gamle ddY mus ble sensibilisert med enten kylling ovalbumin (OVA, Sigma, Tokyo, Japan) eller L -PGDS. OVA (2 mg /ml) eller L-PGDS (2 mg /ml) ble suspendert i en ekvivalent mengde på 13 mg /ml aluminiumhydroksid (Sigma) som en adjuvant, og suspensjonen (100 pl) ble administrert subkutant i hver mus . Etter 14 dager, ble enten OVA eller L-PGDS (1 mg /ml) administrert intravenøst, og kroppstemperaturen ble deretter overvåket ved anvendelse av en thermofocus ikke-kontakt infrarødt termometer, THERMOFOCUS (TECNIMED srl, Varese, Italia).
Statistisk analyse
data ble analysert ved hjelp av Student
t
test når gruppene viste lik avvik (F test) eller med Welch prøve når de viste ulik avvik (F test). Resultatene ble vurdert signifikant på 5% signifikansnivå (
P
0,05). Alle statistiske tester var tosidig.
Resultater
Forbedring av løseligheten av SN-38 av L-PGDS
For å undersøke effekten av L-PGDS på løseligheten av SN-38, målte vi konsentrasjonen av SN-38 i PBS, med eller uten L-PGDS. SN-38 kan bli oppløst i PBS bare opp til 1,5 uM uten L-PGDS. Men når 2 mM L-PGDS ble tilsatt til PBS, løseligheten av SN-38 økes opp til 1700 um, som var 1130 ganger sammenlignet med det i PBS. I tillegg gjennomførte vi ITC og SaXs målinger for å undersøke nærmere binding modusen for SN-38 til L-PGDS. I ITC målinger, ved å titrere L-PGDS til SN-38, vi har oppdaget eksoterme reaksjoner, som indikerte gunstige entalpi endringer ved binding (figur 2A, øvre panel). Etter integrering hvert topparealet, er det integrerte varme erholdt for binding til SN-38 ble plottet mot den molare forholdet ([L-PGDS] /[SN-38]) (figur 2A, nedre panel). Bindingen isotermen ble montert ved hjelp av ett-stilt av uavhengige bindingsseter modell, og resultatene viste at L-PGDS dannet et 1: 3-komplekset med SN-38 med en dissosiasjonskonstant (
K
d ) verdien av SN-38 for L-PGDS på 60 ± 4,0 mikrometer. Verdiene av entalpiendring og entropi sikt for binding SN-38 til L-PGDS var -17 ± 0,13 og -8,5 ± 0,22 kJ /mol, henholdsvis. Disse resultatene viser at interaksjonen mellom L-PGDS og SN-38 var entalpi-drevet. Videre, i SAXS målinger, spredningsintensitetskurvene til L-PGDS og SN-38 /L-PGDS komplekser viste at L-PGDS og SN-38 /L-PGDS komplekser var monodisperse uten å vise noen aggregering opp til proteinkonsentrasjon på 640 uM (figur 2B). Disse kurvene var like, men tydeligvis annerledes bare i liten vinkel regionen (en gjensidig vektor (
S
) 0,02 Å
1, figur 2b, innfelt). Verdiene av treghetsradius av L-PGDS og SN-38 /L-PGDS kompleks ble beregnet til å være 18,1 ± 0,09 og 16,5 ± 0,20 Å, respektivt. Disse resultatene viste at strukturen av L-PGDS krympet når proteinet er bundet SN-38.
(A) Kalorimetrisk titrering av SN-38 med L-PGDS. L-PGDS i injeksjonssprøyten ble omvendt titrert til SN-38 i cellen. Øvre felt viser endringen i varmen over tid som L-PGDS ble titrert til SN-38. Det nedre panel viser den normaliserte endringen i varmen etter å subtrahere referansedata for l-PGDS injeksjoner inn i PBS. Den ene sett av uavhengige bindingsseter modellen ble brukt for å passe bindings isotermer. (B) SaXs profiler av L-PGDS (rød linje) og SN-38 /L-PGDS kompleks (blå linje). Disse profiler ble oppnådd ved å ekstrapolere alle data ved forskjellige konsentrasjoner (12, 9,0, 6,0, og 3,0 mg /ml) til null konsentrasjon. Logaritmen av spredningsintensitet er vist som en funksjon av den resiproke vektor (
S
). Det innfelte viser logaritmen av spredning intensitet i den lille
S
regionen.
In vitro
veksthemmende analyse
For å undersøke den hemmende effekten av SN-38 /L-PGDS komplekset på cellevekst
in vitro
, målte vi den anti-tumor aktivitet av SN-38 /L-PGDS komplekser mot 3 humane kreftcellelinjer, Colo201, MDA-MB-231, og PC-3, ved å utføre WST-8-analyser. SN-38 /L-PGDS komplekser, SN-38, og CPT-11 ble separat oppløst i PBS og fortynnet med kulturmedium til de passende konsentrasjonene. Alle prøver redusert cellelevedyktighet alle tre cancercellelinjer i en konsentrasjonsavhengig måte (fig 3). Den beregnede IC
50 verdier er oppsummert i tabell 1. Den IC
50 verdier av SN-38 /L-PGDS komplekser på veksten av Colo201, MDA-MB-231, og PC-3-celler var 35 ± 6,5, 900 ± 190 og 10 ± 1,5 nM, noe som indikerer at komplekset var mest potente mot PC-3-celler. I kontrast til de av CPT-11 på veksten av Colo201, MDA-MB-231, og PC-3-celler var 26 ± 4,1, 35 ± 5,2 og 9,8 ± 0,75 uM, respektivt. Således er de hemmende effektene av disse SN-38 /L-PGDS komplekser på celleveksten var 39- til 980-ganger mer potent enn de av CPT-11. I tillegg IC
50 verdier av SN-38 for inhibering av veksten av Colo201 og PC-3-celler var 15 ± 0,66, 18 ± 2,4 nM, respektivt, i likhet med de av SN-38 /L-PGDS kompleks. Således, SN-38 viste høy cytotoksisk aktivitet når det var mulig å bli oppløst i vann. I tilfelle av MDA-MB-231-celler, SN-38 ved en uM, sin maksimale konsentrasjon i PBS, redusert cellelevedyktighet bare til omtrent 80%, og således IC
50 verdi av SN-38 kan ikke bli oppnådd (figur 3B). Disse resultatene viste at SN-38 /L-PGDS Komplekset hadde et medikament potens sammenlignes med SN-38 alene.
Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SE. (
n
= 6).
In vivo
veksthemmende analyse
Vi har evaluert anti-tumor aktivitet av SN-38 /L-PGDS komplekser i mus med Colo201 svulster. Figur 4A viser effekten av intravenøs administrering av SN-38 /L-PGDS komplekser på tumoren i BALB /c nakne mus med tumor i sin høyre flanke. PBS-administrerte gruppen viste en progressiv økning i tumorvolum, og nådde 572 ± 62,8 mm
3 på dag 15 etter første administrasjon av PBS. I CPT-11-administrert gruppe (4,0 mg /kg /d), økte tumorvolumet raskt i en dag-avhengig måte og nådde 555 ± 31,3 mm
3 på dag 15 etter første administrasjon av CPT-11, viser ingen anti-tumor-aktivitet. Dette mønsteret av dagen avhengig økning var lik den som er for de PBS-behandlede mus anvendt som en kontroll. I motsetning til dette, selv om tumorvekst i mus behandlet med en høy dose av CPT-11 (20 mg /kg /dag) var nesten den samme som den som ble observert i PBS-behandlede mus ved dag 6 etter den første administrering, veksten var etterpå hemmet. Tumorvolumet var signifikant forskjellig fra den for den PBS-administrert gruppe etter dag 11, og nådde 231 ± 36,5 mm
3, som er 40,4% av det i PBS-administrert gruppe på dag 15 etter den første administrering. På den annen side, selv om tumorvekst i mus behandlet med SN-38 /L-PGDS komplekser i en dose på 1,0 mg /kg /d var også omtrent den samme som den som ble observert i PBS eller CPT-11-behandlede mus etter dag 4 etter første administrasjon, veksten etterpå ble hemmet. Tumorvolumet var signifikant forskjellig fra den for den PBS-administrert gruppe etter dag 11, og nådde 301 ± 37,9 mm
3, som er 52,6% av det i PBS-administrert gruppe på dag 15 etter den første administrering. I tillegg, i de mus som var behandlet med SN-38 /L-PGDS komplekser i en dose på 2,0 mg /kg /d (som er en ekvimolar dose av CPT-11 i en dose på 4,0 mg /kg /d) eller ved 2,8 , tumor regresjon ble observert mg /kg /dag etter dag 4. dag 8. etter, tumorvolumet av de musene som ble behandlet med SN-38 /L-PGDS komplekser i en dose på 2,0 mg /kg /dag eller 2,8 mg /kg /d var betydelig lavere enn det man ser i PBS administrerte gruppe, og nådde 249 ± 19,9 212 ± 36,9 mm
3, respektivt, som var 43,5 og 37,1%, henholdsvis av det i PBS administrert gruppe på dag 15 etter første administrasjon. Således, SN-38 /L-PGDS kompleks viste signifikant og doseavhengig antitumoraktivitet. I SN-38-administrert gruppe (0,0029 mg /kg /d; sin maksimale konsentrasjon i PBS), derimot, tumorvolumet økes i en dag avhengig måte med tumorvekst lik den som er i PBS eller CPT-11 administrert gruppen (4,0 mg /kg /d) og nådde 536 ± 79,6 mm
3 på dag 15 etter første administrasjon (data ikke vist). Disse resultatene viste at SN-38 /PBS-løsning hadde noen vesentlig antitumoraktivitet
in vivo
. Videre, for å evaluere bivirkninger av SN-38 /L-PGDS kompleks, vi registrert kroppsvekt av musene daglig i løpet av behandlingen (figur 4B). I PBS-administrerte gruppen ble kroppsvektendring ikke observert. I CPT-11-administrert gruppe (20 mg /kg /d), ble imidlertid observert kroppen vekttap, og ikke komme seg til normalt nivå på day15 etter første administrasjon. På den annen side, i SN-38 /L-PGDS komplekser administrerte grupper var den signifikant kroppsvekttap ble ikke observert i løpet av 15 dager etter administreringen. Disse resultater, sett under ett, foreslår at intravenøs administrering av SN-38 /L-PGDS komplekser med en lav dose viste høyere antitumoraktivitet enn CPT-11.
(A) Tumor-volumer av PBS, CPT-11-, og SN-38 /L-PGDS kompleks administrert grupper. Colo201-celler ble inokulert subkutant inn i høyre flanke av mus. PBS, CPT-11 ved en dose på 4,0 eller 20 mg /kg /dag, eller SN-38 /L-PGDS-komplekser i en dose på 1,0, 2,0 eller 2,8 mg /kg /dag ble administrert intravenøst en gang annenhver dag i 2 uker. *
P
0,05, **
P
0,01 sammenlignet med PBS. (B) Endring i kroppsvekt hos mus etter hver behandling. *
P
0,05, **
P
0,01 sammenlignet med PBS. Feilstolpene av SN-38 /L-PGDS kompleks administrerte gruppe ved en dose på 2,8 mg /kg /d er uttrykt som gjennomsnitt ± SE av 4 uavhengige eksperimenter; og de av de andre, som gjennomsnitt ± SE fra 6 uavhengige eksperimenter.
Evaluering av intestinal toksisitet av SN-38 /L-PGDS kompleks
Det er vel kjent at en av de viktigste kliniske bivirkninger av CPT-11 er alvorlig diaré [24, 25]. Flere rapporter har vist at administrering av CPT-11 induserer intestinale mukositt kjennetegnet ved tap av krypten arkitektur og produksjonen av inflammatoriske cytokiner [26, 27]. Således undersøkte vi ved histopatologisk analyse og måling av uttrykket nivåer av forskjellige inflammatoriske cytokiner i tynntarmen hvorvidt eller ikke disse bivirkningene av CPT-11 ble manifestert av SN-38 /L-PGDS kompleks (fig 5). Musene administreres intravenøst SN-38 /L-PGDS komplekser i en dose på 2,8 mg /kg /d ved hjelp av den samme doseringsplan som anvendt for veksthemmende analyse viste ingen diaré. De histologiske observasjoner av tarmslimhinnen påvist bevaring av villi og krypten arkitektur, som var lik den som er sett i PBS-administrerte gruppe (figur 5A), og således indikerer at SN-38 /L-PGDS kompleks induserte ikke tarm lesjoner. I tillegg er uttrykket nivåer av interleukin-6 (IL-6) og interleukin-1β (IL-1β) i tarmen hos mus administrert SN-38 /L-PGDS komplekser var uforandret sammenlignet med de for mus administrert PBS ( 1.3- og 1.0-ganger i henholdsvis, fig 5B). På den annen side, i tarmen hos mus administrert lipopolysakkarid, som en positiv kontroll, oppregulering av IL-6 og IL-1β ble observert (data ikke vist). Dermed disse resultatene viste at administrasjonen av SN-38 /L-PGDS kompleks ikke viste noen bivirkninger som for eksempel tarm mukositt.
(A) Histologi av ileal slimhinnen. Inset viser villi arkitektur. Scale bar representerer 100 mikrometer. Det venstre panelet viser ileal slimhinnene musene administrert SN-38 /L-PGDS komplekser; og den rette, at av musene administrert PBS. Den ileal slimhinnene i begge grupper var nesten det samme. (B) Expression nivåer av inflammatoriske cytokiner i ileal mucosa. Hver søyle representerer gjennomsnittlig ± SD (
n
= 3).
Evaluering av immunogen styrken til humane L-PGDS
Til slutt, vi vurdert at om menneskelig L-PGDS var immunogen eller ikke for mus (fig 6). kroppstemperatur fra OVA-sensibiliserte mus den etter den intravenøse administrering av OVA raskt falt. Denne reduksjonen i kroppstemperatur ikke komme i opp til 60 minutter etter administreringen. På den annen side, kroppstemperaturen til menneske L-PGDS-sensibiliserte mus etter intravenøs administrering av humant L-PGDS ikke reduseres. Resultatene viste at L-PGDS ikke forårsake noen anafylaksi responser i disse musene.
Endring i kroppstemperatur på mus. Mus ble sensibilisert med OVA eller L-PGDS, og deretter utfordret med OVA (○) eller L-PGDS (●). Kroppstemperaturen ble målt i 60 min. Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± SE av 6 uavhengige eksperimenter.
Diskusjoner
I denne studien viste vi muligheten for å bruke menneskelige L-PGDS som en roman stoffet levering kjøretøy for SN-38, et lite vannløselige anti-kreft legemiddel. Oppløselighetsegenskapene Målingene viste at konsentrasjonen av SN-38 ble betydelig forbedret i nærvær av L-PGDS. Videre er resultatene av
in vitro
veksthemmende analyse avslørte at SN-38 /L-PGDS komplekset viste en potent antitumoraktivitet, og at den komplekse formuleringen ikke påvirke medikamentet potens av SN-38 . I tillegg funnene fra
in vivo
eksperimenter viste at intravenøs administrasjon av SN-38 /L-PGDS komplekser resulterte i en uttalt anti-tumor aktivitet uten de typiske bivirkninger av SN-38 som intestinal mukositt. Disse resultatene viste at komplekset formuleringen ved bruk av humant L-PGDS nå gjør det mulig å bruke SN-38 for behandling av kreft.
SN-38 har en effektiv anti-kreft-aktivitet mot forskjellige kreftcellelinjer så som kolorektal, lunge, bukspyttkjertel og ovariecancer celle [21, 22], men det har ikke vært benyttet klinisk på grunn av dets dårlige løselighet i vann, og farmasøytisk akseptable løsningsmidler slik som etanol. Selv om CPT-11, et vannløselig prodrug av SN-38, alternativt brukes for behandling av kolorektal cancer, er den metabolske konverteringsfrekvens under 10% og er avhengig av genetisk variasjon i form av karboksylesterase aktivitet [28, 29]. Derfor er administrering av en høy dose CPT-11 er nødvendig for å oppnå den forventede terapeutiske virkning (figur 4A) [30]. Imidlertid er multippel dosering med en stor mengde av CPT-11 begrenset som følge av de alvorlige bivirkninger. Den dosebegrensende toksisitet av CPT-11 administrering er vel kjent for å resultere i tarm mukositt er kjennetegnet ved alvorlig diaré [24, 25]. I foreliggende studie viste vi at intravenøs administrering av SN-38 /L-PGDS komplekser med en lav dose viste en markant antitumoraktivitet sammenlignet med det av CPT-11 (figur 4A). I tillegg har histologiske analyser viste at tarmslimhinnen hos mus behandlet med SN-38 /L-PGDS komplekser i en dose på 2,8 mg /kg /d ikke viste forkortet villi eller tap av krypten arkitektur (figur 5A), som er ett av tegnene på tarm mukositt. Videre mRNA-nivåene av inflammatoriske cytokiner som IL-6 og IL-1β i tarmen hos mus administrert SN-38 /L-PGDS komplekser var lik dem fra mus injisert med PBS (figur 5B). Således har vi demonstrert at den direkte bruk av SN-38 som et kompleks med L-PGDS viste en anti-tumoraktivitet uten å fremkalle uønskede bivirkninger, slik som intestinale mukositt.
Hittil har ulike tilnærminger til å solubilisere SN- 38 Det er rapportert, f.eks, ved hjelp av makromolekylære prodrugs og nanomedisin formuleringer slik som liposomer og polymere micellene [18]. Men disse fremgangsmåter involverer multiple og kompliserte reaksjoner; og anvendelsen av toksiske organiske løsningsmidler er nødvendig. For eksempel er EZN-2208, et vannoppløselige makromolekylære prodrug av SN-38, produsert av kompliserte trinn, blant annet over natten reaksjoner [31]. Et klorin-kjerne stjerneformet blokk-kopolymer micelle, som er en nano-størrelse fotosensibiliserende middel med evne til å innkapsle SN-38, ble fremstilt ved anvendelse av en lyofilisering-hydrering metoden [32]. Imidlertid er denne lyofiliseringsprosessen tidkrevende; og dessuten krever denne fremgangsmåte anvendelse av organisk oppløsningsmiddel så som dimetylsulfoksyd. Således toksisitet av gjenværende organiske oppløsningsmidler bør være av interesse. I vårt tilfelle er imidlertid utformingen av SN-38 /L-PGDS komplekser kan oppnås ved en enkel reaksjon, det vil si, bare en blanding av SN-38 suspensjon med L-PGDS oppløsning uten noe organisk oppløsningsmiddel. Videre har vi også vist at den faste orale formuleringen av dårlig vannoppløselige medikament /L-PGDS komplekset kan ganske enkelt oppnås ved hjelp av en spraytørkingsteknikken [33]. Derfor legemiddelformulering bruker L-PGDS har en stor fordel når det gjelder forberedelse tid og sikkerhet.
